文摘
非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是一种metabolic-related障碍从脂肪变性到肝病,这可能发展为肝硬化和肝细胞癌(HCC)。本研究旨在评估miR-26a监管和保护作用的脂质代谢和发展人类HepG2细胞含有的非酒精性脂肪肝游离脂肪酸(FFA)。慢病毒表达miR-26a或负控制米尔被用来转换HepG2细胞,建立稳定的细胞系。收益或损失的函数使用一个miR-26a抑制剂用于比较甘油三酯(TG)的内容,总胆固醇水平(CL)、总抗氧化能力(TAC)、丙二醛(MDA)和细胞凋亡水平。此外,定量逆转录聚合酶链反应(qPCR)被用来评估mRNA水平的脂肪生成,TG合成、存储基因,炎症和纤维发生的标记,自噬除了内质网(ER)压力标记后得到或失去miR-26a的功能。miR-26a水平降低FFA人类HepG2细胞的反应。建立一个稳定的细胞系后,upregulation miR-26a的TG的差别导致了对这些CL,和MDA水平,通过调节基因的mRNA水平参与脂质稳态,ER应激标志,炎症和纤维发生的标志。不过,有一个自噬标记基因的mRNA表达显著增加。此外,miR-26a过度保护细胞的凋亡,而抑制miR-26a,使用一个anti-miR-26a寡核苷酸,减少miR-26a的表达可能有助于改变脂质代谢与FFA HepG2细胞加载。总之,这些发现暗示miR-26a有着至关重要的作用在调节脂肪酸和胆固醇体内平衡在HepG2细胞,以及对非酒精性脂肪肝的发展提供保护在体外。因此,microrna能收到越来越多的关注作为有用的非侵入性诊断标记遵循非酒精性脂肪肝的发展和确定新的治疗目标。
1。介绍
非酒精性脂肪肝病(NAFLD)是全球最常见的慢性肝脏疾病。没有显著的特点是肝脂肪变性,饮酒,代表肝代谢综合症的表现(1]。这种异常的肝疾病是由于过多的脂肪从头合成,降低β氧化和/或减少脂类排泄(2]。简单的脂肪变性可以发展为非酒精性脂肪肝炎(纳什),导致更严重的阶段,包括纤维化、肝硬化,肝细胞癌(HCC)和肝衰竭3]。
非酒精性脂肪肝的发病机制是一个多步过程并非完全描述。不同的猜测一直解释说,开车在第一次理论。肝脂质积累次生高脂肪饮食、肥胖和胰岛素抵抗,作为第一个打击,糖分会让肝脏进一步侮辱作为“第二次打击”,诱发炎症和纤维发生(4]。值得注意的是,第二个打击可以各种各样的变量包括活性氧(ROS)香料和内质网(ER)压力(5]。关于增加游离脂肪酸(FFA)供应肝细胞,氧化应激可以由于活性氧产生和脂质过氧化反应生成的脂肪酸的新陈代谢(6]。
这个初始的“两面夹攻”理论来解释从非酒精性脂肪肝进展到纳什正在取代由多个支安打(7]。此外,肠道微生物群(8]和PNPLA3等遗传多态性和TM6SF2 [9)也参与开发和疾病的进展。
小分子核糖核酸(microrna)是一类从内部表示小非编码rna(19 - 22日核苷酸),调节基因的表达在转录后的级别通过绑定到3未翻译区(UTR)的目标基因(10]。他们通过两个主要机制:抑制基因表达抑制翻译或目标基因退化(11]。microrna最近备受关注,因为他们通常在多种疾病特异表达;例如,mir - 125 upregulation雌激素是记录保护雌性老鼠从非酒精性脂肪肝12]。另一个研究也显示,miR-21甘油三酯和胆固醇的水平减少了针对HMGCR [13]。此外,另一项研究中观察到的变更关键microrna的处理组件(Dicer1、Drosha DGCR8),与其他七pri-miRNAs包括pri-miR-26a-1使用内脏脂肪组织(增值税)从纳什相比non-NASH病例。这些发现表明,特定的microrna参与NASH的发病机制(14]。这些研究从而提出注意探索microrna在非酒精性脂肪肝的重要性。
