文摘

衰老是一种心血管疾病发病的主要危险因素;的一个可能的解释可能与年龄有关的生产过剩的自由基有关。这个增加氧化应激可以克服高摄入的食品抗氧化剂。在这种背景下,许多研究已经解决了天然抗氧化剂的抗衰老的潜力评估化合物。最近,它已被证明,佛手柑汁(Citrus bergamiaRisso et Poiteau),水果大多产生在爱奥尼亚意大利南部的沿海地区(卡拉布里亚),是一种有价值的来源,促进健康的成分,抗氧化性能等。为了调查的潜在抗衰老的影响这个地中海天然抗氧化剂来源,佛手柑果汁的三个不同品种(“怪人”,“femminello,”和“castagnaro”)的意思是这里的特点是高效液相chromatography-photodiode array-electrospray ionization-tandem质谱分析。然后,果汁进行调查评价的总多酚和类黄酮含量,游离模型抗氧化活动,在体外在两个不同的防衰老的细胞诱导心肌衰老的模型。表现最好的果汁也被评估在活的有机体内。植物化学的配置文件证实,果汁富含类黄酮,黄酮和黄烷酮苷。此外,亦发现了两个limonoid苷所有品种。每个品种显示不同的酚和类黄酮含量。管结果显示汁抗氧化活动与酚和类黄酮含量。此外,第一次,汁来抵消chemical-induced衰老的能力在这里展示在细胞模型。最后,在活的有机体内数据来自老鼠心脏证明增加转录的基因参与抗衰老和抗氧化剂反应。总体结果表明,佛手柑汁施加抗氧化剂和antisenescence作用,使其可用于营养食品的目的。

1。介绍

许多与年龄有关的疾病的发病机理是由于增加了氧化应激;事实上,生产过剩的自由基会损害蛋白质和脂肪酸的功能和可能导致DNA损伤,诱发老年性疾病(1]。特别是,老年是主nonmodifiable心血管疾病发病的危险因素。DNA损伤与细胞衰老相关和端粒缩短,动脉粥样硬化,冠状动脉疾病,心力衰竭(2]。此外,在心肌细胞线粒体功能失调的积累可以改变氧化还原状态,导致病理性心肌重塑和心脏衰竭3]。

在这方面,大量的兴趣最近致力于抗衰老的潜在的自然化合物具有抗氧化特性的生化(4]。流行病学研究已经证明,高antioxidant-containing食品的摄入量与降低心血管疾病的风险。特别是地中海饮食(包含抗氧化剂,欧米伽- 3和6不饱和酸、多酚、类黄酮,和原花青素)与更高的寿命和减少相关的风险与年龄相关的血管疾病发展(5]。许多人类膳食干预试验显示改善血管功能的消费高黄酮含量的食品(6,7]。在这些食物中,柑橘类水果获得了高度关注和其它有益的成分黄酮类化合物的含量。特别是,佛手柑(Citrus bergamiaRisso et Poiteau),水果大多产生在爱奥尼亚意大利南部的沿海地区(卡拉布里亚),已被证明是一个有价值的来源,促进健康的分子,导致其抗氧化、抗炎、降低胆固醇的能力(8- - - - - -17]。c .名叫一棵小树;它属于芸香科,主要种植在卡拉布里亚的特定区域,由小气候特点适合它的增长。而获得的佛手柑精油的果皮是广泛的特点18- - - - - -20.),用于化妆品和食品行业,最近才佛手柑的副产品,如纸浆和其汁,评估他们的健康的生物学性质(8,11,21- - - - - -25]。这种重新评估可能代表一个经济优势在工业过程中,降低成本的处理和获得有益的化合物的良好来源。此外,佛手柑果实的推广可能产生重要的经济影响的地区这种水果可以培养。

我们所知,没有研究调查antisenescence佛手柑汁迄今已执行的属性。因此,为了探索潜在的心血管延缓衰老的影响的天然抗氧化剂来源,佛手柑果汁的三个不同品种(“怪人”,“femminello,”和“castagnaro”,通常用于工业)是这里的特点是高效液相的方法chromatography-photodiode array-electrospray ionization-tandem质谱(HPLC-PDA-ESI-MS / MS)。然后,果汁进行调查评价的总多酚(TPC)和类黄酮(交通)脱细胞模型的内容和抗氧化活动超氧化物自由基清除活动(O₂^•−),铁降低抗氧化能力(收紧),和脂质过氧化抑制(β胡萝卜素漂白,BCB)测试;最后,相对抗氧化能力指数(RACI)计算。在体外延缓衰老的特性进行了测试在两个不同的chemical-induced衰老的细胞模型的心肌细胞系H9c2来自老鼠的心脏。最后,表现最好的果汁也被评估在活的有机体内。

