文摘

本文调查了准备、氨基酸组成、急性毒性在体外和在活的有机体内抗氧化,再加上在活的有机体内疲劳活动的富含蛋白质的提取田鸡油(毗珥)。毗珥结果表明,具有高安全属性以最大耐受剂量(MTD)高于20克/公斤在老鼠身上,显示弱对羟基清除能力,超氧化物阴离子,1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl自由基(DPPH),以及ferric-reducing抗氧化能力在体外,但在ethanol-induced施加强大的抗氧化作用氧化应激小鼠模型;它可以减少malonaldehyde (MDA)和蛋白质羰基(PCO)形成和增加总超氧化物歧化酶(T-SOD)活动和合成谷胱甘肽(GSH)。除了强大的在活的有机体内抗氧化活性,毗珥的剂量400毫克/公斤也有小鼠的抗疲劳作用,可以延长详尽的游泳时间,降低血尿素氮(BUN)升高和血乳酸(BLA)由剧烈运动造成的。的在活的有机体内毗珥的活动可能会被其吸收了氨基酸,因为八抗氧化剂的氨基酸和十二生成葡糖的被发现。本研究将提供一个临床使用的证据作为膳食补充剂毗珥的抗氧化和抗疲劳剂相同的口服剂量(400毫克/公斤)。

1。介绍

一些有害因素包括饮酒和吸烟过度消费、x射线辐照、有机污染物、重金属可以导致生产过剩的活性氧(ROS),后来摧毁ROS生成之间的动态平衡,消除诱发氧化应激(1]。此外,氧化应激的生理条件下,过量的活性氧可以直接反应蛋白质和DNA,以及脂质损害他们的结构和功能2),导致细胞死亡和衰老3),再加上一些疾病,如炎症(4),免疫缺陷(5),帕金森病(6),阿尔茨海默病(7),和癌症(8]。由于内源性抗氧化剂的水平或活动,如谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)和过氧化氢酶(CAT),总是低于水平要求免费自由基清除,它通常是必要的补充外源性抗氧化剂在面对氧化应激(9]。抗氧化剂的另一个重要作用在于其积极的影响慢性疲劳综合症(CFS) (10]。越来越多的论文表明,抗氧化剂也产生疲劳的活动在活的有机体内,特别是对于一些天然产物(11- - - - - -14]。

蛋白质是一种大分子物质组成不同的氨基酸,它被发现在大多数体内器官和组织。除了天生的生理功能包括生物催化、DNA复制、肌肉收缩、分子运输(15),他们也表现出不同的生物活性和抗氧化活性是对人类有益的功能(16- - - - - -18]。

中国林蛙,中国林蛙是在中国著名的经济动物养殖。它属于小型两栖青蛙的成熟男性体型52 ~ 64毫米和女性58 ~ 64毫米(19]。的自然种群r . chensinensis主要分布在潮湿的森林和山脉在低海拔从600到1300年的中国东北。1987年,野生r . chensinensis被列为全国野生药材的内核之一,中国政府和它的人工繁殖实现大规模繁殖在1990年代(20.,21]。的经济价值r . chensinensis主要取决于它的干输卵管、田鸡油(或)中医药(TCM)在中国使用了数百年。本草纲目中描述或最初是明代和自1985年以来中国药典中列出22]。传统上,还是消费作为滋补虚弱的补救措施,失眠,神经衰弱,呼吸道症状,更年期综合症23]。现代药理研究表明,或显示一个范围广泛的活动,包括immune-enhancement [24,抗衰老的25),疲劳(26],抗氧化作用[27],antiosteoporosis [28[],类似雌激素的作用29日]。或由蛋白质、脂质、类固醇、维生素、核酸和微量元素(30.];其中,蛋白质的主要成分存在于它;在大多数情况下,他们的内容超过50% (24]。

