文摘

肺纤维化(PF)是一种危及生命的间质性肺病。在这项研究中,我们试图揭示高机动组框之间的作用方式1 (HMGB1)和α光滑的肌肉肌动蛋白(αsma)和吉非替尼的保护作用引起的肺纤维化的博来霉素气溶胶在老鼠身上。的机制研究中,肺组织被收获两周后检测HMGB1的coexpression和建模αsma免疫组织化学和免疫荧光染色。Protein-DNA交互使用下拉试验研究分析了HMGB1和之间的关系αsma。吉非替尼治疗研究中,老鼠被分为三组:磷酸盐(PBS)对照组,接受PBS PF集团和gefitinib-treated PF。强饲法吉非替尼或PBS(20毫克/公斤/天)进行博来霉素治疗两周后到老鼠牺牲。肺和血液样本收集评估组织学变化,氧化应激,氮氧化物和表达,HMGB1,表皮生长因子受体,MAPKs AP-1和NF -κB确定疗效和相关的分子机制。结果显示coexpression高αsma和HMGB1肺间质纤维化的细胞。dna蛋白质下拉分析证明HMGB34367作为小说的转录因子αsma启动子和参与肺纤维化的最终发展。第二,吉非替尼可以显著降低肺纤维化的变化和MDA水平,恢复T-AOC水平。与此同时,吉非替尼也可能减少NOX1/2/4, HMGB1, p-EGFR, p-ERK, p-JNK p-P38 p-NF -κB、p-c-Jun p-c-Fos表达水平在肺纤维化。目前的研究表明,吉非替尼可以透过HMGB1减轻肺纤维化/ NOXs-ROS / EGFR-MAPKs-AP-1 / NF -κB信号bleomycin-induced肺纤维化。

1。介绍

特发性肺纤维化(IPF)是一种慢性间质性肺疾病致死率高、致命的预后和缺乏有效的医学治疗(1,2]。IPF的病理特征主要包括肺实质破坏的矩阵和替代纤维组织(3,4]。IPF的发展最终导致肺功能下降和呼吸衰竭、诊断后平均生存只有2 - 3年(5]。传统的药物只有对这种疾病的边际效应(6]。的细节IPF的机制也不完善,这是一个极端的IPF的缺乏有效的疗法。

一个可能的机制参与IPF的激活α光滑的肌肉肌动蛋白(αsma)。高的表达αsma是伴随着更多的胶原沉积,表明更严重的肺纤维化(PF) [7]。负责理解机制αsma激活是一个潜在的方法来确定纤维化的发病机制。高机动组框1 (HMGB1)是一种高度保守的DNA-shepherding蛋白质,可以把细胞质和细胞外空间细胞激活期间,受伤或死亡(8]。它已经表明,HMGB1可能促进的表达αsma纤维变性的疾病(9]。详细的行动HMGB1与模式α然而,sma在肺纤维化尚未完全解释。另一种机制参与肺纤维化的激活表皮生长因子受体(EGFR)。表皮生长因子受体被认为是调节患者和啮齿动物的肺组织肺纤维化(10- - - - - -12]。吉非替尼,一个EGFR-tyrosine激酶抑制剂(EGFR-TKI),有能力抑制成纤维细胞增殖,因此减少胶原蛋白和细胞外基质(ECM)沉积在肺纤维化13,14]。然而,这种抑制作用背后的具体机制尚未明确。氧化应激是另一个主要病变在肺纤维化的发展15]。之前的研究表明,博来霉素政府可能会增加氧化应激通过增加一氧化氮合酶的生产和NADPH氧化酶(NOX)通过下游增殖蛋白激酶的磷酸化表达(MAPKs) [16]。抑制氧化应激和抗氧化能力的增强可以减轻肺纤维化(17]。

因为吉非替尼在肺纤维化的潜在影响和机制尚未充分研究,本研究的目的是(1)检测HMGB1之间的作用方式αsma在肺纤维化和(2)研究机理和产生吉非替尼治疗肺纤维化的影响。

