文摘

与年龄有关的疾病,如神经退行性和心血管疾病的特点是增加氧化应激与自噬功能障碍有关。Oleuropein糖苷配基(OA),主要多酚中发现橄榄油,最近被描述为一个自噬诱导物和一个有前途的代理与神经退化。目前未知的OA能否有有利影响模型的心脏压力自噬功能障碍的特征。在这里,我们探讨OA的影响在心肌细胞过度的单胺oxidase-A(是)。这种酶,降解儿茶酚胺和5 -羟色胺,生成过氧化氢(H2O2),导致氧化应激,自噬流量封锁,和细胞坏死。我们观察到OA治疗中和的细胞毒性效应是通过自噬激活,增加显示的自噬空泡和autophagy-specific标记(Beclin1和LC3-II)。此外,自噬体和自吞噬泡的增加减少,表明autophagosome-lysosome融合,提出了一个自噬缺陷通量的恢复。最有趣的是,我们发现OA的能力赋予通过自噬诱导心脏保护涉及核易位和激活的转录因子EB (TFEB)。我们的数据提供了有力的证据,OA的有利影响,表明其潜在作为营养剂对涉及自噬功能障碍与年龄相关的疾病,包括心血管疾病。

1。介绍

预期寿命的增加一些落草增加与年龄有关的疾病,如神经退行性疾病的发病率和心血管疾病1]。心力衰竭(HF)是一种多因子的临床综合征的特点是不良心室重塑和氧化应激,这被认为是一个重要的决定因素的恶化心室功能障碍。事实上,ROS能直接氧化蛋白质参与收缩活动,因此损害心室功能(2,3]。尽管不同来源导致全球氧化应激,绝大多数细胞ROS来源于线粒体室(4,5]。除了呼吸链,类的酶称为单胺氧化酶类(人物形象),位于线粒体膜外,被认定为重大心脏来源的过氧化氢(H2O2),一个关键球员在心脏损伤的发病和进展6- - - - - -8]。人物形象是FAD-dependent酶中发现两个亚型,是缺氧,不同的组织分布和底物特异性。是负责儿茶酚胺和5 -羟色胺的氧化脱氨基作用与生产相应的醛,H2O2和氨。虽然每个同种型的作用仍有待调查,许多最近研究表明,毛泽东的表达式和活动增加与年龄有关的慢性心脏疾病(2,4,8,9]。

心中,ROS也可以干扰质量控制机制通过阻断自噬和促进衰老和细胞凋亡10]。自噬是一种细胞内的过程,旨在为去除或回收降解细胞质组件11]。在分子水平上病理条件下,如高频的特点是受损的线粒体和错误折叠蛋白质的积累有害,可能由于自噬流量的障碍。在这样的条件下,自噬激活最初是作为一种生存机制,但在压倒性的应力条件下可以成为有缺陷,导致细胞损伤(12]。最近的研究调查了毛之间的联系,ROS,自噬在高频8,13]。Santin et al。13)报道,是过度活跃与重要的线粒体功能异常有关。事实上,是/ H2O2轴负面影响的消除和回收通过autophagosome-lysosome线粒体通路,导致心肌细胞死亡,最终高频。作者还报道,在增强是活动的条件,自噬流量和溶酶体功能的障碍是缺乏相关转录因子核易位EB (TFEB),主调节器autophagy-lysosomal通路中的基因。有趣的是,TFEB过度中和的有害影响是/ H2O2轴通过减少自噬小体积累和细胞坏死(13]。因此,恢复自噬缺陷现在看来作为一种重要的治疗策略的心血管疾病(14,15]。

几个小分子作为自噬调节器,如植物多酚、或自然化合物存在于水果和蔬菜,已经提出了他们的可能的治疗应用(16- - - - - -18]。其中,oleuropein糖苷配基(OA)是主要的酚在特级初榨橄榄油(EVOO)和来自其前体oleuropein (OLE)的活动β葡糖苷酶释放橄榄果实在粉碎[19)或出现在人类肠道粘膜(20.]。在EVOO OA的浓度范围从79到229毫克/公斤根据Servili et al。21),取决于不同的因素,如橄榄品种,成熟阶段收获,橄榄和地理起源。OA最近被描述为一个自噬激活和一个有前途的代理对神经退行性疾病在神经母细胞瘤细胞系和TgCRND8小鼠模型β沉积(22- - - - - -27]。这种转基因模型、食品补充剂与OA导致显著的蚀斑减少和改善认知能力恢复受损的自噬流量(27]。

