文摘

当奶牛暴露在高温环境中,他们的抗氧化能力和生产性能下降,导致经济损失。证据表明硒(Se)可以有效地缓解热应激奶牛;然而,细胞保护机制还不清楚。本研究的目的是调查和比较无机硒的保护作用(亚硒酸钠,SS)和有机硒(亚硒酸蛋氨酸,SM) MAC-T(乳腺肺泡细胞大小的T抗原,牛乳腺上皮细胞(BMEC)线)细胞在热应力。MAC-T细胞治疗在4方面另有描述:(i)热处理(HT)组织细胞培养为42.5°C 1 h,然后恢复37°C 12 h;(2)SM组使用有机Se 2 h,培养为42.5°C 1 h,然后恢复37°C 12 h;(3)SS组治疗类似于SM组除了细胞使用无机Se代替有机硒;及(iv)对照组在37°C和不断培养没有收到Se治疗。结果表明,热休克为42.5°C 1 h引发热休克反应,破坏了氧化还原平衡,并减少在MAC-T细胞细胞生存能力;和预处理细胞与SM或学生有效地缓解负面影响的热休克细胞。 However, the cells were much more sensitive to SS treatment but more tolerant to SM. In addition, two forms of Se appeared to affect the expression of different genes, including nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) and inducible nitric oxide synthase (iNOS) in the SM group and thioredoxin reductase 1 (TXNRD1) in the SS group in Nrf2-ARE (antioxidant response element) antioxidant pathway and inflammation response. In summary, results showed the mechanistic differences in the protective effects of organic and inorganic Se on heat stress in BMECs.

1。介绍

随着全球变暖越来越严重,环境温度上升的速度在最近十年(1]。与此同时,有超过58%的奶牛生活在热带和亚热带区域的面积,温度湿度指数(THI)经常达到68多,导致奶牛热应激(2]。热应力诱发氧化应激和炎症,增加健康问题的风险,减少牛奶产量(3]。因此,它是至关重要的,探索有效的方法来缓解痛苦的奶牛热应激,减少经济损失。

硒(Se)是一个重要的矿物质营养,及其在动物缺乏是一个全球性的问题易受各种疾病和降低生产性能(4]。此外,Se可以有效地缓解应激损伤细胞。IPEC-J2细胞表明,热应力诱导10 selenoprotein-related基因的表达来发挥重要作用在抗氧化作用促进过氧化氢代谢和调节细胞的压力水平5,6]。此外,Se可以配合免疫反应产生炎症相关的酶来杀死病原体(7]。由于这些有益的影响,各种形式的Se用作饲料添加剂在动物生产在许多国家(8]。有两个来源的Se添加剂、有机和无机。一些研究表明,有机硒比无机硒的毒性较小(9]。selenized酵母的使用,有机硒的来源,显著增加牛奶硒浓度与无机硒(10),但从经济角度看,无机硒更有利。

研究表明,硒是在实践中有效地缓解热应力11),但具体机制尚不清楚,特别是牛乳腺上皮细胞(BMECs)。因此,本研究的目的是确定的功能和影响有机Se(亚硒酸蛋氨酸,SM)和无机硒(亚硒酸钠,SS)在BMECs抗氧化和抗炎。

2。材料和方法

2.1。细胞培养和治疗

MAC-T (BMEC线)在杜尔贝科修改鹰的培养基培养细胞(DMEM)补充10%胎牛血清的边后卫,100 U /毫升青霉素G和100μg / mL链霉素(Gibco实验室、大岛,纽约,美国)在37°C(湿润孵化器12]。细胞治疗在4方面另有描述:(i)热处理(HT)组织细胞培养为42.5°C 1 h,然后恢复37°C 12 h;(2)SM组使用不同浓度(0、0.1、0.5、1、2、5、10、20、50和100μ米)的SM(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)2 h,其次是培养为42.5°C 1 h,然后恢复37°C 12 h;(3)SS组治疗类似于SM组除了细胞使用SS(σ)而不是有机硒;及(iv)对照组在37°C和不断培养没有收到Se治疗。

2.2。细胞生存能力分析

细胞生存能力分析都使用了CCK-8工具包(Beyotime、南京、中国)根据制造商的指示。MAC-T细胞( )被播种到96 -文化板块。细胞后使用或没有不同浓度的SM或党卫军2 h,他们治疗1 h为42.5°C,然后培养不同时间的37°C。然后他们被孵化有10%在37°C 2 h CCK-8测量OD在450 nm标(MD、钙、美国)。

2.3。细胞内活性氧的检测

MAC-T细胞( )治疗后与10个处理μM dichloro-dihydro-fluorescein二乙酸(DCFH-DA;σ)6-well板块在37°C为30分钟。他们resuspended磷酸盐(PBS)使用流式细胞仪和荧光分析。fluorescence-positive细胞的百分比被记录在FACSCalibur流式细胞分析仪(美国BD生物科学,圣地亚哥,CA)使用488和530海里的激发和发射过滤器,分别。

