文摘

的水溶性多糖山柰l . (KGPs)提取和纯化及其结构特性和抗肿瘤活性进一步调查。紫外光谱、高性能凝胶渗透色谱法(HPGPC),傅里叶变换红外光谱(FTIR)和离子色谱法(IC)是用来评估的结构特性,和H22肿瘤小鼠模型建立了演示的抗癌活性。理化分析和紫外光谱结果表明,总糖的比例,蛋白质、糖醛酸KGPs分别为85.23%,0.54%,和24.17%,分别。HPGPC、红外光谱和IC表明KGPs酸性多糖与骨骼的吡喃糖环模式,主要由阿拉伯糖和半乳糖的平均分子量8.5×105哒。的在活的有机体内抗肿瘤实验表明,KGPs能有效地保护肿瘤小鼠的胸腺和脾脏从固体肿瘤,提高CD4细胞的免疫调节能力+T细胞、CD8细胞毒性的影响+T细胞和NK细胞,最终导致对H22实体瘤的抑制作用。本研究的实际应用提供了理论基础KGPs在食品和医药行业。

1。介绍

山柰l是一个无茎的多年生植物生长在中国1),粉末被广泛用作土著医学由于各种生物活性化合物,包括精油(2和其他由甲醇提取物3,己烷4)和乙醇(5,6]。报道,这些生物活性物质表现出抗氧化剂,镇静,抗肿瘤,抗炎,抗菌活动7),这将导致应用程序在治疗许多疾病。的甲醇提取物山柰l .粉末显著减少可行的埃利希腹水癌(EAC)细胞和体重增加,增加寿命,和恢复所有血液参数,如红细胞、白细胞、血红蛋白EAC-bearing老鼠对正常水平(8]。此外,ethanolic提取的山柰l .粉末ethyl-p-methoxycinnamate,展出承诺anticholangiocarcinoma CL6-xenografed裸体小鼠的活动由显著抑制肿瘤生长和肺转移活动,以及延长生存时间5),可以抑制人类肝细胞肝癌细胞的增殖方式通过诱导细胞进入细胞凋亡存在剂量依赖的相关性(6]。然而,很少有研究涉及的多糖粉末山柰l及其在活的有机体内抗肿瘤的活动。

多糖普遍存在于各种动物、植物、真菌和藻类作为高分子碳水化合物分子表现出抗凝剂,抗氧化,抗肿瘤和免疫调节活动9- - - - - -11]相对较低的毒性12]。众所周知,多糖的性质和生物活性与他们的化学特性直接相关13),这可能是影响萃取技术(14,15]。热水提取通常被用来提取粗多糖由于简单的过程和低成本16,17]。

肝细胞癌(HCC)是全世界第三个癌症相关死亡的主要原因是最常见的恶性肿瘤之一,一直是一个主要公共卫生问题(18,19]。现代治疗方法治疗肝细胞癌患者的化疗(20.),但疗效不佳,由于疾病的复发和耐化学疗法21]。因此,许多天然产物和更强的抗肿瘤活性和较低的毒性近年来进行了研究。

先前的研究主要集中在摘录山柰l .有机试剂及其生物活性,而关于多糖的相关研究尚未报道。在目前的研究中,水溶性多糖山柰l . (KGPs)用热水提取及其结构特性和抗肿瘤效果进一步评估。

2。材料和方法

2.1。材料和试剂

根状茎(山柰l .)收集从湛江城市(广东,中国),干燥后粉碎恒重。H22肝癌细胞从上海生物科学研究所获得中国科学院(中国上海)。牛血清白蛋白(BSA)、葡萄糖醛酸、三氟乙酸(组织),标准单糖,二甲亚砜(DMSO), 3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)和5 -氟尿嘧啶(研究者用)从Solarbio购买(中国,北京)。胎牛血清(的边后卫)是来自杭州四季青有限公司(杭州)。所有其他的化学物质和代理商均为分析纯。

2.2。多糖的制备

根茎(100克)的粉末是浸泡在蒸馏水(3 L) 4 h在80°C的两倍。不溶性组分被离心分离,上层的收集,和4卷添加乙醇沉淀。降雨雪是保存和重新溶解在去离子水;Sevag方法(1-butanol和氯仿(1:4,v / v) 5次)被用来去除蛋白质(22]。最后,混合物被交联葡聚糖提纯g - 200列(1.6厘米×35厘米)和蒸馏水筛选了1毫升/分钟和冻干获取山柰l .多糖(KGPs 每100克根状茎干重)进行进一步的研究。

2.3。化学成分和结构分析

可溶性总糖含量是由苯酚/ H2所以4分析和葡萄糖作为标准(23]。糖醛酸的含量检测根据carbazole-sulfuric方法使用葡萄糖醛酸作为标准(24]。蛋白质含量是评估通过考马斯亮蓝法与牛血清白蛋白标准(25]。样品(5毫克)溶解在去离子水(1毫克/毫升)和从200年到800纳米扫描光谱- 2102紫外分光光度计。