大量的基础研究和实验研究有关氧化应激已经揭示了可能的机制包括监管prooxidant与抗氧化系统之间的不平衡。这些机制提供了重要的见解氧化应激和先进的临床试验和方法,导致成功的预防、诊断以及治疗(31日]。许多天然抗氧化剂基于植物和其他生物已经被科学证实是有效的治疗药物。此外,追求健康的生活方式的增加,越来越多的人使用天然抗氧化剂通常。此外,一些人,尤其是运动员和体育专业人士,也渴望antioxidant-possessing抗疲劳的功能。到目前为止,许多报纸报道从中药中提取或孤立的化合物的抗氧化活动,已成为新型抗氧化剂发现最丰富的来源之一(32]。因此,重要的是获得有效的天然抗氧化剂,也可以施加疲劳活动没有任何损害健康的消费者从中医。或者是一种珍贵的中药蛋白质含量高,但是,据我们所知,几乎没有信息antioxidant-related活动的蛋白质。因此,在本研究,旨在获得的潜在的蛋白质或成为一种抗氧化剂补充高安全属性。富含蛋白质的提取从或(毗珥)制备和分析,和急性毒性体外而在体内抗氧化活动毗珥的评估。然后,在体内毗珥的疲劳效应进一步评估。

2。材料和方法

2.1。材料

或样本来自吉林Huangzhihua制药有限公司(吉林,长春,中国),被教授Guangshu Wang制药科学学院,吉林大学(吉林,长春,中国)。标本或(凭证号码hg - 2035)保存在吉林农业资源综合利用工程研究中心、吉林化工技术研究所(吉林,吉林,中国)。

人参皂苷Rg3(2.5毫克/ 100毫克)是来自大连)制药有限公司(辽宁、大连,中国)。牛血清白蛋白(BSA)是购自南京建成生物技术有限公司(江苏,南京,中国)。大部分的化学物质的使用在体外抗氧化评价得到从文明化学技术有限公司(上海,中国)包括1、10-phenanthroline,维生素C (VC), 1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH),烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH),氮蓝四唑(电视台),和吩嗪methosulphate (PMS)。提供的其他溶剂和试剂分析品位和西格玛奥德里奇化工有限公司(圣路易斯,密苏里州,美国)。

氨基酸混合标准溶液包括甘氨酸、丙氨酸、l -胱氨酸,L-methionine, L-leucine, L-isoleucine, L-valine, L-glutamic酸、天门冬氨酸,L-phenylalanine,精氨酸、赖氨酸、苏氨酸、组氨酸、酪氨酸,L-serine, L-proline,氯化铵和光纯从kouichi化学工业有限公司(日本东京)。

生化指标包括天冬氨酸转氨酶(AST)、丙氨酸转氨酶(ALT)、血糖(GLU)、甘油三酯(TG)、肌酐(CRE)和血液尿素氮(BUN)测定一个AU2700贝克曼库尔特化学分析仪(美国贝克曼库尔特,沥青,CA)。

malonaldehyde测定试剂盒(MDA),总超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽(谷胱甘肽),蛋白质羰基(PCO)、面包和肝脏糖原(HG)从建成生物技术有限公司(南京、江苏、中国)。

血乳酸(BLA)是由乳酸童子军+分析仪(EKF诊断、加的夫、细胞膜,英格兰)。

2.2。毗珥的准备

实验之前,或样本磨到权力和渗到100的网。毗珥准备据报道方法(24)做了一些调整。大约10 g或权力被浸泡在1000毫升的磷酸缓冲盐(PBS)解决方案(pH值6.5)在室温下12 h,超声波处理在300 W的功率2 h (Voshin、vs - 200问题,江苏,中国)。然后混合物在4500转离心20分钟在4°C,上层清液使用中空纤维膜过滤(0.45μm,通用电气医疗集团生命科学,宾夕法尼亚州匹兹堡,美国),沉淀剂提取上述方法的两倍。滤液混合了硫酸铵饱和度(80%)产生沉淀剂,这是溶解在蒸馏水和透析24小时(美国MD10, Viskase达,IL)。透析液离心机在4500 rpm 20分钟在4°C,然后上层清液冻干,给1.02克毗珥,提取率为10.2%。

2.3。一般化学分析

毗珥的蛋白质含量由布拉德福德方法使用BSA作为标准(33]。通过干燥水分测定毗珥在烤箱105°C 6 h,毗珥和火山灰决心通过加热在一夜之间在550°C。毗珥的脂质含量是由索氏法使用石油醚作为溶剂(21,34,35]。