2.4。检测细胞凋亡和坏死

细胞凋亡和坏死与膜联蛋白检测V-FITC /π凋亡检测设备(BD生物科学)。细胞治疗后收获、resuspended和稀释的密度 。标签根据制造商的协议后,细胞颗粒状和分析使用激励与流式细胞术对488 nm的过滤器。绿色荧光的发射过滤膜联蛋白V-FITC和红色荧光的π525 nm和595 nm,分别。结果分析了膜联蛋白的百分比V-FITC⁺/π^{- - - - - -}细胞通过CellQuest软件(BD,富兰克林湖,新泽西,美国)。

2.5。总抗氧化能力、超氧化物歧化酶的测量

细胞被播种在6-well文化板块和治疗。他们收获和细胞溶解在冰冷的PBS声波降解法,其次是在15000 g离心10分钟在4°C。的上层清液被随后的决心。总抗氧化能力(T-AOC)检测使用总抗氧化能力测定工具包(Beyotime)与abt方法(13]在制造商的协议。abt股票流动性准备前至少12到16小时在室温下使用和存储在没有光的情况。在200年稀释到适当的浓度μL (abt工作液添加到上层的96年文化板块。混合和反应2 - 6分钟后,样本为734 nm的OD标(MD)。样品的T-AOC从标准曲线计算。使用总超氧化物歧化酶(SOD)检测超氧化物歧化酶分析工具包(Beyotime) WST-8方法。短暂,WST-8 /启动酶工作液和反应试剂(准备新鲜)被添加到96年-文化板块。混合和反应30分钟后在37°C,样本为450 nm的OD微型板块阅读器(MD)。

2.6。RNA分离和定量实时PCR (qPCR)

根据制造商的总RNA提取程序RNA净化设备(Aidlab生物技术有限公司、北京、中国)。总RNA 800 ng是反向转录cDNA使用PrimeScript RT试剂(豆类、东京、日本)和稀释1:5进行进一步的实验。QPCR在7500 c进行实时PCR检测系统(美国应用生物系统公司,卡尔斯巴德,加州)使用SYBR预混料Taq交货(豆类)如前所述14]。GAPDH、RPS9 UXT被用作其他基因正常化看家基因的表达。引物设计使用国家生物技术信息中心(NCBI) Primer-BLAST和列在表中1。2^−ΔΔCt方法(15mRNA)是用来计算的相对丰度。

2.7。免疫印迹分析

细胞治疗后细胞溶解在200年冰通过添加μL•瑞帕缓冲区包含10毫米PMSF和刮到1.5毫升埃普多夫管离心(12000克在4°C)为5分钟。蛋白质浓度测定BCA量化工具(Beyotime)。2 ng /溶解产物被稀释μL利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)加载缓冲区和sds - page分离。然后,蛋白质从凝胶转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美国微孔)。膜被5%牛奶1 h在4°C下搅拌然后孵化主要抗体Nrf2(核转录因子红细胞两个相关因子2,1:1000;Abcam、剑桥、马、美国),TXNRD1(硫氧还蛋白还原酶1,1:2000;Abcam), IKBα(1:1000;Abcam), IKBα(磷S36) (1: 10000;Abcam),β肌动蛋白(1:1000;中国武汉博士德)在一夜之间在4°C。HRP-conjugated山羊anti-rabbit免疫球蛋白或山羊anti-mouse免疫球蛋白抗体(博士德)被用作二次抗体。与二次抗体膜被孵化2 h风潮。最后,免疫印迹结果量化使用ImagePro + 6.0软件(媒体控制论,华盛顿,医学博士,美国)。

2.8。统计分析

数据了 偏差的意思是三个独立的实验。正态分布数据的平均值之间的差异进行评估与单向方差分析(方差分析)其次是图基的多个多重比较和学生的比较试验 - - - - - -测试比较两组。 被接受为显著。所有统计测试进行了使用GraphPad棱镜软件6.0版本(GraphPad软件公司,拉霍亚,CA,美国)。

3所示。结果

3.1。Se获救的热触觉细胞生存能力下降

MAC-T细胞热休克处理,其次是复苏37°C增加时间段,显示逐渐减少细胞生存能力在12 h(图1(一))。细胞的生存能力是70%在12 h(恢复时间在24小时但几乎完全恢复。当细胞接受0.1 -100人μM SM或党卫军2 h正常中等12 h,其次是培养细胞生存能力增加在低浓度(0.1 - 2μM SM和0.1 - -0.5μM SS)但是在高浓度(50 - 100年有所下降μM SM和5 - 100μM SS)(图1 (b))。此外,当细胞使用0.1 -100μM SM或SS,其次是热休克和恢复12 h,热触觉细胞生存能力下降是由2 - 100部分获救的μM SM或0.1 - 2μM SS预处理(图1 (c))。此外,细胞生存能力进一步下降,高浓度(10 - 100μ米)党卫军。SM和SS的存在剂量依赖的相关性影响几乎在逆关系(图1 (c))。预处理的细胞与10μM SM或1μM SS显示细胞生存能力的最佳救援(分别为83.1%和81.4%),因此被用于以下实验。