HPGPC(安捷伦- 1200)和红外光谱(力量VECTOR-22,卡尔斯鲁厄,德国)是用来确定多糖的平均分子量和保税状态后,以前的方法(26]。平均分子量的标准曲线建立了使用扬右旋糖酐(T-10 T-40 t - 70 t - 500 t - 2000)。

单糖成分和比例是由集成电路,一个Dionex ICS2500色谱系统(美国CA) Dionex脉冲电流检测器和一个非盟电极和一个高效阴离子交换柱Dionex Carbopac PA20列(150毫米×3毫米)27]。多糖样品(5毫克)加入1毫升的2 M三氟乙酸在110°C(组织)和水解4 h在密封管。然后组织绝对是被添加甲醇和N2是用作载气。干水解物在1毫升蒸馏水溶解,用蒸馏水稀释10倍。的解决方案是筛选了氢氧化钠(6毫米)和NaAC(100毫米)的解决方案在一个0.45毫升/分钟的流量。D-fucose、D-rhamnose L-arabinose D-galactose,葡萄糖,L-xylose, D-mannose, D-glucuronic酸,D-galacturonic酸是用作校准标准和量化。

2.4。抗肿瘤动物实验
2.4.1。动物模型的设计

女KM小鼠SPF-level(6 - 8周大,在18到22岁的g)购买实验动物中心的军事科学院(中国,北京)。他们是在无菌条件下 温度, 湿度、光和12 h / 12 h暗周期。所有老鼠都允许自由进入自来水和美联储标准颗粒饮食和适应新环境的实验前1周。所有动物实验程序依法进行了实验动物保健原则和当地伦理委员会批准的动物保健和使用在天津科技大学。

60健康雌性小鼠10只小鼠随机分为6组,每组:空白组、模型组、KGPs组(100、200和300毫克/公斤KGPs)和积极的集团(研究者用30毫克/公斤,与癌症已经使用大约40年(28])。空白和模型组小鼠口服管理与生理盐水,而KGP组与不同浓度的KGPs填喂法,积极组腹腔内充满了研究者用。15天,0.2毫升小鼠H22肝癌细胞(1×107细胞/毫升)在皮下接种小鼠右前肢腋窝除空白组。那么所有老鼠连续治疗另一个15天。最后,他们都牺牲了颈椎错位和肿瘤,脾脏和胸腺重量。与此同时,血液、脾和胸腺样本准备和分析。

免疫器官指数被表示为器官重量相对于体重,和肿瘤抑制率是由以下公式计算:抑制率 (29日), 代表平均肿瘤模型组的重量 代表平均肿瘤治疗组的重量。

2.4.2。血常规参数检查

抗凝剂(EDTA-K2)添加到血液样本,以防止血栓形成,以及所有样本分析xfa - 6130自动血液分析仪。

2.4.3。脾淋巴细胞增殖和NK细胞活性

脾淋巴细胞增殖活性(T细胞和B细胞刺激ConA和有限合伙人)和NK细胞活性(杀死活动对H22肝癌细胞)进行如前所述[30.]。

2.4.4。对外周血淋巴细胞亚群的评估

淋巴细胞亚群的比例使用FCM检测外周血中检测到。和获得的血液沾染了单克隆抗体(mAb)反对CD3-FITC, CD19-PE CD4-PE, CD8-FITC 30分钟,冰在黑暗中。然后红细胞和自由的抗体被红细胞裂解缓冲和磷酸盐缓冲洗,最后,流式细胞术(BD FACSCalibur,正欲,富兰克林湖,新泽西,美国)执行与CellQuest Pro软件(版本5.1,正欲富兰克林湖,新泽西,美国)来测量荧光标记淋巴细胞子集(计数10000个事件)。

2.4.5。胸腺和脾脏的组织学观察器官

小鼠的胸腺和脾脏器官固定在10%中性甲醛溶液和梯度乙醇脱水的解决方案。在石蜡包埋后,4μ米得到了部分和苏木精和伊红染色显微镜检查())。

2.5。统计分析

所有值都作为平均值±标准偏差(美国)执行的三个独立的实验一式三份并使用SPSS统计分析对于windows,版本19.0(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。差异的重要性分析了单向方差分析(方差分析)邓肯的测试和紧随其后 数据被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。化学成分的KGPs

比例的总糖、蛋白质和糖醛酸KGPs分别为85.23%,0.54%,和24.17%,分别,这表明KGPs酸性多糖有少量的蛋白质。图1(一)显示了洗脱曲线通过交联葡聚糖g - 200列和紫外线光谱范围200 - 800 nm的KGPs;结果表明:KGPs蛋白质纯化与小是由于没有吸收在260 nm和280 nm (31日]。