miR-26 miR-26a-1组成的是一个功能的家庭,miR-26a-2, miR-26b亚型。miR-26a多样的表达在人类肿瘤和显示不同类型的变更在发育和正常组织增长(15]。重要的是,miR-26a展品中的双重角色不同的癌症,肿瘤抑制在一些(16,17)和其他肿瘤促进剂(18]。此外,miR-26a报道规范胰腺细胞分化[19),肝细胞增殖在肝脏再生(20.),病理和生理血管生成(21除了许多其他重要过程,如自噬。以前,miR-26a被发现参与调节免疫功能在小鼠模型22,23]。以前的研究也表明,miR-26a发挥了显著的作用在调节葡萄糖的代谢,脂质和胰岛素敏感性24),指出其监管影响氧化应激引起的过氧化氢产生的血管平滑肌细胞(25]。
有趣的是,其中一个基因,由miR-26a监管,是蛋白激酶δ(PKCδ)。PKCδ小说是一个蛋白激酶(δ,ε,θ)激活甘油二酯(DAG),一个自由脂肪酸代谢产物(26]。事实上,一些研究表明,高脂饮食和脂质治疗促进肝甘油三酯和DAG积累激活PKCδ(27]。同样,格林et al。28]报道减少肝脏TG积累和改变在PKC肝脂肪生成的基因表达δ零的老鼠。减少氧化应激和细胞凋亡也。此外,PKCδ以前发现通过TNF诱导ER应激传播,由物介导的激活和诱导切/ GADD53 [29日]。此外,NADPH氧化酶复杂(p47phox, p67phox、p22phox Nox2),活性氧的主要来源之一,诱导肝损伤在应对高脂肪饮食30.]。它已被证明,PKCδ参与的激活(磷酸化)的大部分组件NADPH氧化酶复杂(31日]。
因此,本研究旨在调查潜在管理角色的miR-26a衰减发展的游离脂肪酸(FFA)诱导肝脂肪变性和肝细胞损伤在体外非酒精性脂肪肝模型。为了实现这一目标,我们评估的影响miR-26a甘油三酯(TG)、胆固醇(CL)存款积累,脂质稳态的基因表达,自噬基因标志。此外,我们测试了其对活性氧保护作用,脂质过氧化和细胞凋亡。
2。材料和方法
2.1。细胞培养和HepG2细胞转导
HepG2细胞株培养和保持组织培养瓶在罗斯威尔公园纪念研究所(RPMI) 1640中补充10%胎牛血清的边后卫。慢病毒hsa-miR-26a或炒控制米尔被应用生物材料制造(里士满,公元前,加拿大),过度表现miR-26a并建立稳定的细胞系。慢病毒被传导到HepG2细胞根据制造商的指示。经过2周的嘌呤霉素抗生素(2 ug /毫升)选择、转导结果验证了定量实时PCR(存在)。
2.2。瞬时转染
细胞被播种在6-well板和孵化一夜之间在37°C公司为5%2。米尔miR-26a抑制剂和控制被应用合成生物材料(里士满,公元前,加拿大);寡核苷酸是转染到HepG2细胞使用Fugene 6转染试剂(美国Promega),根据制造商的指示。孵化24小时后,介质被除去,脂肪酸进行治疗。
2.3。细胞治疗和FFA过载
脂肪细胞重载后之前的协议说明了Gomez-Lechon et al。32];HepG2稳定细胞系confluency近75%被暴露在一个长链的远期运费协议(棕榈酸和油酸比1:2)在不同浓度24 h。股票的解决方案油酸棕榈酸10毫米和50毫米的准备培养基中含1%牛血清白蛋白(BSA),方便在培养基稀释的边后卫获得所需的最终浓度。FFA和车辆被添加到HepG2细胞24小时后播种。
2.4。油红O染色和中性脂质量化
中被移除,细胞被洗两次磷酸盐(PBS)。他们然后用10%福尔马林30分钟孵化。固定,细胞被洗两次双蒸馏水之前刚做好的工作油红O染色(3部分股票油红O和两部分的水,过滤)。15分钟后,污渍被移除,这些细胞被洗了几次直到背景污渍被忽略。油红O染色当时从细胞中提取使用异丙醇100%,剩下的污渍的解决方案是转移到一个96孔板测量吸光度在492海里。之后,这些细胞被洗PBS和沾染了4 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 15分钟。DAPI-stained细胞被评估使用cytation 3乐器,和DAPI的平均值为每一个决定。每口井的中性脂质染色的吸光度计算除以油红O意味着DAPI染色。