2。材料和方法

2.1。毒品来源

盐酸博来霉素(BLM)是购自浙江Haizheng制药有限公司和吉非替尼购买从阿斯利康(美国)。其他化学药品和试剂标准商业来源获得。

2.2。Bleomycin-Induced肺纤维化小鼠模型

SPF女性KM小鼠(20 - 25克)从南方医科大学动物中心购买(广州)。肺纤维化是由气管内的气溶胶吸入3 U /公斤的博来霉素使用微灌溶解于0.10毫升的生理盐水雾化设备。磷酸盐(PBS)控制老鼠( ,PBS组)收到同样体积的气管内的气溶胶吸入PBS。gefitinib-treated老鼠( BLM +通用电气集团)被填喂法吉非替尼治疗的剂量20毫克/公斤/天博来霉素后溶解于0.20毫升的生理盐水。老鼠接受pbs ( ,BLM组)收到同样体积的PBS博来霉素后,填喂法管理。在三组老鼠都牺牲了两周治疗后,肺和血液样本组织学和生化研究分别处理。动物实验动物保健机构委员会的批准。给出了详细的实验过程图1。


图1
本研究的实验过程。
2.3。组织学研究
2.3.1。苏木精和伊红和马森的三色的染色

组织学检查,肺部缓冲福尔马林固定在10%,与苏木精和伊红染色())和马森的三色的。组织学分级是由三个有经验的病理学家使用盲法半定量的评分系统。肺部炎症和纤维化的严重程度得分根据方法描述Mikawa et al。18)和阿什克罗夫特et al。19),分别。

2.3.2。免疫组织化学(包含IHC)

免疫组织化学染色法进行识别的表达和位置αsma和HMGB1的肺纤维化。抗体用于研究反αsma(1: 100)和anti-HMGB1(1: 200)抗体(圣克鲁斯生物技术公司,CA)在PBS稀释。幻灯片deparaffinized和治疗3% H2O2在H2O淬火内源性过氧化物酶活性。αsma和HMGB1染色是在4°C一夜之间,其次是接触anti-mouse二级抗体60分钟。Diaminobenzidine (DAB) (Maxim-Bio、福州、中国)作为发色体。使用徕卡显微观察了DM LB2显微镜配备了数码相机。

2.3.3。免疫荧光染色

免疫荧光染色的αsma和HMGB1的部分被使用蛋白酶K,然后阻塞正常驴血清稀释10%包含0.1% Triton PBS。部分与多克隆兔反被孵化αsma(1: 200)和anti-HMGB1(1: 300)抗体(圣克鲁斯生物技术公司,CA)在PBS稀释。组织部分被洗和随后孵化Alexa荧光团488海里驴anti-rabbit抗体在1:500年在PBS 90分钟在室温和复染色与4 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)。图像是用一个倒置的徕卡CTR 6000荧光显微镜和合并使用徕卡应用程序套件先进的荧光软件(徕卡微系统公司(英国)有限公司米尔顿凯恩斯,英国)。

2.4。dna蛋白质活动分析

总共3.8 kb的双链DNA片段对应鼠标αsma启动子片段−1070 + 2582,包括第一外显子和内含子(基因库:U63129和M57409),从VSMP8放大质粒PCR。质粒是一个慷慨的礼物从艺术教授斯特拉赫(多萝西·m·戴维斯心肺研究所,哥伦布,美国)。正向引物5 -AGCCGTGGGAGCGTGAGT-3 与生物素分子的N终端;反向引物是5 -AGACAGCGAGCGAGAAGC-3 。接下来,50μ克生物素化的DNA片段被结扎表面50μL kilobaseBINDER streptavidin-coated磁珠的工具包(Dynal、芬兰)形成DNA-bead复合物根据制造商的协议(20.]。肺核提取物BLM -或接受PBS肺组织透析PBS和稀释3μ克/μl .接下来,30μ添加到250克蛋白质μL的dna蛋白质绑定缓冲(EDTA 20 mM玫瑰,1毫米,10毫米(NH)4)所以41毫米德勤,Tween20 0.2%, 30毫米氯化钾,50 ng /μL聚(d (IC)), 5 ng /μL聚赖氨酸,Ph值7.6)与DNA混合亲和力珠子和孵化辊在室温下30分钟。在受到磁分离,上层的丢弃,和珠子洗再悬浮于500年的三倍μL绑定缓冲。蛋白质与DNA结合亲和力珠子被筛选了20μL 0.25氯化钾溶液。上面提到的所有操作都是按照协议的dna结合蛋白质净化设备(罗氏公司、德国)和PBS和样本BLM老鼠同时进行了研究。筛选了蛋白质接受了sds - page电泳和EMBL银染色显示肺核蛋白质绑定的αsma启动子在体外。显示的不同蛋白质乐队是由与克BLM -和接受pbs样本,从凝胶无菌刀进行进一步的液相色谱-光谱法(质/ MS)分析北京华达Jierui生物技术有限公司(中国,北京)。