基于高频的自噬过程的重要性,我们试图评估OA-induced自噬是否手术在心肌细胞和是否预防细胞损伤被毛/ H2O2轴。

2。材料和方法

2.1。材料

Oleuropein是从Extrasynthese(法国里昂)。DMEM(高葡萄糖+ GlutaMAX)火腿F-12、胎牛血清(的边后卫)和马血清Gibco买来,生活的技术。199年中,厄尔的盐、胰液素、明胶溶液,酚红(解决方案),Percoll,氯喹(CQ),和杏仁β糖苷酶来自Sigma-Aldrich。胶原酶(hystolyticum梭状芽胞杆菌从罗氏公司)。Ad-MAO-A腺病毒是如前所述[4]。RFP-GFP-LC3质粒是Addgene(剑桥,美国)。

2.2。Oleuropein Deglycosylation

Oleuropein deglycosylation由β葡糖苷酶进行根据Konno et al。28与一些细微的修改。简单地说,310年oleuropein 10毫米的解决方案μl 0.1钠磷酸盐缓冲剂,pH值7.0,和8.90 IU的孵化β(杏仁)糖苷酶在室温下过夜。反应混合物离心机在36580年 10分钟沉淀OA,然后溶解在二甲亚砜(DMSO)涡流和声波降解法。完成oleuropein deglycosylation证实了分析的上层清液中葡萄糖释放葡萄糖(香港)分析工具包(σ)。oleuropein和颗粒样品的质谱在DMSO溶液溶解,得到在ESI和消极的电离模式中,通过直接注入三重四极(TSQ量子热力学Finnigan),证实了实质性复苏的OA沉淀(补充图1),化学,对应异构体的混合物(数据未显示),也表现为Diamantakos et al。29日]。OA的数量获得克分子数相等的葡萄糖释放。50毫米OA原液在DMSO储存在−20°C和稀释立即使用前。

2.3。原代心肌细胞培养、Adenoviral转导和治疗

隔离的新生大鼠心室细胞依照执行指导实验室动物保健和使用的。从新生大鼠心室收集2 - 3天又老又受到连续进行与II型胶原酶/胰液素如前所述[30.]。肌细胞浓缩是由不连续Percoll梯度离心,和电镀的镀合成细胞悬浮介质(199年68% DMEM + GlutaMAX, 17%中,10%马血清,5%的边后卫,和1.0%的抗生素)到gelatin-coated文化菜(13]。隔离后的第二天,介质被完全取代新鲜的介质(HS火腿F-12, 10%的边后卫,10%,1.0%的青霉素、链霉素)。

Adenoviral感染replication-deficient Adenoviral向量表达是如前所述执行(13]。Ad-MAO-A-transduced心肌细胞是治疗是衬底酪胺(酪氨酸,500μ米)6 h评估的影响是激活或使用酪氨酸的OA(100前2 hμ米)的其余4 h文化传媒(后处理)。

2.4。SiRNA-TFEB转染

心肌细胞与TFEB siRNA沉默寡核苷酸(SMARTpool ON-TARGETplus, Dharmacon)交付使用DharmaFECT Duo转染试剂(Dharmacon)。后的第二天,是腺病毒的细胞转导。在48 h postsilencing,心肌细胞刺激6 h仅与酪氨酸(500μ与OA(100米)或posttreatedμ米2 h后酪氨酸刺激。细胞转染核争夺(Scr)被用作控制。

2.5。MTT试验

这些细胞被孵化3 h在肝癌和0.5毫克/毫升溶液在37°C。在可行的细胞,MTT转化成紫色甲瓒晶体不溶于水溶液。然后,MTT的解决方案是吸气和200年μ信用证的DMSO溶液添加到甲瓒晶体溶解。蓝色甲瓒吸光度测量在570纳米光谱光度测量的多平台读者(Bio-Rad)。

2.6。细胞内ROS生成

在心肌细胞ROS生成测量使用ROS-sensitive DCFDA (2 ,7 二乙酸-dichlorodihydrofluorescein)荧光探针如前所述13]。