2.5。测量甘油三酯(TG)、总胆固醇(CL)
细胞TG和CL无穷TG量化评价工具(美国热费希尔科学)和CL量化工具(美国Abcam),根据制造商的指示。标准曲线生成,和价值观得到规范化与总蛋白(ng)。
2.6。量化的丙二醛(MDA)和总抗氧化能力(TAC)
脂质过氧化水平,表示为丙二醛(MDA)和细胞总抗氧化能力(TAC)量化使用MDA和TAC量化工具(美国Abcam),根据制造商的指示。MDA和TAC的浓度从标准曲线,计算值规范化和总蛋白(ng)。
2.7。通过流式细胞术测定细胞凋亡
凋亡细胞死亡是决定使用一个膜联蛋白V氟染色工具包(美国Abcam)根据制造商的指示。样品进行了分析使用BD Accuri C6流式细胞分析仪(美国BD生物科学、贝德福德,MA)。
2.8。定量实时逆转录酶聚合酶链反应(存在)
HepG2细胞总RNA提取使用所有预科DNA / RNA /蛋白质(美国试剂盒)工具。miR-26a表达水平检测使用TaqMan逆转录互补脱氧核糖核酸合成装备和TaqMan hsa-miR-26a-5p分析(热费希尔科学、美国)根据制造商的指示。信使rna是相对地转录使用高容量cDNA逆转录工具包(热费希尔科学、美国),和他们的表达是研究使用SYBR绿色(美国BioRad)。执行中存在使用ViiA7仪器(生活技术,美国),和相对miR-26a和mRNA的表达与归一化计算U6核内小rna或GAPDH值,分别用2 ddct方法。引物序列表中描述1。
2.9。免疫印迹
通过免疫印迹蛋白质水平量化;细胞被洗在PBS和细胞溶解Radioimmunoprecipitation化验(里帕)裂解缓冲含有蛋白酶抑制剂。蛋白质被Bicinchoninic酸方法量化(BCA)皮尔斯蛋白质分析工具包(美国热费希尔科学)。蛋白质被解决通过sds - page和涂抹到PVDF膜。膜被封锁的5%脱脂奶粉和探测主要抗体anti-beta-actin 1:5000(美国剑桥Abcam)或anti-PKCδ一夜之间1:1000(细胞信号技术,美国)。第二天,膜被孵化与适当的辣根过氧化物酶(合)共轭二次抗体anti-mouse 1:1或anti-rabbit 1:25000,分别为1 h(美国剑桥Abcam)。发射极耦合逻辑的信号是可视化工具包(皮尔斯,热费希尔科学、美国)使用x射线胶片。
2.10。统计分析
统计学意义是使用GraphPad棱镜程序版本7.02(美国GraphPad软件)。数据表示为均值±SD至少三个独立的实验。学生的以及和单向方差分析(方差分析)是用来比较两个或两个以上人群之间的差异。被认为具有统计显著性差异 。
3所示。结果
3.1。治疗FFA miR-26a表达水平
miR-26a内源性表达水平显著降低在FFA治疗来控制细胞与正常相比介质( ,图1(一))。修改后miR-26a HepG2细胞表达水平和建立稳定的细胞系,miR-26a表达水平明显增加比炒米尔控制( ,图1 (b))。
(一)
(b)
3.2。建立使用HepG2的脂肪变性酒精性模型稳定的细胞系
非酒精性脂肪肝细胞模型成功建立了治疗HepG2稳定细胞系与1.2毫米FFA 24 h与不同浓度的FFA相比。我们发现1.2毫米FFA浓度可以显著提高中性脂质积累在控制细胞,并显著下调miR-26a过表达细胞使用油红O染色规范化DAPI染色( ,图2)。
3.3。miR-26a抑制甘油三酯(TG)、总胆固醇(CL)水平FFA-Treated细胞