2.5。RNA制备和逆转录酶聚合酶链反应(rt - pcr)

RNA提取的左肺叶从所有三组小鼠使用试剂盒试剂(英杰公司、美国)根据制造商的建议。肺组织包括HMGB34367,αsma、NOX1/2/4和β肌动蛋白mRNA转录通过rt - pcr检测。PCR产品大小分级在1.5%琼脂糖凝胶和溴化乙锭染色的可视化。循环条件(1)94°C 5分钟;(2)30 40秒周期在94°C, 55°C 40秒,40秒和72°C;和(3)最后一个扩展步骤在72°C 10分钟。介绍了PCR引物如下:αsma,正向引物5 -ACCCAGATTATGTTTGAGACC-3 和反向引物5 -CCGTCAGGCAGTTCGTAG-3 ;HMGB34367,正向引物5 -ATGGGCAAAGGAGATCCTA-3 和反向引物5 -CCTCATCATCTTCCTCTTC-3 ;NOX1,正向引物5 -TGGCATCCCTTCACTCTGA-3 和反向引物5 -GGCACGCTGGAATTTGTAC-3 ;NOX2,正向引物5 -CCCTCCTATGACTTGGAAATG-3 和反向引物5 -TCCGTCCAGTCTCCCACAATA-3 ;NOX4,正向引物5 -AGACAAATGTAGACACTCACC-3 和反向引物5 -CACAATAAAGGCACAAAGGT-3 ;和β肌动蛋白,正向引物5 -AGGGAAATCGTGCGTGACATCAAA-3 和反向引物5 -ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTGA-3 。

2.6。Dihydroethidium(她)荧光测量

ROS水平在肺部被她荧光评估。肺组织被存储在ethanol-dry冰−80°C。串行肺部分(5μ米厚度)进行,在孵化(10更易/ L, 30分钟,37°C)。肺组织荧光(采用激励在490 nm,排放在610海里)被使用荧光显微镜观察。

2.7。测量的MDA和T-AOC

malonaldehyde (MDA)和总抗氧化能力(T-AOC)水平在血清和肺组织被发现通过使用商业活动测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

2.8。免疫沉淀反应和酪氨酸磷酸化化验

肺蛋白质提取使用•瑞帕溶解产物。等量的蛋白质受到8% sds - page和分离蛋白electrophoretically转移到聚乙二烯二氟化物膜。的污点被5%的脱脂奶粉,孵化与anti-NOX1/2/4一夜之间,anti-HMGB1, anti-EGFR, anti-ERK /物/ P38 anti-NF -κB / c-Jun / c-Fos、anti-phosphor-EGFR anti-phosphor-ERK /物/ P38 anti-phosphor-NF -κB / c-Jun / c-Fos和反β肌动蛋白抗体(圣克鲁斯生物技术公司,CA)和治疗兔anti-mice免疫球蛋白与碱性磷酸酶共轭。发现蛋白质污点和发射极耦合逻辑分析了灰度使用Gel-Pro分析仪系统。

2.9。统计分析

GraphPad Prism 5.0软件(版本5.0,GraphPad软件公司,拉霍亚,CA,美国)是用于统计分析。所有的数据都表示为平均值±标准偏差(平均数±标准差)。学生的t以及(2组)和(或)单向方差分析(多个组)是用于检测差异。 值小于0.05被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。表达和位置αsma和HMGB1 Bleomycin-Induced肺纤维化

他走时,马森的三色的染色采用检查肺纤维化模型的精度和效率。)结果表明,BLM政府诱导焦纤维化病变主要在增厚或增厚的胸膜下区牙槽间的隔膜(数字2(一)和2(e))。类似的结果是马森的三色的染色(观察到数据2(b)和2(f))。包含IHC结果显示,αsma和HMGB1 BLM-treated肺组织中高度表达。细支气管周围的间质细胞的BLM-treated肺积极染色了αsma(图2(c)和2(g))和HMGB1(数字2(d)和2(h)),尤其在终端细支气管周围的细胞。免疫荧光染色显示相同的colocalizationαsma和HMGB1在一些间质细胞,按照IHC结果(图3)。


