文摘
富含血小板血浆(PRP)已成长为一个有吸引力的生物仪器在再生医学治疗的属性。它被认为是一种生长因子,可能诱发组织修复和改善肝纤维化。本产品在多个研究已经证明它的效力,但其影响cisplatin-induced肾毒性尚未阐明。目前的调查进行估计的保护影响富含血小板血浆对顺铂- (CP)在雄性小鼠诱发肾毒性。肾毒性是正确诱导的雄性Wistar鼠uninephrectomy CP管理紧随其后。Uninephrectomized老鼠分为四组:对照组(1),(2)PRP组,(3)CP组和(4)CP + PRP组。PRP是由肾被膜下的注入。肾功能、炎性细胞因子和生长因子水平以及组织病理学进行了调查。PRP治疗减毒的严重性CP-induced肾毒性就是明证抑制肌酐、血尿素氮(BUN)、n -乙酰glucosaminidase(唠叨)水平。此外,PRP抑郁细胞间粘附molecule-1 (ICAM-1),肾损伤molecule-1 (KIM-1) caspase-3,转变增长因子1 (TGF -β1)水平,增强表皮生长因子(EGF)水平。这些生化结果强化了组织病理学调查,显示恢复正常肾组织架构。这些发现强调可能的保护作用的证据PRP的老鼠模型CP-induced肾毒性,建议使用PRP改善新大道顺铂的治疗指数。
1。介绍
顺铂或独联体-diamminedichloroplatinum (II)是一种最有效的抗肿瘤的药物用于治疗实体肿瘤的各种各样,包括癌症的卵巢、睾丸、头、颈、膀胱、子宫、肺、儿童癌症,血液的某些癌症。通常是由于与其他抗癌药物(1]。然而,后发现顺铂肾毒性是一个主要的不利影响。这种不利影响限制了临床使用顺铂在25 - 30%的病人,即使第一剂量(2]。
Ognjanovićet al。3]表明,顺铂积累的管状肾近端小管的上皮细胞,它被转换为一个platinum-glutathione共轭有毒代谢物然后cysteinyl-glycine-platinum共轭。后者进一步转化为新陈代谢活性硫醇作为发起人的半胱氨酸共轭细胞肾损伤。CP的临床效益一直限制由于其肾毒性副作用(4]。因此,创建新的代理缓解顺铂肾毒性的效果仍然是一个主要目标。
富含血小板血浆(PRP)已成长为一个有吸引力的生物仪器在再生医学治疗的属性。PRP是一种自体全血的导数富含活性生长因子。PRP通过离心法富含血小板的血液样本和隔离浮层。然后,氯化钙等产品或纤维蛋白原是用来激活PRP之前应用程序(5]。PRP可以包括不同数量的等离子体,白细胞,红细胞,血小板根据所使用的设备和技术。血小板浓度应该为全血浓度超过基线,最低5倍被看作是“血小板丰富”(6]。PRP被发现通过增强细胞招聘,促进组织再生增殖和分化7]。
生长因子(GFs)被发现控制细胞迁移、分化、增殖(8),和生理功能,从而促进血管生成和组织再生9]。这些GFs包括血小板源生长因子(PDGF)促进I型胶原蛋白的形成和增强血管生成;转化生长因子1 (TGF -β1)启动间充质干细胞增殖和分化并促进血管生成。外源性EGF管理提高肾小管细胞的再生和修复,加速肾功能的恢复10];血管内皮生长因子(VEGF)触发趋化性和内皮细胞增殖,促进血管生成,血管研究进展,和肾干细胞分化;碱性纤维母细胞生长因子(b-FGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、三磷酸腺苷(ATP), angioprotein-2,纤连蛋白,骨钙素和血小板反应蛋白- 1 (TSP-1)是生长因子释放的PRP (11]。EGF促进肾小管细胞的生长,抑制肾小管坏死(12]。IGF是一种激素,减轻急性肾小管坏死(13]。TGF -β1提升凋亡bcl - 2表达,保护上皮内稳态,并防止肾细胞凋亡(14]。VEGF保护管周内皮,提高肾小管上皮细胞的增殖,诱导血管生成,促进肾缺血后愈合(15]。一些研究表明,HGF促进肾小管细胞再生并导致修复后肾脏结构和功能的损伤(16]。这些生长因子提高肾小管细胞再生,加速肾功能的恢复,修复后肾脏结构和功能损伤(10]。所以,可以预期的PRP的自然鸡尾酒GFs cisplatin-injured肾脏会改善其复苏。