我们阐明监管miR-26a对TG的影响积累和CL与FFA水平治疗后24 h。结果显示显著降低TG积累在这两个条件:FFA-treated和参与细胞显著减少FFA-treated CL水平细胞后miR-26a过度,而米尔控制。正如所料,miR-26a显著逆转的抑制效果(数字3(一个)和3 (b))。
(一)
(b)
3.4。在FFA-Treated细胞miR-26a对脂质代谢的影响
探讨调节miR-26a对脂质代谢的影响,脂质metabolism-associated米尔之间的基因进行评估和比较控制,miR-26a过度,和miR-26a抑制组。基因表达水平的FASN,SCD1,SREBP1c,DGAT,PLIN4( ),PLIN2( )大大降低miR-26a过度HepG2细胞(图所示4)。相反,抑制miR-26a HepG2细胞信使rna表达水平增加( ,图4)。相反,基因参与β氧化和TG排泄物FFA治疗后(图显示微不足道的变化4)。
3.5。miR-26a减少PKCδ在mRNA和蛋白表达水平
数据5(一个)和5 (b)表明,内生PKCδ表达被压抑miR-26a信使rna和蛋白质水平相比,米尔控制( )。此外,抑制miR-26a显示扭转(差别的对这些 )。
(一)
(b)
3.6。miR-26a过度保护FFA-Treated细胞对氧化应激和细胞凋亡
肝脂质过氧化水平的MDA检查。图中的数据6(一)表明miR-26a过度降低FFA治疗后肝脏MDA的水平相比,米尔控制,而miR-26a抑制完全逆转这个结果( )。此外,TAC在细胞水平大幅度增加miR-26a超表达与米尔控制。这效果是逆转与anti-miR-26a转染后( )。细胞凋亡也使用流式细胞术研究。作为显示在图6 (c)后,有一个显著的减少凋亡细胞miR-26a超表达相比,米尔控制( )。同样,miR-26a抑制逆转效果( )。
(一)
(b)
(c)
3.7。miR-26a进行靶向治疗对ER应激的影响,促炎,纤维发生的,自噬在FFA-Treated细胞标记
肝的表达几个压力内质网(ER)标记,促炎,纤维发生的调解员,自噬标记检查,显示在图7。显然,miR-26a超表达显著减少mRNA表达水平的ER应激标记,即切( ),IRE1( );炎性标志物的水平;il - 6( )和纤维发生的标记;和TGFβ1( ),TGFβ2( )后24 h (FFA治疗相对于miR-negative控制。然而,这些信使rna表达水平的调节在转染后逆转miR-26a抑制剂(图7)。
的影响miR-26a过度自噬标记也被调查。如图7,miR-26a过度调节BECN1( ),LC3( )和显著下调autophagy-negative监管基因的信使rna表达水平,TAB3( ),POLR3G( 相比),米尔控制。miR-26a抑制完全逆转了信使rna表达水平的变化(图7)。
4所示。讨论
在这项研究中,我们评估了监管miR-26a对脂质代谢的影响使用在体外非酒精性脂肪肝模型。miR-26a超表达明显降低TG的水平,CL,和MDA FFA-treated HepG2细胞,而这导致显著增加TAC相对于控制。这些影响是显著减少脂肪生成的表达,TG合成、存储和自噬基因标志。另外,我们观察到在细胞凋亡水平减少miR-26a超表达。所有这些研究结果与antimiR-26a逆转治疗后证实miR-26a在非酒精性脂肪肝模型的作用。
的差别,一个对这些观察miR-26a HepG2细胞FFA作为对待在体外非酒精性脂肪肝模型。我们的结果与之前的研究一致24],它证明了降低肝miR-26a在戴奥16周后小鼠模型在高脂饮食(HFD)相比,控制标准食物饮食的老鼠(CD)。另一方面,当前的数据显示,过度的miR-26a减毒TG积累和CL水平,与基因的mRNA水平减少脂肪生成(SCD1,FASN,SREBP1c)、TG合成(DGAT1),存储(PLIN2和PLIN4)和胰岛素信号(PKCδ)。