2.4。毗珥的氨基酸组成

50毫克的毗珥与5毫升的6 N盐酸混合110±1°C 24小时的保护下氮气氛(36]。在分析之前,水解溶液的pH值调整到2.2 mol / l LiOH了4个。的氨基酸组成由全自动氨基酸分析仪分析(l - 8900日立、东京、日本)。分析条件如下:色谱柱,阳离子交换树脂4.6毫米×60毫米;柱温箱温度,57°C;流动相、柠檬柠檬酸acid-sodium 0.25毫升/分钟的流量;显色剂、茚三酮溶液的流量0.125毫升/分钟;衍生化温度,135°C;样本大小,20μl;检测波长570 nm / 440海里。

2.5。动物和毗珥的急性毒性

2.5.1。实验动物

SPF-graded ICR小鼠(年龄4周,体重20±2 g,半男半女)购买来自吉林大学实验动物中心(批准文号SCXK (Ji) 2008 - 0005年,吉林,长春,中国)。动物饲料在聚丙烯的笼子里,允许自由获取食物和水。的饲养条件如下:温度20±2°C, 60±10%的相对湿度,12 h-light /黑暗的政权。进行了动物实验的基础上,美国国立卫生研究院的指导的实验室动物保健和使用(NIH出版物编号为8023,1978年修订)和动物保健和福利委员会批准吉林化工学院。

2.5.2。急性毒性的毗珥

急性毒性进行了评价准则的基础上,经济合作与发展组织(OECD)对急性口服毒性和以前的工作21,37)做了一些调整。八十只老鼠(半男半女)被随机分为四组(20每组,每组10 /性);政府之前,动物禁食12小时,可以免费获得水。毗珥是溶解在蒸馏水(3毫升/ 100 g BW)和口服治疗剂量的小鼠5克/公斤BW(政府一次),10克/公斤BW(政府两次12 h),和20克/公斤(政府在24小时三次);老鼠在正常控制(数控)组口服治疗等量蒸馏水。单剂量管理后,死亡率和临床症状与毒性相关的连续两周每天观察和记录;体重变化测量之前和之后的政府在第14天。

14天,称重后,动物禁食12小时(免费水)和与戊巴比妥钠麻醉剂量50毫克/公斤BW腹腔内。收集血液样本从轨道nonheparinized埃普多夫管血清生化参数的确定包括AST(衬底方法),ALT(衬底方法),GLU(己糖激酶法)、TG (GPO-PAP方法),CRE(肌氨酸氧化酶法),面包(脲酶/谷氨酸脱氢酶方法)使用一个AU2700贝克曼库尔特化学分析仪(美国贝克曼库尔特,沥青,CA)。然后动物安乐死二氧化碳,和一个完整的尸体剖检。一些重要器官包括肝、脾、肾、睾丸和卵巢是收获和体重。相对器官重量是按照下列公式计算:

器官收集的动物被保存在福尔马林溶液(10%,pH值7.4)为进一步组织病理检查。

2.6。毗珥的体外抗氧化活性

2.6.1。羟基自由基清除实验

羟基自由基清除实验毗珥是基于该方法进行报道的你等。38)做了一些调整。毗珥样品溶解在蒸馏水准备解决方案在不同浓度(2、4、6、8和10毫克/毫升)。2毫升的毗珥溶液和1毫升的PBS溶液包含0.75更易/ l 1、10-phenanthroline (pH值7.4)混合在一起。随后,1毫升的0.75 l FeSO更易₄和1毫升的H₂O₂解决方案(0.12%,v/v)补充道。在37°C孵化后60分钟,混合物的吸光度(A_年代奇遇记》)立志在536 nm使用紫外可见分光光度计(722 N,荆轲科学仪器有限公司,上海,中国。其他两个没有H反应系统₂O₂和毗珥样本被用作正常控制(A_c)和空白(A₀分别)解决方案。VC含量的0.01,0.02,0.03,0.04和0.05毫克/毫升被用作积极控制。羟基自由基清除率按照以下公式计算:

2.6.2。DPPH自由基清除实验

毗珥DPPH自由基清除活性的测定使用之前报道的方法(39)做了一些调整。毗珥样本浓度溶解在蒸馏水准备解决方案2,4,6,8,10毫克/毫升。2毫升的毗珥的解决方案和2毫升的0.1 l更易与DPPH乙醇溶液混合,反应在室温下在黑暗中30分钟。混合物的吸光度测量在517 nm (A_年代)。反应系统没有采用DPPH(正常控制_c),系统没有毗珥(作为空白解决方案₀)。VC含量的0.02,0.04,0.06,0.08和0.1毫克/毫升作为积极的控制。的DPPH自由基清除速率计算由以下方程:

