文摘
现esculentusl有良好的营养/药用功能。我们发现在花中提取总黄酮的含量最高(788.56毫克/克)的不同部分答:esculentus;根据高性能液相色谱,quercetin-3-O - [β-D-glu - (1→6)]β-D-glucopyranoside含量为122.13毫克/克。保护作用的总黄酮类化合物的提取答:esculentus鲜花(著名)短暂脑缺血再灌注损伤(TCI-RI)进行调查。与模型组相比,老鼠接受等于off(300毫克/公斤)7天显示显著降低神经赤字,梗塞面积,在脑组织和组织学变化,伴随着增加超氧化物歧化酶的内容,而一氧化氮和丙二醛含量下降。等于off调节Nrf2的表达,HO-1, NQO1。这些数据表明,等于off防止TCI-RI清除自由基和激活Nrf2-ARE通路。
1。介绍
缺血性心血管疾病(也称为“缺血性中风”)是全世界第三个死亡和残疾的主要原因(1]。全世界患有脑缺血性疾病患者的人数增加了200万,每年的发病率与这种疾病会影响年轻人(2]。
目前,几种合成的药物用于治疗短暂性脑缺血发作有副作用。“自然”药物有良好的疗效和副作用很少。此外,脑缺血性疾病是紧急情况下,很难预测,其发病机理是复杂的(3]。短暂性脑缺血发作后再灌注期间,氧化应激和释放兴奋性神经递质造成不可逆转的损伤,炎症,甚至凋亡神经细胞(4,5]。因此,寻找天然产品保护和治疗短暂性脑缺血再灌注损伤(TCI-RI)和探索他们的作用机制是一个理性的方法。
核factor-E2-related因子2 (Nrf2)是一种内源性抗氧化剂防御的主要监管机构。大多数基因编码抗氧化剂酶抗氧化反应元素(是)序列在基因的启动子区域。研究已经证明,Nrf2-ARE通路的激活导致缺血性损伤后神经保护(6- - - - - -8]。
现esculentusl .俗称“女士的手指”,“秋葵,”或“bhindi”是一种重要的蔬菜作物种植在许多国家(9,10]。水果有益于消化系统和免疫系统由于糖蛋白含量高、微量元素和被用作食品添加剂,因为它们antigastric酸、抗疲劳、抗氧化、抗炎特性(11]。的种子答:esculentus是一个很好的来源,许多高质量的蛋白质和不饱和脂肪酸,抗癌,糖尿病,糖尿病和antihyperlipidemia属性(12- - - - - -14]。的花期答:esculentus长,产量高,但答:esculentus迅速的花朵枯萎,所以他们往往不会被研究。答:esculentus花是黄酮类化合物的主要来源和多糖和参与免疫系统的调制15]。然而,研究的保护作用的总黄酮类化合物的提取答:esculentus鲜花(著名)TCI-RI及其作用机制缺乏。
因此,我们探索等于off TCI-RI及其潜在的保护作用机制。
2。材料和方法
2.1。材料
参考样品quercetin-3-O - [β-D-glu - (1→6)]βquercetin-3-O -D-glucopyranoside (AFG-1)——(β-D-xyl - (1→2)]β-D-glucopyranoside (AFG-2), quercetin-4-O-methy-3-O -β-D-glucopyranoside (AFG-3)的纯度> 98%是由我们的研究团队(16]。芦丁标准样品是购自中国药品生物制品检测研究所。答:esculentus花、水果和蔬菜种子样本在试验基地2016年浙江农业和林业大学。一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和考马斯亮蓝装备是购自南京建成生物技术有限公司抗体Nrf2,血红素oxygenase-1 (HO-1), NAD (P) H:醌oxidoreductase-1 (NQO1)β肌动蛋白是从Wanlei生物技术有限公司购买水合氯醛是购自浙江医学科学院。所有的试剂都是分析或高效液相色谱级。
2.2。总黄酮类化合物的提取和纯化答:esculentus