2。材料和方法

2.1。化学品和设备

溶剂如甲醇、氯仿、磷酸、盐酸和冰醋酸从卡洛Erba购买(米兰,意大利)。N,N二甲基甲酰胺(DMF)是来自阿尔法蛇丘(德国卡尔斯鲁厄)。乙腈高效液相色谱级买来VWR(米兰,意大利)。高效液相色谱级水(18 mΩ)是由Mill-Q净化系统(微孔Corp .)、贝德福德,妈,美国)。二甲亚砜(DMSO),阿霉素(阿霉素)、过氧化氢(H₂O₂),p甲醛,Folin-Ciocalteu试剂2 N、碳酸钠、氯化铝、硝酸钠、硝普酸钠(SNP),磺胺,N - (1-naphthyl)乙二胺盐酸盐,吩嗪methosulphate (PMS),β烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH),氯化nitrotetrazolium蓝色(电视台)、磷酸氢钾(KH₂阿宝₄),醋酸钠,2,4,6-tripyridyl-s-triazine (TPTZ)、铁(III)氯(FeCl₃h·6₂O),β胡萝卜素,亚油酸,渐变20,氢氧化钠、没食子酸、槲皮素、柚皮苷、抗坏血酸,6-hydroxy-2, 5, 7, 8-tetramethylchroman-2-carboxylic酸(Trolox) butylhydroxytoluen(二叔丁基对甲酚2 6-bis(1,1 -二甲基乙基)4-methylphenol),杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM),胎牛血清的边后卫,青霉素,链霉素从Sigma-Aldrich购买(米兰,意大利)。CellTiter 96®AQ_ueous非放射性细胞增殖测定(MTS)是来自意大利Promega Srl(米兰,意大利)。

光谱光度测量的测量都是在比色皿或96孔酶标UV / vis分光光度计(SPECTROstar Nano, BMG LABTECH)。

2.2。植物材料

三种不同品种的c .名叫(“怪人”、“femminello”和“castagnaro”)由幼果和Visalli迭戈公司(雷焦卡拉布里亚,意大利)。每个品种的新鲜水果是使用手动榨汁机,挤压和获得果汁储存在−20°C和分析之前解冻至室温。

2.3。样品制备

HPLC-PDA-ESI-MS研究10.0毫升的汁加入DMF(10.0毫升)和混合离心机在1145×g为5分钟的三倍。浮在表面的液体过滤是一个3毫米直径聚四氟乙烯膜0.45μ孔隙大小。整除的10μL是注入质系统。

TPC评估、交通和抗氧化活动,果汁被冻干,然后溶解在甲醇。antisenescence的评估活动,冻干的果汁在DMSO溶液溶解。样品是用和离心机。

2.4。HPLC-PDA-ESI-MS / MS分析

定性HPLC-PDA-ESI-MS使用测量员LC / MS分析泵、公证autosampler,加上公证PDA探测器,LCQ利用离子阱质谱仪(热Finnigan)配备Xcalibur 3.1软件。分析了使用4.6×150毫米,4μ米,Synergi Fusion-RP列(Phenomenex)。洗脱液是乙腈(溶剂)和水的混合物(溶剂B)。溶剂梯度是如下:0-15分钟5 - 20%,15 - 40分钟20 - 70%,和40 - min a 70 - 100%洗脱了0.8毫升/分钟的流量分割系统的2:8女士检测器(160μL / min)和PDA检测器(640μ分别L / min)。注入汁DMF溶液的体积是10μl分析ESI接口在负模式。电离条件进行了优化,使用如下的参数:毛细管温度、210°C;毛管电压,−10.0 V;管透镜抵消,−50.0 V;鞘气体流速60.00任意单位;辅助气体流速,20.00任意单位;喷涂电压、4.50 kV;和扫描范围米/z150 - 1200。在MS / MS实验中,应用规范化的碰撞能量35.0%。N₂被用作鞘和辅助气体。PDA数据记录与200 - 600 nm范围两个优惠频道检测波长280 - 325纳米。为了确定主要的佛手柑汁类黄酮,校准曲线是由使用外部标准的柚皮苷浓度范围0.0020 - -0.25毫克/毫升和DMF溶剂。6个不同浓度的标准解决方案(0.250,0.125,0.060,0.030,0.0075,和0.002毫克/毫升)被注射一式三份的准备和分析。生成校准曲线通过使用浓度(毫克/毫升)对获得的区域一体化的PDA /紫外峰记录在325海里。变量之间的关系进行了分析使用简单线性相关性。线性回归的标准,是0.9997。类黄酮量获得通过使用GraphPad软件棱镜最后表示为6.0毫克/毫升的新鲜果汁。