2.6.3。超氧化物阴离子自由基清除实验

毗珥超氧化物阴离子自由基清除活性评估方法由李et al。40)做了一些调整。毗珥样本浓度溶解在蒸馏水准备解决方案1,2,3,4,5毫克/毫升。1毫升的毗珥的解决方案和3毫升Tris-HCl缓冲区(16更易/ l, pH值8.0)包含0.5毫升的NADH的解决方案(470μmol / l)和0.5(300毫升的电视台的解决方案μ0.5 mol / l)涨跌互现,然后(60毫升的PMS的解决方案μmol / l)添加到启动反应。孵化后在室温下5分钟,混合物的吸光度在560 nm(读_年代),毗珥混合物没有样品被用来控制(一个空白₀)。VC含量的0.01,0.02,0.03,0.04和0.05毫克/毫升作为积极的控制。超氧化物阴离子自由基清除速率估计由以下方程:

2.6.4。还原能力测定

减少权力化验方法报道显示王et al。34)做了一些调整。不同浓度(8、10、12、14和16毫克/毫升)毗珥的解决方案准备。1毫升的毗珥的解决方案,2.5毫升的磷酸盐缓冲剂(0.2 mol / l, pH值6.6),和2.5毫升的铁氰化钾溶液(1%,w/v在50°C)涨跌互现,孵化20分钟;2.5毫升的三氯乙酸(10%,v/v)补充道。混合物在3000转离心10分钟,2.5毫升的上层清液混合2.5毫升蒸馏水和0.5毫升的氯化铁溶液(0.1%,w/v),然后在700 nm测定吸光度。VC含量的0.01,0.02,0.03,0.04和0.05毫克/毫升作为积极的控制。

2.7。毗珥的体内抗氧化活性

六十雄性ICR小鼠(年龄4周,体重20±2 g)被随机分为六组(每组10老鼠)如下:正常控制(数控),积极控制(PC)、氧化应激模型控制(MC)和三个PEOR-treated组。之前的实验中,动物禁食12小时。老鼠在毗珥PEOR-treated组织管理与解决方案(100 ml / g BW) 100年剂量的口服填喂法一天一次,200,和400毫克/公斤体重连续30天,小鼠在PC组服用VC的剂量200毫克/公斤体重,和老鼠在数控和MC组服用等量蒸馏水。毗珥剂量的选择是基于初步测试的结果(数据没有显示)。

最后一天,在被禁食12 h(免费水),除了NC组的小鼠,其他人则口头管理解决方案的50% (v/v)乙醇诱导氧化应激在12毫升/公斤。6小时后,动物与戊巴比妥钠麻醉,并从轨道准备收集血液样本血清测定T-SOD和MDA的离心机在4°C, 4000转10分钟。然后动物安乐死与二氧化碳,肝脏被立即解剖,洗涤、均质在生理盐水,和离心机在4°C, 4000 rpm 10分钟获得量化的谷胱甘肽和PCO上层清液。MDA(硫代巴比土酸方法),T-SOD(羟胺法)、谷胱甘肽(分光光度法)和PCO(分光光度法)水平测定根据说明书中描述的方法包(建成生物技术有限公司、南京、江苏、中国)(41,42]。

2.8。体内疲劳毗珥的活动

的在活的有机体内毗珥疲劳评估设计和执行根据我们以前的工作和报告方法(13,43,44)做了一些调整。

2.8.1发布。实验设计

在实验之前,雄性ICR小鼠(年龄4周,体重20±2 g)游一天两次(每次10分钟)一周内使自己习惯于游泳;老鼠没有学习游泳被淘汰。然后90只动物被随机分为三组(30动物)正常控制(数控),积极控制(PC)和PEOR-treated组。禁食12小时后,老鼠与蒸馏水通过NC组,老鼠在PC组处理人参皂苷Rg3(2.5毫克/ 100毫克)的剂量50毫克/公斤体重,和老鼠在PEOR-treated组管理毗珥的剂量400毫克/公斤体重连续30天每天一次。然后每组的动物是进一步分为三个子组10老鼠根据三个测试/决心部分(图1)。

2.8.2。详尽的游泳测试

最后一天,动物后,被允许休息30分钟口服填喂法,每组10只老鼠和焊锡丝后(约占体重的5%)。然后老鼠被放置在一个塑料游泳池(50厘米×50厘米×40厘米)的温度25±1°C和30厘米的深度。详尽的游泳时间记录动物的时候未能在10年代上升到水面呼吸。