3.2。Se缓解热触觉细胞凋亡和坏死

MAC-T细胞热休克处理细胞凋亡和坏死率增加了1.44和1.38倍,分别(图2(一个))。然而,细胞治疗10μM SM或1μM SS热休克前明显减轻热触觉细胞凋亡和坏死(图2(一个))。此外,预处理和Se显著降低mRNA大量的伯灵顿(Bcl-2-associated X蛋白),proapoptosis标记,并增加mRNA大量BCL2 (b细胞lymphoma-2),一个antiapoptosis标记(图2 (b)),导致减少的比率伯灵顿和BCL2细胞(图2 (c))。

3.3。Se减少热量触觉增加热休克反应

热休克反应(高铁)是由高温引起的治疗在MAC-T细胞所示mRNA的大幅增加大量的热休克因子1 (HSF1)和热休克蛋白90(一半)在图3。HSF1的反应降低了细胞的预处理与10μM SM或1μM SS,而一半增幅下降了预处理细胞与SM(图3)。

3.4。改进的热触觉抗氧化能力下降

如图4(一)ROS水平(活性氧)增加热休克MAC-T细胞后,细胞的预处理和10μM SM或1μM SS shock-treated细胞显著降低ROS增加热量。此外,信使rna大量HO-1(血红素加氧酶1)增加HT组与对照组相比,但增加部分被SM和SS预处理(图4 (b))。mRNA的SOD和T-AOC减少细胞处理高温时,SM和SS预处理改善这些下降(图4 (c))。此外,蛋白质含量Nrf2和TXNRD1增加热休克治疗,但增加抑制了SM或SS预处理(图4 (e))。看来SM预处理的影响更多Nrf2表达式,而SS的影响往往更加抑制TXNRD1的蛋白质水平(数字4 (d)和4 (e))。

3.5。Se减少了热休克对炎症的影响

我的蛋白质水平κBα(图5(一个)信使rna)和大量的炎性细胞因子和标记,如诱导一氧化氮合酶(间接宾语;图5 (b))、白细胞介素- 10”(il - 10;图5 (c))、单核细胞化学引诱物蛋白(MCP;图5 (d))和interleukin-8(引发;图5 (e)),在MAC-T都增加了热休克细胞(图5)。然而,这些大多是增加扭转SM或SS预处理。具体来说,SM抑制mRNA大量伊诺显著(图5 (b)),而学生没有显著的影响。

4所示。讨论

高环境温度变化不仅奶牛的行为,如不适,气喘吁吁,挫折,和侵略,还生物功能和健康状况导致牛奶产量下降和发情周期延迟16]。但在奶牛热应激的具体机制尚不清楚。我们的研究表明,热休克治疗BMECs 42.5°C 1 h在12 h细胞生存能力降低了30%,这至少是减少部分引起的细胞凋亡和坏死率增加。伯灵顿/ BCL2这些细胞的比率也证实了效果。这个观察与早期的研究一致17]。

高产奶牛的困境更容易受到环境温度能优先找到有效的方法来减少热应力在牛18]。虽然球迷,洒、水和冷却的水被用于奶牛场缓解热应力,研究人员在热应激对奶牛的影响越来越关注发展中使用补充膳食添加剂的方法,例如,Se (19,20.),以缓解奶牛的高热赔偿。Se的保护作用对氧化应激在奶牛21]。作为一种常见的抗氧化剂微量元素,本身也有抗炎、抗癌和小菜吧函数(22]。添加Se表明增加乳腺癌的抗炎性疾病(23]。Se包括有机和无机形式。据我们所知,到目前为止没有任何研究调查他们的抵抗热应力差异的分子机制。

目前的研究发现,预处理MAC-T细胞与SM或学生本身对细胞生存的影响显著的剂量依赖性的方式。MAC-T细胞更敏感的浓度比SM党卫军。一些研究表明,有机硒具有较高的生物利用度和更环保和更少的有毒动物比无机硒(9,24,25]。一项研究表明,牛和补充有机硒浓度较高的Se全血和牛奶比牛无机硒补充(10]。这种差异可能是由于不同的吸收机制的两种形式的Se gastrointestine。金和马汉9]表明,膳食有机和无机硒毒性当Se的浓度在growing-finishing猪超过5 ppm,但随后硒中毒早些时候更糟,如果学生被用作Se来源。一直,在这项研究中,预处理的细胞与SM或党卫军也部分获救后MAC-T的细胞生存能力下降42.5°C休克1 h剂量依赖性的方式。热休克后的细胞生存能力显著提高在低浓度的党卫军(0.1 - 2μ米)但在SM(≥2的浓度更高μ米)。