2.5。总多酚含量

Folin-Ciocalteu分析是用于确定样本的总多酚含量(26]。蒸馏水(425μL)和75μL稀释的样本(在空白甲醇)被添加到500μL Folin-Ciocalteu试剂和500μL (Na₂有限公司₃(10%w/v)。是复杂的混合物和孵化1 h在室温下在黑暗中。孵化后的吸光度测量723海里。没食子酸作为标准,结果表示为毫克每克干样品没食子酸当量(mg GAE / g)从三个独立的化验。

2.6。总类黄酮含量

一百年μL(每个样本(在空白甲醇)被添加到15μL 5%的纳米₃微型离心管。5分钟后,30μL 10%的间变性大细胞淋巴瘤引起₃补充说;过了几分钟,100年μL 1 M氢氧化钠溶液和255年μL的蒸馏水补充道。对空白吸光度测量在510 nm 10分钟后在室温下孵化。槲皮素作为标准,和总类黄酮含量表示为毫克的槲皮素的等价物每克干样品(mg QE / g)从三个独立的分析27]。

2.7。管活动

2.7.1。超氧化物自由基(O₂^•−)清除活动

超氧化物自由基(O₂^•−项目/ NADH系统中生成,如前所报道(28]。反应混合物由40μL不同浓度的样品(甲醇-控制),40岁μNADH的L, 130μL的电视台。经前综合症的反应是通过添加(40μL)的混合物。甲醇的过氧化物清除能力被抑制的能力量化样本电视台减少过氧化物蓝色甲瓒。试验在室温下进行,甲瓒的吸光度测定在560 nm 2分钟的动态功能。研究结果表示在毫克/毫升的浓度样本(IC抑制活动所需的50%₅₀)从三个独立的化验。抗坏血酸作为积极的控制。

2.7.2。铁降低抗氧化能力

样品的铁降低抗氧化能力是决定用收紧测定一些修改(29日]。简单地说,25μL适当稀释样品空白(甲醇)被添加到225μL收紧试剂和孵化37°C在黑暗中40分钟。收紧试剂制备新鲜之前实验通过混合300毫米醋酸缓冲在蒸馏水pH值3.6,FeCl 20毫米₃h·6₂O在蒸馏水和10毫米TPTZ在40毫米盐酸的比例10:1:1。减少一种无色复杂铁(Fe^{3 +}-tripyridyltriazine)蓝色(Fe亚铁复杂^{2 +}-tripyridyltriazine)行动的电子基抗氧化剂决心在593海里。Trolox作为标准,收紧值表示为毫克每克干Trolox等价物样本(mg TE / g)从三个独立的化验。

2.7.3。脂质过氧化抑制试验

样本的能力,防止脂质过氧化的抑制作用是由BCB试验据Dekdouk et al。26]。一个股票的解决方案β胡萝卜素/亚油酸是由溶解0.2毫克β胡萝卜素在0.2毫升氯仿,亚油酸(20毫克),渐变20(200毫克)。氯仿完全通过旋转蒸发器,添加蒸馏水(50毫升)和氧气。生成的乳液是大力搅拌。整除(950μL)的混合物被转移到试管包含50μL的样本(所有测试样品的最终浓度为0.25毫克/毫升)或甲醇作为空白。二叔丁基对甲酚作为一个积极的标准。250年μL这个解决方案的被转移到一个96孔板,和外井满是250μL水提供一个大的热质量,因为反应是热敏。微型板块立即被放置在50°C 180分钟,和吸光度是监控470海里每30分钟。从三个独立的化验结果,表示为抗氧化活性的百分比(% AA)测量BCB抑制的基础上,计算如下:

第2.7.4。RACI计算

得到一个完整的和动态的排名食品抗氧化能力,抗氧化能力指数计算。以前的数据证实,RACI是一个有效的工具来评估食品抗氧化能力(30.]。RACI计算通过整合抗氧化能力值产生的颗粒模型方法的不同。