新鲜样品的鲜花、水果和种子答:esculentus重(10公斤),干在40°C,压碎,经过60-mesh筛。这些粉末被声波降解法reextracted三次用70%乙醇:水1:30比(w:v每个在室温下)30分钟。提取相结合,用旋转蒸发器浓缩成糊状。然后,集中解决方案与乙酸乙酯除去脂溶性成分提取。剩下的提取与树脂添加到列(Diaion HP-20、三菱、日本)。树脂是用蒸馏水洗净去除蛋白质、多糖等水溶性杂质。然后,洗出液收集以50%甲醇和干旋转蒸发器在50°C。粉中提取总黄酮类化合物的鲜花(258.8 g),水果(186.3 g),和种子(160.6 g)答:esculentus获得和储存在4°C。
2.3。确定总类黄酮提取物的组成
每个样本提取(10.0毫克),AFG-1(31.6毫克),AFG-2(3.25毫克),AFG-3(5.08毫克),和芦丁(10.0毫克)溶解在甲醇和由10毫升提供样品和标准的解决方案。我们测量的内容使用AlCl总类黄酮3比色测定(17]。吸光度测量在510 nm,内容表示为毫克芦丁相当于每克干重(毫克/ g DW)。三次所有样本化验。
AFG-1、AFG-2 AFG-3内容分析了高效液相色谱法(HPLC)系统(2695;美国水域,米尔福德,MA)光电二极管阵列检测器(2996;水)在特定的高效液相色谱条件下:SunFire C18柱(4.6毫米×250毫米,5.4μ米)、列温度= 28°C,流量= 0.8 mL / min,流动相为甲醇(溶剂):0.1%磷酸水(溶剂B),比梯度洗脱,47:53。这些解决方案在255.6 nm的吸光度测定样本喂养10μl .未知峰的识别是基于比较的保留时间与已知的标准。
2.4。动物实验
所有程序都是通过动物实验的伦理委员会浙江农林大学(浙江,中国)。
雄性昆明小鼠(在18到22岁的g)是购自浙江医学科学院的动物实验中心(浙江、中国;SC数量2008 - 3344)。在实验之前,所有老鼠都保持在通风良好的环境(23 - 24日°C;湿度、56 - 59%)与12 h明暗周期和免费获取食物和水为1周。
老鼠( )随机分为五组,正常组(虚假的操作),模型组,以及高(300毫克/公斤),中等(150毫克/公斤),和低剂量(75毫克/公斤)等于off组。已经被证明是安全的(300毫克/公斤18]。老鼠在正常和模型组被给予同等体积的水,和其他组,相应数量的著名有7天每天一次。一个小时最后政府后,老鼠模型和等于off组麻醉(3.5%的水合氯醛,i.p。)和放在鼠标固定器。创建TCI-RI模型如图1。颈部是用75%的酒精消毒。中线切口,和皮肤分离直言不讳地允许双边颈总动脉暴露。使用一个动脉夹,双边颈总动脉血流受阻了30分钟。随后,动脉夹松动恢复血液供应和切口缝合。颈总动脉正常组,两国没有阻止,只做的缝合切口。再灌注24 h后,神经损伤评估。然后,每组10存活小鼠都牺牲了,他们的大脑组织迅速被移除,储存在20°C。
(一)
(b)
(c)
2.5。生存和神经功能评分
TCI-RI 24 h后,确定每组的生存率存活小鼠的数量比老鼠的总数。一个评估者盲目治疗协议进行神经功能评分所描述的巴隆et al。19]。评分标准如下:0 =没有神经赤字,1 =未能充分延长侧前爪,2 =盘旋轻瘫的一边,3 =跌至对侧的一边,4 =不自发地走,有一个沮丧的意识水平。
2.6。评估梗塞面积
每组的脑组织( )以随机的方式获得的。然后,大脑被切成五冠状部分的厚度2毫米。他们孵化立即在2% 2、3、去除氯在37°C (TTC)解决方案在黑暗中30分钟,福尔马林固定在10%。之后,染色片拍摄使用相机(EOS30、佳能、日本)。每个部分的梗死面积计算图像分析仪(Image-Pro + 6.0)。梗塞面积的百分比计算使用以下公式:
2.7。组织病理学
每组的整个大脑组织( )再灌注24 h和4%多聚甲醛固定后24 h,苏木精和伊红染色()),然后用光学显微镜观察(BX20、奥林巴斯、东京、日本)。
2.8。TUNEL分析