图2
αsma和HMGB1在肺组织中高度表达受肺纤维化的影响。肺部分老鼠收集在气管内的后14天博来霉素(BLM)或PBS管理和沾他走时,马森的三色的,和免疫组织化学染色(放大200倍)。

图3
HMGB1和αsma coexpressed一些间质细胞。免疫荧光染色高机动组框1 (HMGB1)(绿色)和蛋白质α光滑的肌肉肌动蛋白(αsma)(红色)和原子核与DAPI染色(蓝色)在纤维化肺组织进行。黄色荧光染色(合并)表示,一些积极costained HMGB1和间质细胞αsma(放大400倍)。
3.2。HMGB34367增加了组装αsma在肺纤维化的条件下

分辨转录蛋白成员组成的复杂的激活αsma启动子,我们开发了一个系统净化这些结合蛋白。结果表明,有一个特点增加20 kDa BLM组蛋白的小鼠相比,PBS组(图4(一)。HMGB34367很可能增加其组装αsma在肺纤维化的条件下与生理条件。接下来,我们检查的mRNA表达HMGB34367和αsma BLM-treated肺。rt - pcr分析表明,转录水平的αsma和HMGB34367 BLM治疗后显著增加(图4 (b))。

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图4
HMGB34367参与直接的监管αsma表达与肺组织中高度表达的是肺纤维化的影响。肺组织收集2周后博来霉素(BLM)管理。肺核提取BLM -或接受pbs的肺部组织。(a) DNA-nuclear蛋白下拉方法用于检测核蛋白质的绑定α光滑的肌肉肌动蛋白(αsma)启动子。20 kDa蛋白质(HMGB34367)扩大其绑定的数量αsma在BLM的条件下启动子。(b) mRNA的表达αsma和HMGB34367增加肺匀浆后BLM曝光。
3.3。吉非替尼降低博来霉素引起的肺纤维化

BLM组小鼠的肺组织显示著名peribronchiolar和间质炎症细胞浸润。广泛的细胞增厚牙槽间的隔膜,间质水肿,间质细胞与成纤维细胞的外观,增加和间质胶原沉积可以检测到马森的三色的染色。尽管多病灶的实质病变仍出现在BLM +通用电气组小鼠肺组织,当地的整合是小于BLM组。减少水肿和胶原沉积,隔不断扩大,和更少的集群的肺部炎症细胞观察BLM +通用电气集团(图5(一个))。肺羟脯氨酸(胶原沉积的一个标志)水平增加了约三倍BLM组老鼠比PBS组(696.34±87.21μ组织和234.52±21.67 g / gμg / g组织, )。吉非替尼治疗显著降低羟脯氨酸水平(351.28±32.93μ组织和696.34±87.21 g / gμg / g组织, )(图5 (b)。与此同时,半定量的炎症(图的得分5 (c))和纤维化(图5 (d))显示减少水平BLM +通用电气组相比,BLM组。

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图5
吉非替尼治疗肺纤维化的严重程度下降。肺组织从吉非替尼(Ge)治疗和接受pbs肺纤维化小鼠收集两周后博来霉素(BLM)管理。(一)肺组织的病理发现染色)和马森的三色的(放大200倍)。(b)肺羟脯氨酸含量显著减少了吉非替尼治疗。半定量的严重性和区段的得分(b)炎症和纤维化(c)是减少在BLM +通用电气组较BLM组。所有数据都表示为均值±SD, 。 对BLM组, 对BLM组。
3.4。血清MDA和T-AOC水平

oxidation-antioxidant活动中的不平衡是一个重要的肺纤维化的发病机制。先前的报道表明,过度氧化应激在肺纤维化的发病机制中起着重要作用[15]。她进行了荧光测量肺组织的ROS水平。荧光强度的一个重要衰减BLM +指出通用电气组相比,BLM组(数字6(一)和6 (b))。MDA是脂质过氧化的代谢物,这可能代表了组织细胞的氧化损伤程度。T-AOC反映小鼠抗氧化能力的水平。博来霉素产生显著增加血清MDA水平比PBS组(66.70±4.46 nmol /毫升和26.92±10.86 nmol /毫升, ),而吉非替尼治疗显著降低MDA水平(39.16±14.15 nmol /毫升和66.70±4.46 nmol /毫升, )(图6 (c))。血清T-AOC水平有一个逆趋势与MDA的水平相比,和吉非替尼治疗后显著地抑制减少T-AOC博来霉素管理局(9.78±2.94 U /毫升和2.47±0.44 U /毫升, )(图6 (d))。MDA的水平(图6 (e))和T-AOC(图6 (f))在肺组织中也显示同样的趋势。这些结果表明,吉非替尼可以缓解过度的氧化应激和提高抗氧化能力在肺纤维化。