2.8。在体外活动

2.8.1发布。细胞培养

主要H9c2细胞(正常心肌细胞;ATTC马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)培养,常规手续后,在DMEM补充10%的边后卫,100单位/毫升青霉素、链霉素和100毫克/毫升在组织培养瓶37°C在湿润的气氛中5%的有限公司₂。

2.8.2。细胞生存能力

H9c2细胞被播种密度的10×10³细胞/厘米²在96孔板。“怪人”佛手柑汁是溶解在DMSO溶液的浓度为100毫克/毫升(备料)。24小时后,细胞治疗三天用新鲜的生长介质包含冻干“怪人”佛手柑汁在DMSO溶液溶解,从0.01到1毫克/毫升(DMSO 0.01%),或车辆。细胞生存能力是决定使用MTS试验根据制造商的指示。甲瓒在490 nm的吸光度测量与自动比色测定板读者从三个独立化验(Victor Wallac 2,珀金埃尔默)。

2.8.3。Senescence-Associatedβ牛乳糖染色

细胞衰老H9c2细胞是由阿霉素诱导或H₂O₂正如之前报道的(31日,32]。简单,细胞培养约80%融合在DMEM培养基;在实验之前,细胞被播种到24-well板的密度10×10³细胞/厘米²。又一次让细胞附件(24小时),中取代了在每一个细胞,获得不同的治疗3 h, h₂O₂(从5到100μ米)、阿霉素(0.01、0.05和0.1μ米),或相对车辆。随后,细胞培养3天,之后衰老。

3天后评价衰老细胞的数量从阿霉素或H₂O₂侮辱,衰老标记sa -β加发现了之前报道(33]。在平行实验中,不同浓度的冻干“怪人”佛手柑汁溶解在DMSO溶液(0.01,0.1和1毫克/毫升)或车辆(0.01% DMSO)被添加到细胞中后,阿霉素或H₂O₂衰老的侮辱和保持在中三天前评估sa -β加染色。根据文献,细胞被固定在治疗p甲醛在干燥孵化器和孵化刚做好的染色溶液中16 h在37°C (34]。细胞被洗在磷酸盐(PBS) x(1),在100 x放大拍摄。图像的随机光微观领域被抓获(5每口井的字段),蓝色和总细胞数使用ImageJ(美国ImageJ软件,版本1.41)。三个独立的进行了分析。

2.9。在活的有机体内活动

2.9.1。慢性治疗

C57BL / 6 j小鼠来自Envigo(意大利米兰)。所有程序都执行根据欧盟(欧共体指令2010/63)和意大利(D.L. 4 n。2014年3月26日)立法。动物被关在笼子里免费获取标准食物颗粒和水在12 h光/暗周期。

9个月大的雄性老鼠(25 - 30 g)被随机分成两组:一组是用作控制,另一组接受冻干“怪人”佛手柑汁稀释在水里(1毫克/公斤/天)。的最终浓度冻干汁是1毫克/毫升,稀释溶液是日常准备。老鼠每周称重和水摄入量每日监控的三个月。在治疗结束时,小鼠禁食过夜测量血糖水平。从尾巴尖,收集的血液和葡萄糖浓度是决定使用Glucocard™血糖仪(Menarini)。然后,老鼠麻醉与水性聚氨酯溶液腹腔注射30%w/w(Sigma-Aldrich)。心脏内的血液收集管与抗凝剂EDTA (BD真空采血管),为了测量完整的脂质(tryglicerides、总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白)和糖化血红蛋白(使用cobas b 101仪器,罗氏诊断)。最后,心,和一个金额立即被处理中提取总RNA,为了评估三个基因相关的老化,寿命和抗氧化反应(SIRT1, NRF2, FOXO3、HO-1 NQO1)。

2.9.2。RNA提取和实时PCR分析

老鼠心脏的总RNA提取使用RNeasy®迷你包(试剂盒、希尔登,德国)根据制造商的指示。纯洁的RNA样品决定通过测量吸光度在260:280海里。互补脱氧核糖核酸的合成进行了使用i-Script cDNA 500 ng RNA合成装备(美国大力神Bio-Rad)后,制造商的指示。用于rt - pcr引物设计在内含子/外显子边界,确保产品不包括基因组DNA(表1)[35- - - - - -37]。rt - pcr反应由25μL Fluocycle®II SYBR®(EuroClone、米兰、意大利),1.5μL的10μM SIRT1的正向和反向引物,NRF2, FOXO3, HO-1, NQO1、和GAPDH (Sigma-Aldrich、米兰、意大利),3μL cDNA, 19μL H₂o . 38的所有反应进行循环使用以下温度资料:94°C 30年代(初始变性);退火温度°C(见表130年代)(退火);和72°C 1 s(扩展)。GAPDH是用作看家基因。mRNA水平为每个样本被归一化对GAPDH mRNA水平,和相对表达式计算通过使用Ct值。PCR特异性是由融化曲线分析和凝胶电泳。