每组的整个大脑组织( )再灌注24 h和4%多聚甲醛固定后24 h,定期嵌入石蜡,切割厚度为4μm, deparaffinized,沾染了终端原位(dUTP)缺口末端标记(TUNEL)试剂和DAPI解决方案,清洗,然后使用荧光显微镜拍摄(Eclipse C1尼康,尼康,日本)。阳性细胞(绿点)被一名调查员盲识别和统计分组。三个老鼠和10个区域的荧光图像数据被用来获得凋亡细胞。
2.9。脑组织生化分析
每组的脑组织(n3= 4)均质9倍生理盐水。10%的匀浆在3000转离心10分钟在室温下。浮在表面的10% (100μL)制成2%浓度与冷生理盐水(400μL)来确定蛋白质含量与考马斯亮蓝装备(标准溶液:0.563 g / L胚胎牛血清BSA)。浮在表面的10%被用来确定一氧化氮(NO)的含量,超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)商用设备,和他们的结果表示为相当于每克蛋白质浓度。
2.10。西方墨点法
分析蛋白表达,脑组织匀浆( 在14000 rpm)离心机30分钟在4°C获得总蛋白。蛋白质含量是量化使用bicinchoninic酸蛋白质化验设备。等量的蛋白质(50μg每车道)决定12%聚丙烯酰胺凝胶,转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(微孔,马尔伯勒,妈,美国),和探测主要抗体Nrf2, HO-1 NQO1、β肌动蛋白。PVDF膜为每10分钟,洗了三次孵化2 h与辣根peroxidase-conjugated二级抗体在4°C (anti-rat)。蛋白质是可视化使用增强化学发光检测系统(Amersham法玛西亚,皮斯卡塔韦,新泽西,美国)。
2.11。统计分析
与邓肯的数据分析了单向方差分析测试和组间比较使用SPSS统计软件(SPSS 19.0 Inc .,芝加哥,美国),表示为平均值±标准偏差(SD)。值低于0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果与讨论
3.1。内容总类黄酮和黄酮苷的不同部分答:esculentus
果实、种子、根、茎、叶,和鲜花答:esculentus作为传统药物广泛应用在中国因为他们的抗癌和抗炎作用20.]。据报道,鲜花,水果,和种子答:esculentus黄酮类化合物的主要来源,总类黄酮含量是不同地区的不同答:esculentus。
在花中提取总黄酮含量最高的不同部分答:esculentus,最多是788.56毫克/克(表1)。三种黄酮苷、AFG-1 AFG-2 AFG-3,在图所示的结构2不同地区的主要组件答:esculentus(图2)。在等于off, AFG-1内容为122.13毫克/克。因此,著名的潜在的保护作用在TCI-RI调查。
3.2。等于off对存活率的影响和神经损伤
短暂性脑缺血与高死亡率和发病率相关。短暂性脑缺血脑超微结构改变,引起缺氧和缺血大脑中动脉,损害神经系统(6,21]。只有52.6%的小鼠模型组(表幸存下来2)。等于off治疗后,存活率明显改善根据等于off剂量( )。根据行为和神经系统评分,观察小鼠正常组(没有遭受损害神经系统)可以正常移动。模型组的得分显著不同于正常组( );侧前掌不能向前扩展或绕着,和运动能力被削弱(神经得分= 2.8±0.79)。著名的神经功能评分(300和150毫克/公斤)组明显高于模型组( ),和老鼠并没有下降到一方或遭受运动障碍。
这些结果表明,等于off可以保护神经系统从脑脑缺血发作的影响。研究表明,黄酮类化合物有抗氧化功能22]。元等人发现,总类黄酮提取物的鲜花、水果、树叶和种子都有自由基清除活性和抗氧化能力和清除自由基的能力等于off是相对强劲的在体外(23]。神经细胞在大脑中更容易受到氧化应激,因为他们有高耗氧量和含有高含量的不饱和脂肪酸,基本prooxidants脂质过氧化反应,和低水平的抗氧化防御能力(24]。因此,等于off回收的自由基,保护神经细胞免受氧化损伤。
3.3。等于off对脑梗死面积的影响