2.7。LDH测定

培养基中乳酸脱氢酶(LDH)释放测量作为一个索引使用LDH的细胞坏死细胞毒性试验设备(BioVision)根据制造商的指示。

2.8。荧光显微镜

自噬小体进行染色的Cyto-ID®自噬检测工具(恩佐生命科学)根据制造商的指示。活细胞进行分析,荧光显微镜,荧光强度在488 nm量化使用ImageJ软件(RSB)。自噬流量评估,质粒转染GFP-RFP-LC3构造进行了使用Lipofectamine 2000试剂(技术)。这种结构允许自噬体(GFP的识别+,招标书+、黄色)和自吞噬泡(GFP−,招标书+,红色)由于GFP荧光是失去了在溶酶体酸化而RFP荧光保持稳定。根据实验的细胞治疗协议,5分钟4.0%甲醛溶液固定,水洗,并通过荧光显微镜分析。

细胞免疫荧光研究在4.0%多聚甲醛固定,再洗,孵化TBS / 0.2% Triton在室温下10分钟。然后,细胞被封锁TBS / 3.0% BSA在室温下1 h和孵化隔夜anti-TFEB抗体(Bethyl实验室)稀释1:400年屏蔽解决方案。免疫反应是显示使用Alexa萤石546山羊anti-rabbit(稀释1:1000)。洗后,幻灯片和安装中包含安装用盖玻片DAPI核标签和分析TFEB核易位。

2.9。免疫印迹

心肌细胞细胞溶解在缓冲区里帕(10毫米三pH值7.4,150毫米氯化钠,特里同x - 100 1.0%, 1.0%钠脱氧胆酸盐,和0.1%十二烷基硫酸钠),和35μg解决了蛋白质sds - page,转移到PVDF膜(Trans-Blot涡轮增压输送系统,Bio-Rad),抗体和免疫印迹隔夜以下:anti-LC3B (CST没有。2775年,1:1000稀释)或anti-Beclin1 (CST没有。3495年,1:1000稀释)。然后,这些墨迹是孵化1 h与特定的二级抗体(1:10000年,山羊anti-rabbit和山羊anti-mouse,分子探针,生活技术)。β肌动蛋白(Sigma-Aldrich)被用来加载控制。免疫反应性的乐队是由化学发光检测与Bio-Rad ChemiDoc XRS+相机。相对密度量化使用图像实验室4.0软件(Bio-Rad)。

2.10。实时聚合酶链反应

细胞治疗的100μM OA在完全培养基30分钟。RNA提取从心脏心室是由列亲和纯化试剂盒,Courtaboeuf,法国。互补脱氧核糖核酸合成使用上标二世rt - pcr系统(英杰公司)与随机五个一。实时PCR进行StepOnePlus系统(应用生物系统公司、Courtaboeuf、法国)在96 -孔板与特定的引物和SYBR绿色混合(Eurogentec、激怒、法国)。引物序列如下:ATP6V1-F: TGTCTCTGGAGTGAATGGTCC;ATP6V1-R: TGCCCACTTCTTTTTGTGCC;Lamp1-F: TGACCATTGTGCTCTGGGAC;Lamp1-R: GGGAAGGTTGATCCTGTGGG;p62 (Sqstm1) - f: CCATCAGAGGATCCCAATGT;和p62 (Sqstm1) - r: CGCCTTCATCCGAGAAAC。 Data were normalized using the following primers: GAPDH-F: TCTCTGCTCCTCCCTGTTCTA and GAPDH-R: TCCGATACGGCCAAATCCGTT.

2.11。统计分析

结果表示为 。使用学生的实验组比较t以及单向或双向方差分析,在适当的时候。的值 被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。OA诱发心肌细胞自噬

OA已被描述为一种强有力的和快速诱导的自噬在神经母细胞瘤细胞25]。因此,我们试图探讨OA的行为是否以类似的方式在心肌细胞。新生大鼠心肌细胞暴露在100年μM OA,集中缺乏细胞细胞毒性6 h,最长的孵化时间用于我们的实验,验证了MTT和LDH化验(补充图2)。在这个浓度,OA没有修改基线氧化状态测量与DCFDA荧光(补充图2)。有趣的是,1 h与OA的治疗后,显著增加自噬puncta证明了使用Cyto-ID绿色染料荧光成像技术(图1(一))。因此,我们观察到两个自噬标记Beclin1(图1 (b))和LC3-II增加1小时OA刺激后,表明自噬(图的早期增强1 (c))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图1
OA诱发自噬在新生大鼠心肌细胞。(a)鼠新生儿心室细胞治疗OA (100μ米)1 h,自噬空泡沾Cyto-ID绿色(左面板)。核与赫斯特33342年复染色。比例尺20μm。右边的图小组代表量化的荧光强度( 独立实验;对于每一个实验,6场约15细胞被量化的条件)。(b, c)的免疫印迹分析Beclin1和LC3蛋白质进行心肌细胞蛋白提取与OA(100刺激后μ米)1 h。β肌动蛋白表达作为加载控制。图表代表量化Beclin1 /β肌动蛋白( )和LC3-II / LC3-I比率( )通过测量微密度分析。 , , 与CTRL(控制)。
3.2。OA刺激增强心肌细胞自噬流量