2.10。统计分析

非线性多功能曲线拟合程序GraphPad棱镜(GraphPad软件公司,圣地亚哥,CA)是用于数据分析和图形演示。颗粒模型抗氧化活性数据表示为三个独立实验的平均值±标准偏差。皮尔森系数是用来确定在多酚和类黄酮含量和抗氧化活性的相关性。的在体外antisenescence活动数据给出的错误意味着±标准方法(SEM)一式三份样本,代表三个不同的实验。统计分析是由单向方差分析(方差分析)与Bonferroni纠正以及事后成对比较。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果与讨论

3.1。果汁成分

在目前的研究中,HPLC-PDA在325海里的三个记录档案c .名叫果汁从不同品种获得显示在图中1。

化合物1- - - - - -14被发现在所有品种和确定了比较高效液相色谱洗脱订单,质/女士,和紫外线数据(表吗2与之前报道)。

与之前的研究结果相一致,我们调查的化学成分佛手柑果汁导致柠檬酸(识别1)[38),类黄酮vicenin-2 (2),lucenin-2 4甲基醚(3),neoeriocitrin (4)、柚皮苷(8),neohesperidin (9),3-hydroxy-3- - - - - -methylglutaryl-neoeriocitrin (10),neodiosmin / chrysoeriol 7-O-neohesperidoside (11),melitidin (12)和brutieridin (13)[39,40]。质/ MS技术已经用于组件的识别可能发生的同分异构体柑橘类汁。特别是,复合4是著名的异构体eriocitrin由于分段模式的基础的峰值是由产品离子米/z459年而不是米/z287年,观察eriocitrin (MS / MS实验的39]。同样,生成的基峰MS / MS分析化合物8被观察到米/z459年协议的裂解途径柚皮苷(39),而异构体narirutin特点是最丰富的产品离子米/z287年(41]。获得的数据证实了佛手柑汁成分,建立在许多先前的研究表明富含类黄酮成分,包括黄酮和黄烷酮苷(39]。

此外,在此,两个柠檬苦素类似物,柠檬苦素葡萄糖苷(5)和nomilinic酸葡萄糖苷(14),也确定了。柠檬苦素类似物是一类苦组件的佛手柑水果和一般丰富柑橘类种子,但他们也存在于纸浆,皮,和果汁,在最近的一份工作报告40]。

最后,峰保留时间(coelution) 21.62分钟生成的两个化合物(6和7先前没有被检测到的)c .名叫。化合物6和7仍不确定,但我们暂时假设他们的结构基础上完整的MS和MS / MS谱(图2)。

全光谱的复合6显示一个deprotonated分子[M−H]⁻在米/z901年。MS / MS产品离子光谱显示离子米/z757年产生的亏损3-hydroxy-3-methylglutaryl基((144−−H)⁻)和595年,造成的损失3-hydroxy-3-methylglutaryl残渣后跟一个己糖分子([M H 144−−−162]⁻)。基离子峰值米/ z 595可以归因于eriocitrin或neoeriocitrin,两个黄烷酮O-glycoside同分异构体之前报道c .名叫果汁(39]。一个非常类似的碎片MS / MS概要文件显示的组件7,获得米/z855年,生产离子米/z741 ([M H−−144]⁻144年)和579年([M H−−−162]⁻),导致假设复合7可以是柚皮苷或narirutin ([M−H]⁻在米/z579)hydroxy-3-methylglutaryl一半和己糖残基分子有关。

量化的主要黄酮类化合物在所有样本中发现果汁被HPLC-PDA柚皮苷的基础上决定记录在325海里。从定量分析结果列在表中3。

3.2。总多酚和类黄酮含量

TPC和交通的果汁从“怪人”,获得“femminello,”和“castagnaro”品种c .名叫水果被调查。每个品种显示不同的酚类和黄酮类(表内容4)。

特别是,TPC范围从8.77±0.77,17.10±1.34毫克GAE / g的样本分别“castagnaro”和“怪人”。相反,交通变化从6.51±0.61,57.46±3.20毫克QE / g的样本再分别“castagnaro”和“怪人”。TPC的值是根据Sicari和Pellicano [42),尽管在这种情况下,新鲜果汁已经作为示例,而这里果汁曾被冻干。