注射生长因子的形式PRP比任何其他的方法,因为它是一个廉价的产品,容易获得,自体减少排斥或免疫反应的危险。此外,PRP具有抗菌作用,因为它包含了白细胞,从而降低感染的风险(17]。
尽管PRP已经证明是有用的作为再生产品释放生长因子,改善组织损伤,其影响cisplatin-induced肾毒性先前从未被探索。因此,本研究进行了评估的保护影响PRP在CP-evoked肾毒性。
2。材料和方法
2.1。实验动物
五十个成年雄性Wistar鼠(180 - 220 g)得到的动物屋的殖民地国家研究中心(埃及开罗)。动物被保存在调整实验室条件下(温度= 25±1°C,湿度= 60±10%和12/12 h光/暗周期)。动物们自由获取标准的鼠粮和水。国家研究中心伦理委员会的指导方针,埃及、随访,这符合美国国立卫生研究院的建议指导护理和使用实验动物(1996年出版数量85 - 23日修订)。
2.2。化学物质
顺铂(CP)从Sigma-Aldrich购买(美国),而柠檬酸钠是从埃及国际医药行业公司,埃及开罗。
2.3。制备富含血小板血浆
10的同龄健康雄性Wistar鼠被用作PRP捐助者。大鼠的全血是通过心脏穿刺和柠檬酸与3.2%柠檬酸钠混合血液/ 9/1,比在400×g离心10分钟,再上层清液的分离和离心800 g×10分钟。的前2/3由platelet-poor等离子体(PPP)被移除。其余层(1/3)是分离PRP (18]。PRP分配和冻结在−80°C使用。平均PRP是评估使用Sysmex xt - 1600 i系统。血小板计数为2410×103血小板/μl . CaCl210%(0.8毫升的PRP CaCl + 0.2毫升2前10%)被用来激活PRP立即应用程序。
2.4。外科手术
老鼠被苯巴比妥钠麻醉(50毫克/公斤IP) (19]。正确的腹部切口完成;右肾椎弓根的结扎,右肾切除术。
2.5。诱导的肾毒性
十天后肾切除术、肾毒性在uninephrectomized诱导大鼠使用CP(10毫克/公斤),进行一次腹腔内(IP) (20.,21]。
2.6。应用程序的PRP Uninephrectomized足以危害肾脏的老鼠
24小时后CP管理,动物被苯巴比妥钠麻醉(50毫克/公斤IP)和左腹部切口。左肾被曝光,并激活PRP直接注入到肾脏。五个肩胛下的穿刺进行分发激活PRP(1毫升)同样肾表面。遵循同样的协议,其他组注射1毫升的盐水,盐水和阳性对照组(22]。约定,主要生长因子释放后的第一个星期PRP应用程序(11]。两周是设置为实验的终点。
2.7。实验设计
40个成年男性uninephrectomized老鼠聚集分成四组,10大鼠:组(1):老鼠收到盐水(1毫升,一旦肾脏),作为一个正常的生理盐水对照组;组(2):老鼠收到PRP(1毫升,一旦肾脏);组(3):老鼠收到CP(10毫克/公斤,一旦IP)诱导肾毒性+生理盐水(1毫升,一旦肾脏);和组(4):老鼠收到CP(10毫克/公斤,一旦IP) + PRP(1毫升,一旦肾脏)。
2.8。样品收集
两周后,收集血液样本通过retroorbital出血,离心机在3000 g×15分钟(4°C),分离血清,并存储在−20°C作为肾功能的进一步判断整除:肌酐、血尿素氮(BUN)测定,和N-acetyl-glucosaminidase(唠叨)。动物被迅速斩首,老鼠的左肾解剖和0.9%生理盐水冲洗。收获的一部分肾脏均质0.1磷酸盐在pH值7.4,给最终浓度为10%w/v,保持在−20°C的生化决定细胞间粘附molecule-1 (ICAM-1),肾损伤molecule-1 (KIM-1) caspase-3,将生长因子1 (TGF -β1)、表皮生长因子(EGF)。肾脏是存储在10%的其他部分在4°C formol-saline后续组织病理学调查。