是正当地指出,非酒精性脂肪肝通常始于脂肪沉积在肝细胞由于代谢改变包括增加脂肪从头合成(33]。先前的研究已经表明DGAT1和PLIN2信使rna水平提高与非酒精性脂肪肝(人类和啮齿动物的肝脏34,35]。维兰纽瓦等。36)也表示DGAT1零小鼠水平的降低SREBP1c和其他脂肪生成的酶。另一项研究由利比et al。37显示,损失的PLIN2PLIN2-null小鼠模型中防止食源性脂肪变性在西方饮食喂养,30周,效果似乎介导通过变更SREBP-1和SERBP-2通路。此外,据报道,miR-26a调节基因参与脂肪酸,胆固醇代谢和胰岛素信号等ACSL3,ACSL4,PKCδ,PKCθ,GSK3β,SERBF1,显示其至关重要的作用在预防2型糖尿病的发展,其中一些基因直接目标miR-26a和其他下游靶基因(24]。
一些研究在人类和动物指出生物标记物的氧化应激和脂质过氧化反应产品的招聘在非酒精性脂肪肝38- - - - - -40]。非酒精性脂肪肝通常是与线粒体异常相关,引发活性氧的形成(41,42]。活性氧过量的脂质积累诱发氧化应激和启动内质网(ER)压力(43]。麦克唐纳et al。44]表明,活性氧可以引发脂质过氧化和星状细胞的激活,导致炎症和纤维化。合拍,这项研究显示,miR-26a超表达显著降低MDA水平和增加与FFA TAC HepG2细胞治疗后。这miR-26a对脂质过氧化的影响以前解决(45]。
同样的,以前的在体外和在活的有机体内研究使用非酒精性脂肪肝动物模型显示ER应激的集约化和诱导细胞凋亡46,47]。展开的蛋白质的积累糖分会让ER跨膜信号传导蛋白开始他们的反应。这些蛋白质包括激活转录因子6 (ATF6),inositol-requiring酶(IRE-1α),PKR-like ER激酶(活跃)以及proapoptotic转录因子或C / EBP同源,激活IRE-1α(48,49]。
有趣的是,与之前的研究(50,51),miR-26a过度凋亡分数降低压力和ER基因表达的关键标志蛋白IRE-1α和proapoptotic蛋白质切。与此同时,这些标记miR-26a抑制后被逆转。
miR-26a的预防作用可能与PKC的监管效果δ。目前的研究证实了之前报道的角色miR-26a下调PKCδ(24,52]。
此外,我们的研究结果认为miR-26a过度表达下调炎症标记的信使rna表达水平il - 6和纤维发生的标记TGFβ1和TGFβ2。在达成协议,前研究表明miR-26a抑制等炎症介质的产生il - 6和IL-17虽然减两下纤维发生在体外和在活的有机体内条件(45,53]。
此外,它已经表明,有一个在自噬流量改变肝脏孤立的人类患者和非酒精性脂肪肝的小鼠模型(54,55]。目前的数据显示,miR-26a过度诱导自噬通量upregulation体现的BECN1和LC3信使rna表达水平的差别,对这些基因的mRNA的表达自噬抑制剂TAB3和POLR3G。这些结果与汉族等描述的研究。56)显示的效果miR-26a通过诱导自噬在改善酒精肝脂肪变性。
总之,这项研究表明,miR-26a减毒甘油三酯积累通过抑制脂肪生成的基因,TG合成、存储和自噬的诱导。此外,miR-26a提供保护作用对氧化应激,炎症,纤维发生,FFA加载HepG2细胞诱导细胞凋亡。最后,需要进一步研究在活的有机体内研究和临床试验支持使用miR-26a NAFLD的管理和预防。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
确认
这项工作的启动资金支持部分药用化学和分子药理学、普渡大学、美国、埃及和文化事务和任务部门。