3.3。在管的抗氧化活性

为了描述佛手柑果汁的总抗氧化能力(27),四个不同的和互补的化验所用来评估汁抗氧化活动。样本评估首先为自己的反激进主义的活动对超氧化物和一氧化氮的生理激进分子。然后,样本评估他们的能力减少铁离子和抑制脂质过氧化反应(表4)。使用的两个测试(O₂^•−和收紧)测量活动未见报道的佛手柑汁样品。最后,RACI也计算。

3.3.1。O₂^•−清除活动

O₂^•−通常是一个激进的氧物种体内产生,但它是非常有害的细胞组件作为前体的活性氧物种,例如,氢氧自由基。抗坏血酸(IC的活动₅₀= 4.34±0.39毫克/毫升),用作参考,由集成电路与样品相比₅₀值(表4)。汁从“castagnaro”表现出最低的IC₅₀值(集成电路₅₀= 1.01±0.02毫克/毫升),其次是“怪人”(IC₅₀= 1.13±0.11毫克/毫升)。这两种果汁证明有一个更强大的比抗坏血酸过氧化物自由基清除活性。汁从“femminello”活动(IC展出₅₀= 4.77±0.58)类似于抗坏血酸。清除活动是按照之前的调查(10]。

3.3.2。铁降低抗氧化能力

收紧测试评估植物提取物降低铁离子的能力。在我们的研究中,收紧化验显示,“怪人”品种还原能力最高(9.83±0.54毫克TE / g),其次是“femminello”和“castagnaro”(8.43±0.67, 6.85±0.63毫克TE / g)(表4)。

3.3.3。脂质过氧化抑制试验

得到一个更广泛的抗氧化潜力的概述,样品的抗氧化作用的亚油酸过氧化反应β胡萝卜素/亚油酸体系也调查了BCB测试。亚油酸的氧化生成过氧化氢自由基,然后氧化高不饱和β胡萝卜素。抗氧化剂的存在减少的氧化β胡萝卜素。所有样本显示中度β胡萝卜素漂白抑制活动;事实上,结果范围从22.42±1.15,31.60±0.50%,最高的价值被发现品种“castagnaro”(表4)。

3.3.4。相对抗氧化能力指数

此外,RACI计算在所有的测试样品。所有方法用于抗氧化活性测定和TPC一起包含在RACI计算。特别是,TPC化验结果包括自Folin-Ciocalteu最近提出,获得的结果的过程也可以解释为另一种方法来测量样品的总还原能力的试剂与任何减少物质反应26]。抗氧化活性的结果表示为IC₅₀在1 /转换集成电路吗₅₀之前RACI计算和数据的相对抗氧化活性被表示为直方图(图3)。

根据获得的结果,“怪人”品种RACI最高(0.55),其次是“castagnaro”(−0.09),和“femminello”(−0.45)。

最近,Sicari和Pellicano [42)调查c .名叫使用两个自由基清除化验品种果汁(2,2-azino-bis-3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic酸、abt和1 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl DPPH)。最高的抗氧化能力被发现“castagnaro”果汁相比,“怪人”,然后“femminello”。相反,比较三种佛手柑品种的自由基清除活性,仅仅利用DPPH实验之前的论文(39)建立了“femminello”比“怪人”和“castagnaro”更活跃品种。

这些差异在文学和对现在的结果可能归因于果实酚类内容,取决于许多因素,如在收获成熟的程度,遗传差异和环境条件(42]。值得注意的是,在统计上有显著差异的抗氧化活性和酚类成分的佛手柑果实在不同卡拉布里亚地区收集的证据,表明小气候也可能影响化学成分,因此,汁本身的质量(11]。

然后,为了验证是否有相关性汁多酚和抗氧化性能,皮尔森使用平均每个变量的值进行了分析,报道在表5。

最高的正相关收紧至TPC和薄膜电路( ),这表明一个一致的多酚和类黄酮含量之间的关系和铁降低抗氧化能力。

另一方面,它不是O时注意到一个高价值的相关性₂^•−和BCB评估相比,酚和类黄酮含量。这个结果可能可以解释说因为这些测试不仅酚类化合物(27]。此外,BCB测试主要给出了关于亲脂性的活性成分,而TPC化验报告亲脂性的和亲水性酚类的水平。这些数据可能表明存在轻微的亲脂性的和/或不酚类化合物作用表现为协同作用,提高生物活性。