2.8.3。测定面包和汞

上届政府后,老鼠在第二小组被允许休息30分钟然后被迫游泳没有负载。游泳30分钟后,动物与戊巴比妥钠麻醉,从轨道上收集血液样本准备血清包使用量化的工具(urease-Berthelot方法,建成生物科技有限公司、南京、江苏、中国)。然后老鼠与二氧化碳安乐死,肝脏是收获和均相测定汞的使用工具包(分光光度法、建成生物技术有限公司、南京、江苏、中国)。

2.8.4。BLA测定

老鼠在第三小组也受到强迫游泳没有负载,在游泳之前,血液样本取自眼球的量化BLA (C₁)使用乳酸童子军+分析仪(EKF诊断、加的夫、细胞膜,英格兰)。游泳30分钟后,另一个立即血样收集BLA (C的决心₂),休息20分钟后,再次采集了血样测定BLA (C₃)。BLA曲线下的面积(AUC)_BLA)按照下列公式计算:

2.9。统计分析

实验数据被表示为均值±SD(标准偏差),并使用SPSS19.0执行统计分析软件(美国芝加哥SPSS Inc .)。的结果在体外评估,t以及用于评估的意义之间的距离两个手段,和结果在活的有机体内评估,列文的测试是用来检测方差的同质性,如果均匀,单向方差分析(方差分析)。

3所示。结果

3.1。一般化学分析

毗珥被发现的总蛋白质含量80.35±2.71%。此外,毗珥包含2.64±0.15%的脂质,7.41±0.28%灰和1.12±0.06%的水分。

3.2。氨基酸分析毗珥

标准氨基酸混合物的色谱和毗珥示例如图2,总结了毗珥的氨基酸组成表1。17个氨基酸被发现在毗珥,七人必需氨基酸,占41.9%。排名前三的氨基酸在毗珥苏氨酸,天冬氨酸,丝氨酸和苏氨酸120毫克/ g的含量最高。

3.3。急性毒性的毗珥

14天期间,没有死亡和明显的临床症状与毒性是NC和所有PEOR-treated组中发现的。

3.3.1。体重

如表所示2老鼠的身体重量逐渐增加在研究期间,与NC组相比,观察体重变化无显著差异。

3.3.2。相对器官重量

毗珥的影响相对体重的重要器官,包括肝、肾、脾、卵巢和睾丸/都在表中显示了3。相对器官重量没有显著差异指出NC和PEOR-treated组之间。

3.3.3。生化参数

一些生化参数(CRE, AST、ALT、GLU、TG和面包)反映重要器官的病理变化测定,结果见表4。这些参数的统计分析表明,数控和PEOR-treated组之间没有明显差异。

3.3.4。组织病理学检查

组织病理学观察的故事,肝脏,脾脏,在数控和PEOR-treated团体和肾脏表现出图3。与NC组相比,没有发现任何明显的组织变化。

3.4。毗珥的体外抗氧化活性

的在体外毗珥的清除能力与羟基、DPPH和超氧化物阴离子自由基,以及铁ion-reducing权力,如图4,和相应的半抑制浓度(IC₅₀)值是表示在表5。在2 ~ 10毫克/毫升,毗珥羟自由基清除活性的增加与样品浓度的增加,对氢氧自由基清除率最高的毗珥是86.35±1.82%,以及集成电路₅₀值为4.85±0.06毫克/毫升,这远远低于积极控制(VC)集成电路₅₀值为0.0476±0.0005毫克/毫升(图4(一))。至于DPPH自由基,在2 ~ 10毫克/毫升,毗珥也显示自由基清除活性,增加毗珥的高度集中,和扫气率最高为65.23±1.22%,但不如VC、IC₅₀毗珥和VC对DPPH自由基的值分别为4.98±0.37毫克/毫升和0.036±0.0011毫克/毫升,分别(图4 (b))。在1 ~ 5毫克/毫升,毗珥表现出对超氧化物阴离子自由基清除活性良好的线性关系,样品浓度( ),最高的扫气率为89.6±2.43%,但仍远低于其活动风险投资;相应的集成电路₅₀值分别为2.58±0.02毫克/毫升和0.0332±0.0006毫克/毫升,分别(图4 (c))。在8 ~ 16毫克/毫升,毗珥的吸光度(A)在700 nm增加随着样品浓度的增加。当一个_700海里为0.2,毗珥的浓度为11.8±0.02 mg / ml,和相应的VC的浓度为0.0395±0.0002毫克/毫升(图4 (d))。