自噬空泡的存在并不代表完成自噬在autophagosomal成熟但也可以代表一块;因此,我们检查了不同步骤的心肌细胞的自噬通量响应OA。这一目标,细胞转染RFP-GFP-LC3质粒,导致转染效率约30%,与100年和治疗μ不同时期M OA (1 h、3 h,或6 h)和双重免疫荧光成像(图执行2(一个))。1 h与OA的治疗后,我们观察到在转染细胞自噬小体的数量增加(黄色puncta),这是更明显在3 h。在6小时,我们注意到自噬小体的数量,同时减少自吞噬泡(红色puncta)显著增加。这一结果表明,OA刺激心肌细胞自噬流量。我们下一个证实了这一观察通过测量LC3-II营业额免疫印迹。细胞治疗6 h与氯喹(CQ 10μ米),溶酶体酸化的抑制剂,或与CQ一起办公。正如预期的那样,LC3-II的退化,LC3的成熟形式纳入自噬小体,在CQ的存在阻塞,导致的累积LC3-II相比,控制条件(图2 (b))。在细胞治疗与CQ和OA,我们发现了一个更大数量的LC3-II CQ相比。这种差异可能是由于增加的自噬体的形成与OA(图2 (b))。总的来说,这些结果表明,OA在心肌细胞自噬的激活通量,包括autophagosome-lysosome融合的最终步骤和溶酶体降解。

(一)
(一)
(b)
(b)
图2
OA增强新生大鼠心肌细胞自噬流量。(a)的双重免疫荧光成像在心肌细胞刺激RFP-GFP-LC3 100μ不同时期的M OA (1 h、3 h、6 h)(左面板)。比例尺20μm。量化的黄色puncta(自噬小体)和红色puncta(自吞噬泡)为每个条件显示在直方图(右面板)( 独立实验;对于每一个实验,每条件)10细胞被量化。 与控制; 与控制; OA 3 h和6 h; OA 3 h和6 h。(b)的免疫印迹分析LC3蛋白进行心肌细胞蛋白提取与氯喹(CLQ 10刺激后μ米)或CLQ + OA (CLQ 10μM, OA, 100年μ米)6 h。β肌动蛋白表达作为加载控制。LC3-II / LC3-I比率的图表表示量化衡量微密度分析( )。 与控制; 与控制; CQ与CQ + OA。
3.3。OA刺激TFEB核易位和活动

一旦建立了OA刺激心肌细胞自噬流量,以下步骤是阐明自噬的分子机制激活。在这种情况下,它已经表明,转录因子TFEB充当主调节器的自噬溶酶体基因,允许协调不同步骤的自噬和激活的通量31日]。TFEB活动主要是由其亚细胞定位控制。TFEB保持不活跃在细胞质中,但当它把原子核,它可以激活靶基因的转录31日]。为了评估OA TFEB核易位的影响,我们对心肌细胞为30分钟和可视化TFEB免疫荧光染色的亚细胞定位。如图3(一个)在未经处理的控制细胞,只有50%的细胞显示核本地化TFEB OA治疗后,这个比例显著增加到80%。易位的TFEB核已经证明自噬基因的转录。因此,我们决定测量自噬基因的mRNA表达已知TFEB的直接目标。我们发现OA治疗30分钟Atp6v1 mRNA表达的增加、p62 Lamp1,表明早期激活TFEB转录活动(图3 (b))。

(一)
(一)
(b)
(b)
图3
OA诱发TFEB易位和激活。(一)免疫荧光染色TFEB抗体在心肌细胞治疗OA (100μ米)30分钟(红色)。核与DAPI复染色。比例尺20μ米(左)。量化分析细胞的核本地化的TFEB核总额的百分比(右)( 独立实验;对于每一个实验,6场约15细胞被量化的条件)。(b)实时PCR Atp6v1, p62, Lamp1规范化GAPDH成绩单在心肌细胞治疗OA(100年水平μ米)( )。 与控制。
3.4。OA预防是诱导毒性