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图1
洗脱曲线通过交联葡聚糖g - 200列(a)和紫外线光谱范围200 - 800 nm的KGPs (b)。 和 孔隙体积15.1毫升和列总额62.2毫升,分别。
3.2。分子量分布和红外光谱分析

的平均分子量KGPs由HPGPC决定方法,结果显示在图2(一个)。KGPs HPGPC概要的介绍一个主要峰值为8.029分钟,占总面积的93.15%。KGPs的分子量为8.5×105根据标准曲线由葡聚糖哒。图2 (b)展出的主要官能团和多糖的化学范围。如图所示,广泛吸收3405.03厘米1对应地伸展振动(32),在2929.76厘米和强劲的乐队1是归因于拉伸碳氢键的振动33]。两个强大的乐队在1639.87和1420.26厘米1被分配到的吸光度deprotonated羧基(首席运营官)(34]。这些特征表明,KGPs是典型的酸性多糖,它同意糖醛酸的含量(24.17%)。吸收在500 - 900厘米1和1077.07厘米1被分配到骨骼的吡喃糖环模式(35,36]。

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图2
HPGPC的结果(a)和红外光谱谱(b)在500 - 4000厘米1KGPs。
3.3。单糖分析KGPs

集成电路被用来评估KGPs的单糖组成,和结果如图所示3。如图所示,KGPs由岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、葡萄糖醛酸,和半乳糖醛酸的摩尔比为0.37:3.12:1.23:6.39:1.36:3.09:1.00:0.91:1.27,强烈建议KGPs异构酸性多糖,主要由阿拉伯糖和半乳糖组成。

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图3
标准单糖的IC结果(a)和KGPs (b)。1:岩藻糖;2:阿拉伯糖;3:木糖;4:半乳糖;5:葡萄糖;6:鼠李糖;7:甘露糖;8:葡萄糖醛酸;9:半乳糖醛酸。
3.4。抗肿瘤动物实验
3.4.1。器官指数和抑制率

KGPs的抗肿瘤活性在活的有机体内在小鼠H22肿瘤进一步调查。研究者用抗肿瘤活性和不同剂量的KGPs图进行了总结4。模型组的胸腺指数是空白组相比显著降低( ),虽然他们的脾脏指数明显增加( ),表明H22细胞的增殖在活的有机体内可能会破坏免疫器官。KGPs能有效地保护胸腺和脾脏的实体肿瘤宿主,尽管研究者用表现出强烈抑制肿瘤和免疫器官的影响。肿瘤生长抑制率的研究者用和KGP治疗(100、200和300毫克/公斤)分别为51.80%,20.50%,41.37%,和55.40%,分别。如图5、H22实体瘤的体积模型组趋势不断增加的时间从7至19日d不同,虽然这KGP集团慢慢随着时间改变了从7到13 d和达到最大13 d,然后逐渐减少。的H22实体瘤卷成了显著差异( )模型组和KGP组15 d。结果表明:KGPs可以显著抑制肿瘤的增殖和保护肿瘤小鼠的免疫系统,存在剂量依赖的相关性。

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图4
器官索引和小鼠H22肿瘤的抑制率。(一)胸腺指数。(b)脾指数。(c)肿瘤重量。(d)抑制率。 与模型组相比, 与空白组相比。

图5
肿瘤体积的变化H22肿瘤的老鼠。
3.4.2。血常规检查的结果

肿瘤小鼠的血常规检查是发现在目前的研究中,结果如图所示6。如图所示,淋巴细胞的比例,红细胞计数和血红蛋白含量的外周血中模型组相比明显下降的空白组( ),而白细胞计数、中性粒细胞百分比和血小板计数显著提升( ),表明肿瘤小鼠模型组炎症和贫血的迹象。研究者用组的这些指标都低于模型组,表明其严重有毒副作用。然而,KGPs可以显著缓解症状和改善小鼠H22肿瘤的淋巴细胞的比例和剂量依赖性的方式。

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图6
bearing-mice H22肿瘤的血常规检查。 与模型组相比, 与空白组相比。
3.4.3。脾淋巴细胞增殖和NK细胞杀伤活性

脾淋巴细胞的增殖能力引起ConA有限合伙人和NK细胞杀伤活性MTT比色H22肿瘤小鼠试验。图7表明,刺激指数(ConA和有限合伙人)和NK细胞活性的模型组与空白组相比均有显著降低( );这些指标在研究者用组甚至低于模型组。相比之下,KGPs可以显著提高T细胞和B细胞的增殖能力和杀害NK细胞的活性与模型组相比,( )存在剂量依赖的相关性,表明KGPs能提高肿瘤的抗肿瘤免疫。