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图6
吉非替尼治疗缓解肺纤维化的氧化应激。肺组织从吉非替尼(Ge)治疗和接受pbs肺纤维化小鼠收集两周后博来霉素(BLM)管理。(一)她荧光被用来检测肺组织中活性氧(放大400倍)。(b)她荧光强度计算。吉非替尼治疗显著降低血清MDA (c)和小鼠的血清(d) T-AOC增加。MDA的水平(e)和(f) T-AOC三组肺组织显示相同的结果。所有数据都表示为均值±SD, 。 对BLM组, 对BLM组。
3.5。吉非替尼的基因和蛋白质水平降低NOX1/2/4由博来霉素诱导

氮氧化物酶的激活细胞内活性氧的主要来源的生产,和NOX1/2/4被认为起着关键作用在肺纤维化的发展21,22]。在目前的研究中,肺组织NOX1/2/4老鼠暴露在博来霉素的基因和蛋白质水平都比PBS组增加。博来霉素后小鼠接受吉非替尼治疗管理显示显著减少NOX1/2/4基因(数字7(一)和7 (b))和蛋白质(数据7 (c)和7 (d))的水平。这些发现证实NOX1/2/4过多的活性氧产量发挥了重要作用在肺纤维化,和高表达可能是被吉非替尼治疗。

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图7
吉非替尼治疗减少基因和蛋白质表达的NOX1/2/4肺组织肺纤维化的影响。肺组织从吉非替尼(Ge)治疗和接受pbs肺纤维化小鼠收集两周后博来霉素(BLM)管理。(一)NOX1/2/4基因表达式被逆转录酶聚合酶链反应(rt - pcr)。(b)的相对信使rna折叠计算。(c) NOX1/2/4蛋白表达被免疫印迹识别。(d)的相对密度计算。NOX1/2/4基因和蛋白质表达后的肺组织明显增加了BLM管理。然而,吉非替尼治疗显著地抑制NOX1/2/4表达式。所有数据都表示为均值±SD, 。 对BLM组。
3.6。吉非替尼显著抑制HMGB1表达和磷酸化EGFR-MAPK信号转导

我们测量了HMGB1、总量和磷酸化表达EGFR和MAPKs纤维化肺免疫印迹。结果表明,吉非替尼显著地抑制HMGB1表达,EGFR磷酸化,随后,ERK的磷酸化,P38和物(图8)。

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图8
吉非替尼治疗减少HMGB1表达和磷酸化表达EGFR和MAPKs肺组织肺纤维化的影响。肺组织从吉非替尼(Ge)治疗和接受pbs肺纤维化小鼠收集两周后博来霉素(BLM)管理。(一)HMGB1的表达,总,EGFR / ERK的磷酸化/ P38 /物在肺组织中被免疫印迹检测。(b)的相对密度计算。吉非替尼治疗显著地抑制HMGB1蛋白激活和EGFR磷酸化和MAPKs诱导小鼠BLM政府。所有数据都表示为均值±SD, 。 对BLM组。
3.7。吉非替尼AP-1的激活和NF -下降κB

先前的研究表明,AP-1和NF -κB可以通过ERK的磷酸化,激活物和P38 [23]。激活AP-1和NF -κB可以促进生产的促炎因子和肺纤维化(profibrotic因素24,25]。目前的研究表明,政府的NF的表情——吉非替尼没有影响κB, c-Jun, c-Fos BLM-induced肺组织。然而,NF -的磷酸化κB c-Jun和c-Fos都按照表达的增加显著地抑制MAPKs吉非替尼治疗后(图9)。