3.4。Antisenescence活动

3.4.1。H9c2线粒体代谢活动

虽然从胚胎起源,H9c2细胞被认为是主要的心肌细胞能量代谢功能正常,H9c2细胞已经成功地用作体外模型来模拟心脏缺血再灌注损伤(43]。此外,这种细胞系被广泛使用作为一个成功的细胞模型心肌病理生理学的研究包括衰老过程(31日,32]。

作为第一步,为了评估如果佛手柑汁本身影响细胞生命/死亡过程,H9c2细胞的线粒体代谢活动是探索使用四唑染色。线粒体代谢活动是一个参数通常用来评估细胞增殖和药物毒性。细胞治疗的冻干佛手柑汁“怪人”品种,显示最高的抗氧化潜力和三个品种中约占90%。结果表明,香柠檬汁没有施加任何细胞毒性影响H9c2细胞(图4)。的确,没有区别线粒体代谢活动中可观察到三天的治疗后相比,控制样品。

3.4.2。H9c2诱导细胞衰老

H9c2细胞衰老引起的细胞接触外源氧化侮辱(阿霉素、强力霉素或过氧化氢,H₂O₂),因为之前报道(31日,32,34]。senescence-associated的存在β牛乳糖(sa -β加)监控作为细胞衰老的标志。化学侮辱,为了建立有效剂量阿霉素或H₂O₂能够诱导细胞衰老,H9c2细胞被挑战与阿霉素浓度增加(从0.01到0.1不等μ米)或H₂O₂(从5到100μ米),稀释在水里,3 h。随后,新鲜的完全培养基的细胞培养3天,然后sa -的存在β加了。sa -的浓度增加β加H9c2细胞治疗后观察阿霉素(0.05μ米, 和0.1μ米, )。相反,只有60μM H₂O₂是有效的诱导的染色sa -β加明显( )。高剂量的H₂O₂(100μ米)没有进一步增加衰老标记,可能由于细胞毒性效应产生的高浓度的H₂O₂。在一起,这些结果允许我们建立0.05μ阿霉素和60μM H₂O₂作为有效的药物浓度用于以下H9c2细胞实验。

3.4.3。佛手柑汁在细胞衰老模型的影响

因此,目的是探索的防护潜力佛手柑汁与细胞衰老、强力霉素或H₂O₂治疗细胞培养用新鲜的完全培养基含有不同浓度的“怪人”佛手柑汁(FBJ)和关键衰老标志,sa -β加染色,评估后3天。图5显示的结果₂O₂全身(浅灰色酒吧)和DOX-induced(深灰色的酒吧)衰老模型。

在图5(一个),代表相衬显微照片,sa -β加染色细胞在浅蓝色。报道在图5 (b)、佛手柑汁本身并不影响衰老细胞的数量控制,对于任何的测试浓度。正如所料,H9c2细胞受伤与H₂O₂或阿霉素证明一个重要sa -β加染色方面的控制细胞( ,与控制细胞;图5 (c)),值得注意的是,所有的测试“怪人”佛手柑汁cotreatments能够保护受伤的细胞出现衰老的标志( 和 °和H₂O₂或DOX-treated细胞;图5 (c))。有趣的是,在这两种细胞模型,衰老和FBJ浓度百分比显示之间的关系成反比趋势。这些数据表明,最优FBJ浓度能够更好的应对衰老的机制是最低(0.01毫克/毫升)。

我们最好的知识,还有另一项研究在文献中关于antisenescence佛手柑的潜力;这个研究证明抗衰老的免疫调节反应人类photoaged角质细胞治疗高度集中提取佛手柑果实的44]。此外,我们的结果是按照之前的调查结果表明,佛手柑汁多酚可能会影响细胞功能作为活化剂的sirtuin-1 [9),核组蛋白脱乙酰酶,主要涉及在衰老过程45]。