图7
KGPs对脾淋巴细胞增殖的影响及NK细胞活性。 与模型组相比, 与空白组相比。
3.4.4。淋巴细胞亚群分布

外围血液中的淋巴细胞的比例子集H22肿瘤的老鼠研究和结果如图所示8。T细胞(CD3的百分比+,CD4+,CD8+)模型组明显降低( )与空白组,这将导致B细胞(CD19的更高层次+)。研究者用老鼠显示一个相对平衡的淋巴细胞亚群分布,表明研究者用有相似的毒性T细胞和B细胞考虑减少淋巴细胞计数(图6)。T细胞的比例KGP组显著增加( )与模型组相比,存在剂量依赖的相关性,尤其是CD8的比例+T细胞。


图8
外周血淋巴细胞亚群的分布H22肿瘤的老鼠。 与模型组相比, 与空白组相比。
3.4.5。他走时胸腺和脾脏的染色

胸腺的组织学观察H22肿瘤的老鼠在图所示9。与空白组相比,模型组的胸腺小叶分化朦胧地。髓质之间没有明确的边界。虽然KGP组的胸腺小叶分割明显,皮质区域增加明显,胸腺的结构逐渐恢复。如图10之间的边界,红色和白色的髓质KGP组明显,有与空白组无显著差异。这是表明KGPs可以保护H22肿瘤小鼠的胸腺和脾脏器官。

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图9
他走时染色的胸腺H22肿瘤的老鼠。(一)空白组。模型组(b)。(c) KGP组。
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图10
)染色的脾脏H22肿瘤的老鼠。(一)空白组。模型组(b)。(c) KGP组。

4所示。讨论

激进手术包括化疗历来是医学治疗肝癌。然而,这将使病人遭受高成本和复发37]。因此,需要研究更有效的药物。多个多糖表现出很强的抗肿瘤活性在活的有机体内相对较低的毒性(38,39]。报道,多糖的抗肿瘤活性密切相关,他们的分子量,官能团,单糖组成,等等40]。先前的研究已经证明,多糖与吡喃糖和糖醛酸形式将对肿瘤小鼠表现出很强的抗肿瘤和免疫调节活动(26,41,42]。在目前的研究中,KGPs被酸性多糖(24.17%)的糖醛酸和骨骼的吡喃糖环模式主要由阿拉伯糖和半乳糖的平均分子量8.5×105Da,符合生物活性多糖的特征。

胸腺是一个负责的初级淋巴器官的分化和成熟的免疫活性的T淋巴细胞(43)和T淋巴细胞的主要主角编排的抗肿瘤反应包括CD8+T细胞和CD4+T细胞(44]。脾脏作为外周淋巴器官,在宿主防御中起着重要的作用。脾脏免疫缺陷有关的损害,导致压倒性的感染和足够的造血作用[45]。在这项研究中,固体肿瘤细胞的生长在活的有机体内会破坏胸腺和脾脏的结构和功能,导致免疫抑制,炎症、贫血的主机。KGP从实体肿瘤治疗能够保护这些免疫器官和平衡白细胞的比例和数量,从而提高肿瘤的抗肿瘤免疫小鼠。

CD4+T细胞可以调节通过激活CD8在抗肿瘤免疫抗肿瘤免疫反应+T细胞和NK细胞;CD8+肿瘤细胞(T细胞色素细胞溶解的活动46]。NK细胞属于先天淋巴细胞的家人和参与破坏感染和癌细胞47]。炎症会增加CD19的程度+B细胞(报道48]。我们的研究结果显示,模型组的老鼠被感染的恶性增殖H22肝癌细胞,这是符合CD19的比例就越高+B细胞。KGPs可以明显提高CD4细胞的免疫调节功能+T细胞、CD8细胞毒性的影响+T细胞和NK细胞,最终导致对H22实体瘤的生长抑制作用。

5。结论

总之,我们提取和纯化的多糖山柰L。(KGPs)和结构特性和抗肿瘤活性研究小鼠H22肿瘤。我们的结果表明,KGPs酸性多糖(总糖85.23%,糖醛酸的24.17%)和骨骼的吡喃糖环模式主要由阿拉伯糖和半乳糖的平均分子量8.5×105哒。的在活的有机体内抗肿瘤试验表明,KGPs能有效地保护肿瘤小鼠的胸腺和脾脏从固体肿瘤,提高CD4细胞的免疫调节功能+T细胞、CD8细胞毒性的影响+T细胞和NK细胞,最终导致对H22实体瘤的抑制作用。这项研究提供了一个理论依据小说的实际应用酸性多糖在食品和医药行业。

数据可用性

数据不可以从作者的化合物。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

许阳,海宇霁,迎迎丰贡献同样这项工作。