3.5。毗珥的体内抗氧化活性

3.5.1。毗珥对MDA的影响

如图5(一个)与毗珥剂量的增加,MDA含量降低;MDA含量最低的是5.28±1.27更易/ l,在MC低于2.6倍,低于1.8倍PC组。MDA含量的统计分析表明,有显著差异( NC和MC组之间)。与MC组相比,显著差异( )被发现在PC和所有PEOR-treated组。显著差异( 与PC组相比)也被提到。

3.5.2。毗珥对谷胱甘肽的影响

如图5 (b)与数控相比,显著差异( )谷胱甘肽的内容被观察到在MC集团和显著差异( )还发现MC和其他组织之间的关系。谷胱甘肽含量增加随着剂量的增加;当毗珥剂量为400毫克/公斤,谷胱甘肽的含量达到17.85±3.82毫克/ gprot,这有点高于PC(16.36±3.82毫克/ gprot),但被发现没有明显的统计学差异。

3.5.3。T-SOD毗珥的影响

如图5 (c)在MC, T-SOD活动显著降低( 与数控相比)。与MC相比,显著差异( )T-SOD被发现在PC和所有PEOR-treated组。毗珥的口服剂量依赖性的方式可以增加T-SOD活动( ),毗珥剂量达到400毫克/公斤,T-SOD活动为234.6±14.5 U /毫升,这明显( 在个人电脑(179.6±21.0)高于U /毫升)。

3.5.4。毗珥对PCO的影响

如图5 (d)、PCO内容(MC组显著高于 比在NC)。与MC相比,显著差异( 在PCO)被发现在PC和所有PEOR-treated组。PCO内容减少剂量依赖性的方式( )和显著差异( )在400毫克/公斤PEOR-treated集团与PC相比(1.16±0.37 nmol / mgprot和2.62±0.99 nmol / mgprot)。

3.6。体内疲劳毗珥的活动

3.6.1。详尽的游泳测试

如图6,有显著差异( 数控和PEOR-treated团体之间),游泳时间是6.38±2.26分钟,1.9倍的时间比在数控。与电脑相比,显著差异( PEOR-treated组)被发现,大约1.5倍的时间比在电脑。

操作。毗珥的影响在发髻上

如图7、与数控相比,包内容在PC和PEOR-treated组显著( 分别低18%和17%。

3.6.3。毗珥对汞的影响

如图8、HG内容PEOR-treated组是37.66±11.49毫克/克,在数控是35.83±11.49毫克/克;没有发现显著差异。有统计上显著差异( HG PC和NC组之间),PC汞含量为56.88±13.3毫克/克,1.59倍高于NC和PEOR-treated组高出1.51倍。

3.6.4。BLA毗珥的影响

BLA内容在不同的时间点(t_{在游泳之前},t_{0分钟后游泳},t_{20分钟后游泳})确定。如表所示6在游泳之前,在BLA表示组间无显著差异。与NC组相比,在游泳后0分钟,BLA内容在个人电脑( )和PEOR-treated组( )显著降低。休息20分钟后,所有组的BLA水平升高降低,而且没有观察到显著差异。的AUC_BLA值的计算,发现有显著差异( )在PC和PEOR-treated组与NC组。的AUC_BLA价值PEOR-treated组类似于PC组(115.4±24.7更易/ l和114.4±19.4更易/ l)。

4所示。讨论

自田鸡油(或)是一种珍贵的中药蛋白质含量丰富,因此,在这篇文章中,或(毗珥)制备的富含蛋白质的提取和分析。结果表明,毗珥包含80.35±2.71%的蛋白质,包括17种氨基酸,其中七个是必不可少的氨基酸总含量为41.9%(图2和表1)。

针对越来越多的治疗风险引起的天然产品的使用(45- - - - - -47和我们之前的工作21),我们发现,或具有高安全属性,在目前的研究中,只有一个单剂量口服毒性观察14天的间隔进行评估毗珥的安全,和20克/公斤剂量被视作一个上限。在观察期间,没有死亡和明显的临床症状与毒性相关的数控和PEOR-treated组中发现了;也有身体的重量(表中没有明显的变化2),这表明最大耐受剂量(MTD)的毗珥可能高于20克/公斤的老鼠。