2.9。生物化学分析
血清肌酐浓度确定活动遵循的方法23]。血清包估计使用修改后的Searcey方法(24]。据Luqmani血清NAG测定et al。25]。肾组织ICAM-1 KIM-1, EGF(美国Assaypro) caspase-3, TGF -β1(美国荣耀科学)测定利用固相酶联免疫吸附试验的方法使用老鼠包根据制造商的指示。
2.10。组织病理学研究
福尔马林固定在10%盐水肾脏样本。标本处理和苏木精和伊红染色()),并分析了部分(10字段为每个幻灯片)光学显微镜下进行盲目(徕卡、美国)放大400倍。这些照片被使用AmScope显微镜相机(美国)。肾部分被半定量的规模评估的程度分级管状变化。分制评分:这些参数下进行评估(−)=没有改变,(+)= 10 - 25%轻微改变小管,(+ +)= 25 - 50%适度改变小管,和(+ + +)= 50%以上严重改变小管。
2.11。统计分析
获得的数据进行统计分析使用SPSS统计软件包诉16(美国IL SPSS Inc .)。执行统计分析使用单向方差分析(方差分析),后跟一个图基事后多重比较检验。被认为是显著的差异 。结果显示为中位数和四分位范围(差)。
3所示。结果
三只老鼠死于实验和被排除在外。uninephrectomy由于术后并发症两死后,和其他老鼠后死亡CP管理表现出意想不到的呼吸窘迫和降低流动性。
3.1。PRP改善肾脏功能障碍和近端肾小管损害CP对肾脏有害处的老鼠
CP管理引发了血清肌酐显著升高,包子的水平,和NAG活性(700%、203%和263%,分别地。)和对照组。PRP政府沮丧上述参数(图的水平1)。这些数据表明提高PRP治疗对肾脏功能的影响和损害。
(一)
(b)
(c)
3.2。PRP减轻肾脏损伤和抑制凋亡标记
CP注射导致显著升高肾ICAM-1 KIM-1, caspase-3水平(300%、310%和512%,分别地。)与对照组相比。与此同时,PRP治疗中和这些变化的显著减少这些标记(图2)。这些结果表明,PRP可显著抑制炎症反应和凋亡通路在CP-injected老鼠。
(一)
(b)
(c)
3.3。PRP会使肾组织TGF -β1,恢复表皮生长因子
CP显著升高肾TGF -β1级2.2折,除了重要的抑郁症EGF水平与对照组相比(图3)。
(一)
(b)
3.4。组织学研究
显微镜检查大鼠的肾脏部分是得分和代表表1。检查部分的对照组和PRP组显示正常结构,正常的肾小球,管状架构(数据4(一)和4 (b))。而老鼠的肾脏部分治疗CP显示坏死,肾小球萎缩(20%),和一些肾小球分成小叶的。此外,其他坏死肾小球系膜增生性肾小球肾炎包含观察(图4 (c))。肾脏的不同变化从一些管状上皮细胞变性坏死变化除了重投在受伤的肾小管腔的突出(图4 (d))。Endotheliosis一些肾血管和有液泡的媒体除了间质纤维链延伸到邻近组织被注意到。检查,红细胞在某些部分(图4 (e))。调查肾部分大鼠治疗CP + PRP表明多数肾实质显然是正常形态结构与精致的蛋白在某些小管(图4 (f))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
4所示。讨论
本研究首次调查PRP的有益影响CP-induced肾毒性。CP是一种有效的和高效的抗癌剂使用现在(26]。但其临床使用是有限的由于其肾毒性副作用(27]。越来越多的证据表明,氧化应激,炎症细胞因子和细胞凋亡发挥一些关键角色在其发病机理(28]。