研究表明,细胞更易发生凋亡时遭受热应力(26]。在这项研究中,提高细胞生存能力后热休克预处理通过SM和党卫军也支持的减少细胞凋亡和坏死率,减少比例的伯灵顿/ BCL2,两个主要的细胞凋亡调节蛋白。Se的保护作用在MAC-T细胞中热应力的研究结果是一致的Khera et al。27在滋养层细胞和Ganesan et al。28在肌肉细胞。

HSP的主要功能(热休克蛋白)是抵抗压力对细胞的影响29日]。HSF1逆境应答基因的诱导表达,而一半是一种主要的防御蛋白对热应力(30.,31日]。在正常情况下,HSF1结合HSP(通常是一半)。当机体或细胞受到刺激时,HSP HSF1分开。HSF1然后进入细胞核,诱发元素下游热休克基因的表达(1]。我们的研究表明,有一个引人注目的增加MAC-T一半寿命HSF1基因表达和细胞热休克和Se预处理后逆转的影响。研究结果支持先前的观察,缺硒的热休克蛋白水平增加鸡肝(32和一半的鸡红细胞的表达33]。

研究发现,热应力可以增强活性氧的生产然后打扰氧化还原平衡的体内平衡,导致细胞氧化应激(34]。此外,热应力改变IPEC-J2细胞中硒蛋白基因的表达(5),这可能会进一步导致细胞的热应力。研究还发现,Se可以增加谷胱甘肽过氧化物酶活动的补充和提高抗氧化能力的系统在泌乳奶牛35]。我们的研究证实,氧化应激在MAC-T细胞热休克后增加活性氧的生产和降低SOD和T-AOC活动。我们的研究也显示Se预处理MAC-T细胞的抗氧化效果。硒的抗氧化作用可能是由于它的存在在氧化还原系统相关的酶,如谷胱甘肽过氧化物酶(氧化酶)。此外,热休克和Se预处理HO-1的表达的影响。内源性一氧化碳生成HO-1 Akt / PKB(蛋白激酶B),对GSK-3 Akt有负面影响β(糖原合成酶激酶3β),激活Nrf2 [36]。因此,Se的影响也可以从其影响结果的表达Nrf2,大师转录因子调节抗氧化蛋白的表达。先前的研究表明,在细胞内Nrf2 epigallocatechin-3-gallate水平的影响被Se-optimal老鼠(37]。在氧化应激,Nrf2停止的泛素化。Nrf2把原子核和结合抗氧化反应的元素,最终激活防御系统(38]。TXNRD1,一个细胞内的硒蛋白,是一种同工酶提供了活性氧的主要酶促防御系统在血管内皮细胞(39]。在这项研究中,我们发现,两种形式的Se往往在Nrf2-antioxidant通路激活不同的基因。SM预处理抑制Nrf2的表达,而学生倾向于减少TXNRD1的蛋白质水平。

氧化应激与炎症(40]。通常是由细胞因子介导的炎症的出现。il - 10在免疫调节和炎症多效性的影响。它阻挡NF -的活性κ核因子B (kappa-B)和参与的规定JAK-STAT (Janus kinase-signal换能器和转录激活)信号通路(41]。大量的NO(一氧化氮)是由伊诺在刺激。高输出的感应伊诺通常发生在氧化环境中这样高水平的没有有机会与过氧化物反应,导致过氧亚硝基形成和细胞毒性42]。在这项研究中,我们发现热休克诱导炎症如mRNA增加大量的标记和细胞因子、炎症和Se预处理可以抑制感应。SM预处理监管伊诺突出,而对伊诺党卫军没有显著影响。

5。结论

SM和党卫军是两个Se膳食添加剂常用的奶牛场。然而,他们的浓度和对彼此的牛奶产量不同的影响。目前的研究表明,SM和SS MAC-T可以缓解热应力损伤的细胞。具体来说,SM和SS可以调节通过不同的酶和细胞因子抗氧化和免疫反应。有机硒显示更多影响一个上游的目标(Nrf2)氧化应激和伊诺炎症,而无机Se行动更低流目标(TXNRD1)上。本研究表明,不同的目标基因在两种形式的氧化应激和炎症Se首次在细胞水平上。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

所有的作者宣称他们没有利益冲突。

作者的贡献

一轩邹和Juanjuan邵同样做出了贡献,这项工作。

确认

这项研究支持由中国国家自然科学基金(31672447)和中国国家重点研发项目(2018 yfd0501600)。