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图9
吉非替尼治疗减少磷酸化的NF -κB c-Jun和c-Fos肺组织肺纤维化的影响。肺组织从吉非替尼(Ge)治疗和接受pbs肺纤维化小鼠收集两周后博来霉素(BLM)管理。(a)的总磷酸化NF -κB c-Jun和c-Fos肺组织被免疫印迹检测。(b)的相对密度计算。吉非替尼治疗显著地抑制NF -的磷酸化κB、c-Jun c-Fos诱导小鼠BLM政府。所有数据都表示为均值±SD, 。 对BLM组。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们演示了HMGB1和之间的关系αsma和吉非替尼的疗效bleomycin-induced在小鼠肺纤维化。首先,我们证明,HMGB1蛋白家族中的一员(HMGB34367)可以作为小说的转录因子αsma启动子和参与肺纤维化的过程。第二,我们发现吉非替尼是有效地降低小鼠肺纤维化,可能与HMGB1 / NOXs-ROS / EGFR-MAPKs-AP-1 / NF -κB信号(图10)。


图10
博来霉素引起的吉非替尼治疗肺纤维化的示意图。

首先,我们集中在HMGB1的角色在肺纤维化的发展。HMGB1纤维化肺组织中高度表达,并抑制HMGB1可能大大减轻小鼠肺损伤。科学家主要原因这一现象作为一种重要的炎症因子,其作用和炎症是肺纤维化的关键病理过程(26]。然而,HMGB1的详细分子机制仍然未知。免疫组织化学和免疫荧光结果显示,HMGB1被位于一些间质细胞中αsma染色也是积极的。rt - pcr分析还表明,mRNA的表达αsma提高与增强的mRNA的表达HMGB34367 BLM治疗后。此外,我们发现HMGB34367参与的规定αsma表达通过使用DNA-nuclear蛋白质活动方法。HMGB34367是20 kDa蛋白质属于一个特定的蛋白质组,其中大部分与HMGB1有相同的结构。HMGB34367的全长序列是相同的1到178氨基酸地区HMGB1蛋白,其中包括两个DNA结合域,箱子和箱B,但缺乏酸性179 - 215 C末端尾巴HMGB1的地区。高度保守的核蛋白质,HMGB1可能稳定核小体和允许弯曲的DNA促进一些基因转录27]。综上所述,我们的研究结果表明,HMGB1可能参与肺纤维化主要由(i)消化成不同形式和促进αsma基因活化转录激活和(2)被激活单核细胞和巨噬细胞分泌的行为作为炎性细胞因子。

接下来,我们研究了吉非替尼对肺纤维化的影响。事实上,吉非替尼的潜力减弱肺纤维化仍然是有争议的。辛苦地等人证明了吉非替尼可以明显减轻小鼠肺纤维化减少表皮生长因子受体表达和扭转形成纤维化小鼠(14]。随后,Ishii等人发现,所有不同的口服剂量(20毫克/公斤,90毫克/公斤,和200毫克/公斤)的吉非替尼可以抑制小鼠肺纤维化,和大剂量的吉非替尼不会诱发或加重肺纤维化(13]。然而,铃木等人,李等人表明,吉非替尼治疗能够明显加重肺纤维化小鼠和大鼠(28,29日]。此外,严重的肺间质性疾病与吉非替尼治疗的报道在一些日本患者中,这意味着吉非替尼可能会诱发或加重这种疾病(30.,31日]。事实上,有几个可能的解释的不同的结果。首先,它可能与小鼠或大鼠的不同品种有不同的对吉非替尼的反应,因为他们的基因特征。其次,吉非替尼的不同剂量是重要的因素导致了矛盾的结果。高剂量的吉非替尼可能导致毒性超过治疗。第三,表皮生长因子受体的表达和激活不同的品种的啮齿动物和他们的反应不同剂量的吉非替尼进行了直接影响MAPK信号可以促进或抑制肺纤维化。第四,政府的时间以及吉非替尼在管理实验的方法也会影响结果。此外,最近二期吉非替尼的临床试验在日本宣布没有肺纤维化的发病率差异使用吉非替尼和其他化疗的患者,建议吉非替尼可能不是肺纤维化的原因(32]。在我们之前的一系列研究中,我们发现吉非替尼明显抑制肺胶原蛋白沉积和α博来霉素诱导的纤维sma表达小鼠(33,34]。