然后一个完整的尸体剖检和血清生化和组织病理学检查来评估内部器官毗珥的有害影响。没有注意到,在验尸,任何明显的异常,没有显著差异相对权重的重要器官,包括肝、肾、脾、卵巢和睾丸/ NC和PEOR-treated组之间(表3)。血清生化参数是另一个重要的检测在活的有机体内损伤程度的器官,例如,ALT和AST是肝脏的功能密切相关,而CRE和面包是肾毒性的重要生物标志物(48,49]。与数控相比,无显著差异在AST、ALT、GLU, TG,包子,CRE PEOR-treated组(表中被发现4毗珥),表明口服对内部器官,没有伤害,进一步证实了组织病理学检查的结果,任何明显的变化在肝、脾、肾脏甚至都没有找到与数控的最大剂量20克/公斤(图3)。

在抗氧化试验在体外评价首先进行获得毗珥的抗氧化潜力。结果表明,毗珥自有清除能力与羟基,DPPH,和超氧化物阴离子自由基,以及一定的还原能力在不同浓度铁离子,和活动增加随着浓度的增加(图4和表5)。毗珥的自由自由基清除活性可能是由一些氨基酸残基,这可能会破坏提供活性氢自由基在液体培养基中50];如表所示1和图9六个氨基酸与氢供体侧链在毗珥在场。然而,当与VC相比,一个著名的水溶性抗氧化剂,免费的自由基清除能力和铁ion-reducing毗珥的力量明显( )降低;的集成电路₅₀值约100倍高于VC(表5)。这些令人失望的结果是符合一般发现蛋白质或多肽大秀免费自由基清除能力低于他们的短肽和氨基酸,由于这样一个事实:小分子倾向于更有效地与自由基(51]。为了验证这个假设,在活的有机体内抗氧化评价毗珥进一步执行。

基于之前的研究结果(41),一个ethanol-induced氧化应激小鼠模型来评估在活的有机体内抗氧化活性的毗珥使用VC的剂量200毫克/公斤积极控制。四抗氧化生物标志物包括MDA(脂质过氧化的产物)、谷胱甘肽(内源性抗氧化剂),T-SOD (antioxidase)和PCO(蛋白质氧化的产物)是选择和确定。如图5与数控相比,显著差异( MDA、谷胱甘肽、T-SOD PCO被发现在MC,表明一个ethanol-induced氧化应激小鼠模型建立。与MC相比,显著差异( MDA、谷胱甘肽、T-SOD PCO PEOR-treated团体指出,和积极作用增强随着剂量的增加;对于T-SOD PCO,存在剂量依赖的相关性( 观察的)方式。与电脑相比,显著差异( MDA)被发现在所有PEOR-treated组,和类似的倾向( )T-SOD和PCO指出在400毫克/公斤PEOR-treated组。这些结果显示口服的毗珥可以减少氧化应激引起的乙醇对MDA在小鼠和有更多的影响,T-SOD,谷胱甘肽和PCO比,尤其是对MDA。400毫克/公斤的老鼠是一个有前途的有效剂量毗珥的抗氧化活性。其机制可能涉及降低MDA和PCO形成和增加T-SOD活动与谷胱甘肽合成。强烈的在活的有机体内抗氧化活性的毗珥与弱的活动在体外评价,进一步证实了我们的猜测,即吸收氨基酸和小肽可能是毗珥的真正形式起到抗氧化作用。先前的研究已经显示,蛋白质消化吸收产品的类型和成分是他们的活动密切相关34],一些氨基酸包括苏氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸,苯丙氨酸,谷氨酸、天冬氨酸,赖氨酸显示良好的抗氧化活性在体外和在活的有机体内(52- - - - - -54]。如表所示1,有八个抗氧化剂氨基酸在毗珥,也就是说,天冬氨酸(69.4毫克/克)、苏氨酸(120毫克/克),谷氨酸(51.8毫克/克),蛋氨酸(1.13毫克/克),酪氨酸(25.1毫克/克),苯丙氨酸(23.6毫克/克),组氨酸(13.9毫克/克)和赖氨酸(42.0毫克/克),占大约52%的氨基酸的总量在毗珥;他们的存在可能发挥重要作用在抗氧化作用的发挥在活的有机体内。