PRP的能力是一种强大的治疗选择提供各种各样的生物活性GFs损伤和网站的特点是它的简单,效率,安全,和持续可用性(29日]。PRP治疗通过提高不同细胞因子的分泌和GFsα颗粒存在于血小板(30.]。PRP GF浓度增加有一个8倍比全血(31日]。所以,可以预期PRP政府与顺铂的自然鸡尾酒GFs将改善肾功能恢复。
在目前的研究中,CP管理导致肾小球功能受损和肾小管损伤表现在升高血清尿素和肌酐与对照组血清唠叨水平的增加,这是一个近端上皮intralysosomal膜结合酶,溶酶体膜破坏时释放。这些数据同意萨德的研究和Al-Rikabi [32)和Ekor et al。33]。CP与DNA结合,导致形成的国际米兰,intrastrand交叉连接,因此抑制DNA, RNA,蛋白质合成和复制在快速增殖细胞。这些事件加强管状损害,尤其是近端小管接受顺铂的最高浓度从而加剧肾侮辱,导致肾毒性、管状损伤和细胞死亡34]。顺铂与SH组导致谷胱甘肽耗竭,从而减少细胞抗氧化系统和活性氧积累或其产品。因此,CP最初唤起氧化肾损害的进展与降低肾小球滤过率(GFR)和增强管损害其次是形态建筑恶化最终导致血液中释放组织标记(35]。PRP治疗肾功能减毒和管状酶泄漏就是明证抑制血清肌酐,包子,通过激活细胞内抗氧化酶和唠叨的水平,主要是谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的酶。PRP释放大量的生长因子(GFs),如肝细胞生长因子(HGF)、二磷酸腺苷(ADP)、三磷酸腺苷(ATP)、胰岛素样生长因子- 1 (igf - 1)和表皮生长因子(EGF) [16]。这些生长因子提高肾小管细胞再生和肾功能恢复和修复后肾脏结构和功能损伤10]。
当前数据显示,CP摄入调节炎症反应,肾损伤指标,和凋亡级联就是明证升高细胞间粘附molecule-1 (ICAM-1),肾损伤molecule-1 (KIM-1)和凋亡caspase-3标志。生产过剩的自由基教唆促炎由内皮细胞损伤过程,促进白细胞粘附和渗透。生成的活性氧激活转录因子NF -κB,导致合成各种炎性粘附分子、细胞因子,趋化因子,如ICAM-1和MCP-1促进并激活炎症细胞迁移(36]此外,肾损伤molecule-1 (KIM-1)是肾损伤后近端小管细胞中高度表达,因为它被认为是一个专门的血液生物标志物对急性和慢性肾损伤37]。目前的结果还揭示了一个重要upregulation CP-treated肾组织中凋亡标记所表示的海拔在caspase-3属于一个家庭的细胞死亡蛋白酶参与细胞凋亡的激活和执行阶段。炎症与氧化应激信号与CP管理相关记录触发upregulation几个基因细胞死亡的凋亡[38]。有趣的是,PRP抑制肾ICAM-1、KIM-1 caspase-3通过加强PI3K / Akt通路抑制ROS生成,从而表达下调NF -κB激活和增加抗氧化(39]。同时,据报道,PRP增加细胞内表达的抗炎介质(il - 4、il - 10和IL-13)发挥重要作用在抑制炎症和降低il - 1β介导的分解代谢的影响(40]。此外,PRP中igf - 1是一种生长因子激活管状细胞再生在急性肾功能衰竭可能通过刺激生长激素的释放,它帮助组织修复(41),从而减少管状损伤和保存肾实质的完整性,肾小球滤过率,肾血流量,和肾排泄功能42]。此外,PRP显示凋亡活动通过下调DAPK1和BIM凋亡基因mRNA的表达(43伯灵顿)和抑制p53, caspase-3水平(44]。同时,HGF在PRP干涉Fas通路,从而拯救肾细胞凋亡(45]。