3.4.4。佛手柑汁体内的影响

根据antisenescence结果,“怪人”果汁也影响评估在老老鼠。在每日水摄入量的佛手柑果汁,没有区别“佛手柑集团”和“汽车集团”是强调在为期三个月的治疗。每周权重显示生理增加体重,根据增长曲线报告文学(数据未显示)。血液总胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、甘油三酯glycaemia,和糖化血红蛋白值与相应的重叠值以年轻人常见的动物,这表明这些动物没有代谢疾病的疾病。事实上,BFJ血脂和血糖参数测量和控制组没有显著差异(表6)。

然而,实时PCR分析,进行心的老老鼠FBJ或车辆,一连三个月,显示三个监管机构基因的mRNA水平显著增加,SIRT1, NRF2,和FOXO3很大程度上参与了抗衰老和抗氧化反应(图6)。

无声的信息监管机构2家族蛋白(SIRT),也称为“克利斯托”已经被证明是协调营养代谢反应变化可用性和维持生理体内平衡。Brain-specific Sirt1-overexpressing (BRASTO)转基因小鼠显示显著延长寿命和延迟衰老过程控制老鼠相比(46]。核因子红细胞两个相关因子2 (NRF2)是细胞抗氧化剂的调节器;它协调element-dependent抗氧化剂反应基因的表达调控的结果氧化剂接触(47]。最后,forkhead /翼螺旋盒基因群O (FOXO)蛋白是一组转录因子在融合中心对许多重要的细胞通路,与健康老龄化和长寿有关。foxo参与能量代谢、氧化应激proteostasis、细胞凋亡、细胞周期调控、代谢过程、免疫、炎症、和干细胞维护(48]。值得注意的是,BFJ-enriched饮食能够增加这三个关键基因的mRNA表达小鼠心,暗示一个增强细胞抗氧化能力和抗衰老的反应与BFJ那些老鼠。

为了进一步证明这些通路参与中包含的活性化合物的抗氧化作用佛手柑汁,两个额外的基因,奎宁NAD (P) H脱氢酶1 (NQO1)和血红素加氧酶1 (HO-1),定期评估作为NRF2活性的标记,进行了研究。这两个目标NRF2基因是一个健壮的抗氧化反应的标记(49]。报道在图7实时PCR分析,进行心的老老鼠FBJ或车辆,一连三个月,表现出显著增加mRNA水平的NQO1 HO-1,暗示为FBJ强大的抗氧化作用(图7)。

然后,考虑到氧化应激已经指出的相关原因在心脏衰老和一些心脏疾病的发展,一种方法与BFJ能保证这些目标的改进(SIRT1, NRF2 FOXO、HO-1 NQO1)通常改变和心脏功能障碍的基础和所造成的组织损伤50]。

因此,所有在一起,这些数据表明,佛手柑汁施加有益健康的影响抵消在心肌H9c2衰老细胞,增加了抗衰老的老鼠心脏抗氧化防御系统,打开新的视角上的潜在的医药应用这种自然来源。

4所示。结论

天然多酚积累了相当多的关注潜在代理氧化应激相关疾病的预防和治疗,如老化和心血管疾病(5,51),特别是地中海柑橘类水果香柠檬已经证明是一个有价值的来源的抗氧化分子。此外,柠檬苦素类似物发生柑橘类属显示不同的药理作用;特别是,安慰剂对照,双盲研究表明,柠檬苦素葡萄糖苷可能有用的预防和/或治疗不同的慢性炎症性疾病,如癌症、糖尿病和心血管疾病(52]。我们的研究结果证实,佛手柑果汁具有强大的抗氧化活性,可能被认为是一个有价值的促进健康的成分,如柚皮苷,neoeriocitrin, neohesperidin,先前建立11,39,41]。此外,我们所知,我们首次展示了潜在的佛手柑汁来抵消的衰老过程,在体外和在活的有机体内。

这些发现支持佛手柑果实的营养特性,鼓励其果肉为促进健康资源的使用。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现都是包括在本文和可用。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

爱达·波佐构思的项目,执行实验细胞模型,和写的手稿;克劳迪娅马提尼修订后的手稿;Marinella De狮子座和亚历山德拉Braca执行HPLC-PDA-ESI-MS / MS分析和修订后的手稿;Immacolata Faraone和路易吉Milella评估总多酚和类黄酮含量,游离模型进行抗氧化试验,以及修订后的手稿。奇亚拉Cavallini衰老试验和rt - pcr进行。劳拉Testai和尤金尼亚Piragine进行动物实验。Vincenzo回复中,路易莎Pistelli修订后的手稿。

确认

这项工作是支持的比萨大学(批准号PRA_2017_26)。