这几个发现体现强烈的运动性氧化应激可以导致自由基的积累,引起肌肉疲劳55,56]。外生膳食抗氧化剂可以加强清除内源性抗氧化剂对抗疲劳的影响(11]。考虑到强劲的在活的有机体内毗珥抗氧化的影响,以及其高安全,然后,我们评估了在活的有机体内抗疲劳活性毗珥的承诺中剂量抗氧化评价(400毫克/公斤)。在我们以前的工作(43),我们注意到,人参皂苷剂量35毫克/公斤的老鼠是一个很好的积极的控制自然产物的抗疲劳效果评估;为了保证控制效果,我们稍微提高了剂量,选择50毫克/公斤的剂量积极控制。详尽的游泳时间,加上一些生化指标(面包、HG和BLA)反映疲劳程度,决心估计在活的有机体内疲劳毗珥的效果。如数据所示6- - - - - -8,毗珥的剂量400毫克/公斤可以延长详尽的游泳时间和减少剧烈运动造成的高发髻内容在老鼠身上,但在HG存储的影响不大。对于BLA概要(表6),毗珥BLA静息状态条件下几乎没有影响但显著( )减少了BLA水平升高引起的剧烈运动。与电脑相比(人参皂苷,50毫克/公斤),毗珥的剂量400毫克/公斤可以显著( )提高运动耐量,表明毗珥(400毫克/公斤)也是一个很有前途的候选人为自然的发展疲劳补充,由于这样的事实,详尽的游泳时间是最直接和有效的指标来衡量测试样本(抗疲劳的活动57]。毗珥抗疲劳的能力也可以归因于extraenergy由其生成葡糖的氨基酸包括天冬氨酸(69.4毫克/克)、苏氨酸(120毫克/克),丝氨酸(53.3毫克/克),谷氨酸(51.8毫克/克)、甘氨酸(44.3毫克/克),丙氨酸(30.8毫克/克)、缬氨酸(28.5毫克/克),蛋氨酸(1.13毫克/克)、异亮氨酸(28.1毫克/克),组氨酸(13.9毫克/克)、精氨酸(25.5毫克/克)和脯氨酸(37.1毫克/克),约占氨基酸总量的75%出现在毗珥(表1)。毗珥的确切机制对疲劳的影响应该被研究在不久的将来。此外,由于大多数的蛋白质进入血液作为单个氨基酸(58,59),在这篇文章中,我们主要讨论了氨基酸的积极贡献在毗珥。同时,贡献小肽的吸收在肠道抗氧化和毗珥的疲劳作用,尤其是化学结构和activity-favourable构象,需要进一步探讨。

5。结论

总之,毗珥主要由17个氨基酸与七个重要的。具有高安全与MTD价值上超过20克/公斤老鼠与羟基产生弱的清除能力,DPPH,和超氧化物阴离子自由基,以及铁ion-reducing权力在体外,但在ethanol-induced展示强大的抗氧化活性氧化应激小鼠模型;其机制可能涉及的减少MDA和PCO形成,与T-SOD活动的增加和谷胱甘肽合成。的在活的有机体内毗珥的抗氧化效果增加随着剂量的增加;是一个有前途的剂量400毫克/公斤应该是进一步研究;在这个剂量,毗珥也显示抗疲劳的效果。与氢供体有六个氨基酸侧链,八个抗氧化剂氨基酸,和十二个生成葡糖的氨基酸在毗珥;他们可能发挥重要作用的发挥在体外和在活的有机体内抗氧化活性,以及在活的有机体内疲劳毗珥的效果。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

宏力周张、杨的构思和设计实验;完成了刘洋在活的有机体内抗氧化评价;库恩朱镕基决定生化指标;姚董进行了在体外抗氧化评价;郝崔毗珥的准备和分析;力平毛和晓晓许了在活的有机体内疲劳评估;杨张分析数据和写的手稿,宏力周修订。

确认

这项研究是由吉林省省级科技部门的项目(批准号20150311044 yy)和吉林化工技术研究所的科学基础(批准号2016032,2017013)。作者还表达他们的感谢凌气博士,吉林医科大学,她的工作组织病理学检查和顾Yawen博士,河北科技大学,她的工作在分析氨基酸组成。