目前的研究数据表明,CP水平增强肾TGF -β1虽然降低了EGF水平。这些发现与之前的研究(46]。的参与炎症过程已经在很大程度上证明肾损伤,包括编码的促炎细胞因子的基因的表达,如肿瘤坏死因子-α白介素6 (il - 6)、il - 1β和转化生长因子β,加强炎症(47]。TGF -β1通过collagen-rich矩阵的生产导致肾脏纤维化,开始myofibroblast激活,epithelial-myofibroblast分化转移(48,49]。TGF -β1在肾小管细胞体外凋亡[50)和转基因小鼠体内的肾脏51]。TGF -β1水平一直在观察增强缺血/再灌注(52]。肾脏疾病与变更的相关生长因子及其受体的表达。例如,EGF水平被发现后减少缺血期间和恢复其基准面缺血/再灌注损伤的恢复阶段(53]。可比改变EGF水平观察病人患有急性肾功能衰竭(54]。Ledeganck et al。55)报道,顺铂导致抑制表皮生长因子/表皮生长因子受体途径。
相反,PRP政府减毒TGF -β1,增强表皮生长因子。PRP具有强大的促有丝分裂的和趋化现象的生长因子参与发起愈合过程。HGF介导细胞增殖、迁移、生存和组织再生。HGF和其受体c-met存在于肝脏,肺,心脏,肾脏和大脑(56]。HGF拥有一个强有力的肾脏antifibrotic能力通过得罪及receptor-dependent表达式和其他profibrotic 1型胶原、纤粘连蛋白等介质。此外,HGF诱导表达Smad7 TGF -的抑制剂β信号,增殖kinase-dependent方式(57]。HGF阻止间质成纤维细胞的激活和抑制肾小管上皮间充质转变41]。表皮生长因子(EGF)是一个杰出的生长因子存在于PRP和发布的伤害。EGF提高趋化性和血管生成的内皮细胞和间充质细胞的有丝分裂58]。明显不同的研究证明,EGF促进上皮形成和加速愈合过程。同时,EGF分泌后,由间充质细胞因子分泌和上皮细胞增加。EGF、HGF和IGF-I促进DNA合成在再生近端小管59]。
组织病理学调查在这项研究证实了上述不同生化分析表明,肾病发生变化,从一些管状上皮细胞变性坏死变化除了分成小裂片肾小球簇CP后常见的治疗。此外,强烈的胚乳或透明圆柱腔内发现的收集小管。这些发现被证实在60]显示CP-induced大规模的退行性变化,50 - 75%的肾小球和肾小管由氧化应激和细胞凋亡等机制。虽然CP + PRP-treated集团在本研究表明,多数肾实质显然恢复正常肾组织(加速再生),一些微妙的胚乳CP组相比。
关于PRP临床可行性,PRP治疗是安全的因为其自体性质和长期使用没有任何报道主要并发症。出于这个原因,除了简单的可用性,它很容易用于临床和手术设置如塑料和颌面外科、牙科、骨科(61年]。此外,经常用于一些中心治疗骨折,牙科植入物和假肢的援助,和治疗糖尿病溃疡和干眼干燥综合征(62年]。然而,限制在评估PRP的临床效应的变化建立准备协议。额外的PRP产品结果的变化患者年龄的差异,医学并存病,治疗能力(63年]。持续的基础科学研究阐明PRP的下游效应可以帮助推动临床研究和发展临床建议PRP的使用。
5。结论
我们的研究结果强调依据PRP在老鼠模型的保护作用CP-induced肾毒性。这些影响是通过抑制炎症介质介导,促进肾抗氧化防御,抑制细胞凋亡,加速肾功能的恢复,修复后肾脏结构的破坏。总的来说,这项研究可能会打开一个新的大道使用顺铂的PRP提高治疗指数。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
附加分
突出了。(我)富含血小板血浆防止cisplatin-induced在模型大鼠肾毒性。(2)PRP抑制炎症介质,促进肾抗氧化防御,和抑制细胞凋亡。(3)也,加速肾功能的恢复和修复肾脏结构顺铂诱导的损害。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突相关的手稿。
作者的贡献
Neveen Salem促成了概念化的研究中,研究设计,手稿编辑和资源,监督实验和手稿写作。Naglaa艾瑟夫巴德和纳瓦尔米促成了概念化的研究中,研究设计,手稿编辑。
确认
作者要感谢Abdelmoniem a·阿里,病理学教授,和天真的a . Algabri病理学助理讲师在兽医学院,Zagazig大学为他们的合作。