短暂性脑缺血不一定导致残疾或死亡,如果及时返回发起的氧气和血液供应。缺血性心血管疾病的大多数情况下造成的更严重的再灌注损伤是由于长时间缺血或缺氧的大脑和心脏25,26]。在脑梗死患者大脑中动脉主干梗死面积的82.12% (27]。因此,我们使用一个方法基于对颈内动脉闭塞导致TCI-RI在老鼠身上,导致人类脑缺血的症状类似。
脑组织被TTC染色(数字3(一个)和3 (b)),红色区域表示正常组织和白色区域代表梗塞。与正常组相比,模型组小鼠有明显的脑梗死(39.13%±1.49)。预处理与等于off(300和150毫克/公斤)减少了脑梗塞面积显著( )。结果提出了一个著名的神经保护效应TCI-RI老鼠。屈从于脑缺血和再灌注后,有氧呼吸泄露和Ca的失衡2 +,Na+ADP离子稳态,刺激神经细胞线粒体氧自由基的过度生产(28]。异常生产自由基增加压力对细胞结构和破坏细胞内大分子,如脂质,蛋白质,核酸,导致酶的失活,破坏细胞膜,功能障碍,最终导致死亡的脑组织细胞会加重脑梗死区(29日]。高浓度的脂质过氧化和细胞毒素引起的氧化应激后缺血破坏内皮细胞的紧密连接,伴随着增加血脑屏障(BBB)的渗透性和梗死的严重恶化30.]。类黄酮的家人已报告横向BBB (31日]。等于off治疗组,由于BBB破坏TCI-RI事件后,等于off积累TCI-RI地区改善神经功能评分和减少脑组织梗死区域通过抗氧化活性,从而促进功能恢复的神经细胞。他等人证明Danhong注入促进神经功能的恢复与脑梗死的抗氧化活动(32]。以前的研究报道,类黄酮还可以改善神经系统功能,保护脑组织从脑缺血再灌注损伤通过抑制氧化应激减少大脑微血管内皮细胞屏障的破坏和BBB函数(6,33]。
(一)
(b)
3.4。组织病理学
短暂性脑缺血和缺氧导致损伤或坏死脑组织伴随着复杂的病理变化(34]。不同病变观察缺血性侮辱的持续时间。在缺血30分钟,主要损伤是神经细胞(35]。后整个脑组织已经沾染了),病理变化清晰可见(图4(一)和4(b))。与正常组相比,模型组显示大脑皮层细胞水肿的细胞,细胞核萎缩,或细胞损失,与病理变化有关。预处理与著名7天阻止神经细胞诱导的损害TCI-RI,和高剂量组有最好的效果。
3.5。的效果等于off TUNEL检测细胞凋亡检测
再灌注后异常形成的活性氧诱导神经细胞凋亡的一个主要因素(36]。TUNEL染色法是用来检测凋亡细胞DNA碎片的基础上。TUNEL-positive细胞荧光素标记(图后发出绿色荧光5(a))。正常组没有TUNEL-positive细胞和凋亡细胞模型组与正常组相比显著增加。等于off治疗后(150和300毫克/公斤体重),TUNEL-positive细胞与模型组相比显著降低(图5(c), )。等于off有可能采取行动保护大脑免受TCI-RI伤害减少凋亡细胞。张等人发现,预处理的富含黄酮类提取物Rosa laevigataMichx水果后,其抗氧化性能明显抑制神经元凋亡TCI-RI [37]。
3.6。等于off对蛋白质的内容,不,脑组织中SOD和MDA
多项研究表明,TCI-RI可引起严重的再灌注损伤和产生一系列的级联反应:能源消耗、氧化应激与释放大量的自由基,apoptosis-related基因的激活,钙超载,释放兴奋性神经递质,和炎症(38]。氧化应激是TCI-RI后继发损伤的主要原因。如果缺血性脑组织受到刺激,氧化剂和抗氧化剂的氧化应激产生了不平衡组织细胞,产生过多的活性氧(ROS) (39]。后者损害线粒体内和灭活酶结构和功能,导致减产的腺苷酸(ATP)他们(40]。细胞内ATP缺乏降低pH值,抑制Na的活动+/ Ca2 +交换蛋白,增加细胞内的钠水平+和Ca2 +,减少水平的K+。这些离子紊乱损害大脑细胞防御系统,导致神经细胞的凋亡或死亡6,28]。Ca2 +过载增加一氧化氮合酶(NOS)的表达和Ca2 +端依赖蛋白酶。然后,NOS降低谷氨酸生产非传统神经递质。随后,黄嘌呤脱氢酶转化为黄嘌呤氧化酶,这增加了没有和氧自由基的水平(39,41]。没有复杂的角色在许多疾病,包括抑制线粒体的功能,有毒性反应诱导细胞死亡42,43]。测定蛋白质浓度的组织匀浆上清液并不是一个直接的临床价值和用于其他生化参数的计算的相关内容(6,37,44]。的没有内容显著增加小鼠模型组与正常组相比,它是等于off组显著减少(300和150毫克/公斤)与模型组相比,这些差异显著(图6(一), )。