吉非替尼的阐明antifibrosis机制,我们研究了氧化和抗氧化水平在肺纤维化。吉非替尼完全抑制MDA的高浓度博来霉素引起的,在肺纤维化小鼠恢复T-AOC能力。确实是好,氮氧化物的主要来源是ROS生产,调节各种肺部疾病,包括IPF和肺动脉高压(35,36]。有七个成员的氮氧化物家庭中发现的哺乳动物:NOX1, NOX2, NOX3, NOX4, NOX5 Duox1, Duox2。其中,NOX1、NOX2 NOX4已经被证明有助于组织纤维化(37,38]。NOX4 mRNA和蛋白表达在IPF患者肺成纤维细胞,调节相关αsma及胶原I (α1)mrna (39]。NOX4-deficient老鼠免受bleomycin-induced肺纤维化经过调制的上皮细胞死亡在活的有机体内和减少TGF -β从细胞凋亡1-mediated ROS生产和保护40]。NOX1和NOX2也报道导致组织纤维化在nonpulmonary器官系统。HMGB1促炎因子,也与氧化应激(8]。目前的研究表明,吉非替尼也可能抑制HMGB1表达。然而,怎么会发生这种事,吉非替尼抑制HMGB1 EFGR同步?事实上,HMGB1可能直接信号MAPKs激活NF -κB通路(41];此外,HMGB1也可以间接地通过表皮生长因子受体激活MAPK信号通路(42]。大量的证据表明,MAPK通路是表皮生长因子受体下游信号级联,它参与肺纤维化的发展(43]。先前的研究表明,吉非替尼抑制胶原蛋白的表达我和III mrna的transactivation通过阻断EGFR和随后激活ERK1/2在肾纤维化44]。在血管平滑肌细胞,表皮生长因子受体增加产量的一氧化氮合酶和氧化氮酶通过下游磷酸化ERK和AKT的表达45]。我们目前的数据暗示,吉非替尼抑制肺纤维化在活的有机体内通过HMGB1 / NOXs-ROS / EGFR-ERK /物/ P38通路。

NF -κB和AP-1下游的重要转录因子是ROS和MAPKs46]。NF -κB信号转导途径是一个重要的途径参与炎症、免疫、细胞增殖和细胞凋亡47]。先前的研究已经表明,在急性肺损伤激活NF -κB可以诱导促炎介质的生产;相反,抑制NF -κB激活显著减轻肺损伤(24,48]。AP-1, redox-regulated转录复合体(由c-Fos和c-Jun)被激活MAPK家庭成员通过提高他们的下游转录因子包括Elk-1 c-Jun, ATF2和分子,进而规范c-Fos和c-Jun的表达式。AP-1 MAPKs蛋白质可以被激活和增强周期性49]。AP-1和NF -κB可以促进生产的促炎介质,在肺纤维化profibrotic因素。在目前的研究中,AP-1和NF -κB参与肺纤维化的发展,这种进步是由活性氧的磷酸化和表达,HMGB1, MAPKs。

尽管许多实验研究揭示吉非替尼的效果和机理,对肺纤维化的发展,缺点也存在。首先,它是一个动物研究,并从临床试验和更多的证据在体外迫切需要研究。第二,我们没有进行淘汰赛,击倒,或超表达研究,受限于我们的实验条件。我们只使用rt - pcr、组织学检查和免疫印迹研究详细的分子机制。在未来,在活的有机体内研究利用相关基因敲除或可拆卸的老鼠一样在体外研究利用主肺细胞和成纤维细胞应该启动验证机制。

5。结论

总之,全面研究了分子HMGB1的角色,oxidation-antioxidant的参与不平衡,及相关分子转导下游bleomycin-induced吉非替尼治疗肺纤维化的机制。这些结果表明,HMGB1造成了肺纤维化和吉非替尼减毒bleomycin-induced胶原蛋白沉积和过度的氧化应激,主要通过抑制HMGB1 / NOXs-ROS / EGFR-MAPKs-AP-1 / NF -κB信号。目前发现有可能从根本上推进我们对肺纤维化的分子机制的理解,可能具有重要意义在设计新颖和创新的治疗方法针对肺纤维化。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

丽丽和林Cai参与行为的实验和撰写论文;他们同样都贡献给了工作。井巷郑参与的免疫组织化学、伟峰元参与免疫印迹的行为,和洁具胡锦涛参加了数据分析。Zhenhui郭和伟峰李提供实质性的建议在设计研究并协助劳动分工和修改。

资金

本研究由“广州市科技计划项目”的资助(批准号201607010310)和广东省自然科学基金(批准号2014 a030313596)。

确认

作者感谢所有那些参与或帮助这个研究项目。