(一)
(b)
(c)
这种酶SOD进行清除超氧化物阴离子自由基在活的有机体内,可以清除ROS,包括超氧化物阴离子自由基(45]。SOD活性下降可能导致大规模在脑组织自由基积累,导致磷脂的脂质过氧化作用和细胞膜不饱和脂肪酸(6]。然后,最终产品的脂质过氧化水平,MDA,相应增加,导致破坏细胞膜的结构和功能和神经元损伤46,47]。由于氧自由基的清除,SOD含量降低,MDA含量增加TCI-RI之后。因此,测量SOD和MDA的含量可以间接反映机体清除自由基的能力,这些化学物质造成的损害的程度48]。与正常组相比,在小鼠的脑组织SOD水平模型组显著减少了59.7% ( )而MDA含量增加了51.9%。从TCI-RI预处理与著名保护小鼠,SOD和MDA水平显著增加,减少,分别为(数字6 (b)和6 (c), )。
3.7。的效果等于off Nrf2的表达,NQO1、HO-1
TCI-RI是一个非常复杂的病理过程,所以机制也是复杂的。多项研究表明,氧化应激是TCI-RI的主要原因之一。抗氧化压力的机制包括直接清除自由基以及间接抗氧化活性通过调制的途径参与cytoprotective酶的表达和分子(7]。陈等人。49)报道,清除DPPH自由基的类黄酮的程度答:esculentus鲜花是大于,在同一浓度的维生素C。诱导Nrf2-ARE途径帮助调节阶段II-detoxifying和抗氧化酶的表达。在一个正常的生理环境,Nrf2在细胞质中绑定到其“天然抑制剂,”Kelch-like ECH-associated蛋白1 (Keap1),导致Nrf2的泛素化和本构退化。如果受到氧化应激,Nrf2 Keap1分离和转移到细胞核。这里,它绑定到小肌肉筋膜纤维肉瘤(加)蛋白质形成异质二聚体和识别适当的促进抗氧化基因的转录序列草皮,HO-1,NQO1(8,50- - - - - -52]。
先前的研究已经表明,总类黄酮对PC12细胞的保护作用和通过PC12细胞;它可以直观地看到,Nrf2从细胞质中转移到细胞核当暴露于氧化应激(53]。黄等。54)发现,添加HO-1抑制剂(ZnPP)显著降低了对PC12细胞的保护作用。吴et al。7)表明,小鼠缺乏Nrf2更容易受到氧化应激。因此,我们调查如果等于off TCI-RI诱导Nrf2-ARE通路的神经保护作用在活的有机体内。与模型组相比,Nrf2的表达,NQO1、HO-1 AFF-treated老鼠是调节显著(数据7(一)和7 (b), )。这些结果与研究[8]。因此,潜在的分子机制等于off在脑缺血性中风的治疗效果是其抗氧化活性和调制Nrf2-ARE通路在氧化应激反应(图8)。Nrf2是一种很有前途的治疗目标防御氧化应激在中风,和著名将是一个很好的药物来防止TCI-RI通过激活Nrf2-ARE通路。
(一)
(b)
4所示。结论
我们的研究表明,对TCI-RI等于off有保护作用可能通过直接(清除自由基)和间接(激活神经元Nrf2-ARE通路调节氧化应激的影响)的行动。这项研究提供了一个理论依据等于off作为功能食品的发展及其对缺血性心血管疾病的治疗效果。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。
附加分
化合物。芦丁(PubChem CID: 5280805), 2, 3,去除氯(PubChem CID: 9283)和水合氯醛(PubChem CID: 2707)是在这项研究中使用的化合物。
的利益冲突
作者在本研究无利益冲突。
确认
这个项目是由浙江省自然科学基金(LY13H280011)。
补充材料
与本文相关的相应的实验数据可以看到从辅料的文件。(补充材料)