考虑我们的诱导的自噬流量OA的证据,我们假设这多酚可能有益心脏的自噬功能障碍模型。为了评估这种可能性,我们与一个驱动器是腺病毒表达心肌细胞转导使用(Ad-MAO-A)我们孵化与酪胺的细胞(酪氨酸,500年μ由MAOA M),基质代谢;生成H2O2(13]。在这个模型中,酪氨酸加法时,我们发现时间增加活性氧的生产,这是最大的1 h,衡量DCFDA探针荧光(图4(一))。因此,线粒体功能障碍和细胞坏死后被证明2 h酪氨酸应用程序,与MTT和LDH化验(测量数据4 (b)和4 (c))。为了确定如果OA可以缓解的有害影响是,我们第一次治疗的细胞酪氨酸2 h,然后添加OA在文化媒体(后处理),其余4 h(图5(一个))。最有趣的是,心肌细胞受到OA后处理显示保护线粒体蚀变和坏死引起的死亡酪氨酸(数字5 (b)和5 (c))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图4
时间进程的DCFDA荧光、MTT和LDH与酪氨酸Ad-MAO-A-transduced心肌细胞的刺激。Ad-MAO-transduced心肌细胞和毛底物酪氨酸(500刺激μM)不同时间(15分钟4 h)之前测量(a) DCFDA的荧光探针荧光计( ),(b) MTT还原( )和(c)在文化上层清液LDH释放( )。 ; ; 与控制。
(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图5
OA是预防MAO-induced毒性。(一)Ad-MAO-transduced心肌细胞刺激与毛底物酪氨酸(500μ米)6 h或与酪氨酸+ OA在过去4 h(后处理)来衡量(b) MTT还原( )和(c)在上层清液LDH释放( )。 ; 与控制。
3.5。OA改善MAO-A-Induced损伤自噬流量

接下来,我们试图评估OA能否恢复由于是激活自噬抑制通量。为了这个目的,我们执行的RFP-GFP-LC3测定心肌细胞刺激6 h和酪氨酸单独或与酪氨酸的OA过去4 h(后处理)。刺激心肌细胞的酪氨酸6 h诱导显著积累黄色puncta(自噬小体),但不是红色puncta(自吞噬泡),表明自噬缺陷间隙(图6)。然而,后处理与OA在过去4 h的自噬小体数量减少,显著增加TYR-treated细胞自吞噬泡的形成(图6)。我们得出这样的结论:OA恢复自噬缺陷通量在压力条件下,促进心肌细胞的自噬小体间隙与是overactivation。

(一)
(一)
(b)
(b)
图6
OA恢复Ad-MAO-A-transduced心肌细胞自噬流量。双重免疫荧光成像的RFP-GFP-LC3 Ad-MAO-A-transduced心肌细胞刺激与酪氨酸(500μ米)6 h或添加了酪氨酸+ OA在过去4 h(后处理)。代表图像(上半部分)。比例尺20μm。量化的黄色puncta(自噬小体)和红色puncta(自吞噬泡)为每个条件显示在柱状图(下图)( 独立实验;对于每一个实验,每条件)10细胞被量化。 , , 。
3.6。OA恢复核本地化的TFEB Ad-MAO-A-Stimulated心肌细胞

激活是曾被证明能够诱导ROS-mediated细胞质的TFEB和减少其转录活性,自噬体间隙的一个假定的机制是抑制(13]。我们因此试图探讨OA是否会抵消这些是有害的影响,通过评估与免疫荧光染色TFEB亚细胞定位。正如所料,酪氨酸刺激2 h显著降低细胞的百分比比未经处理的(图TFEB核本地化7)。最有趣的是,在过去30分钟后处理与OA诱发大规模易位TFEB核舱(图7)。这些结果表明,OA的能力恢复自噬流量可能依赖,至少部分TFEB激活,这是一个早期事件。

(一)
(一)
(b)
(b)
图7
OA诱发核本地化的TFEB Ad-MAO-transduced心肌细胞。免疫荧光染色(红色)与TFEB抗体治疗的心肌细胞酪氨酸(500μ米)为2 h或添加了酪氨酸+ OA在过去30分钟(后处理)。核与DAPI染色(上半部分)。比例尺20μm。量化分析细胞的核本地化的TFEB核总额的百分比(下图)( 独立实验;对于每一个实验,6场约15细胞被量化的条件)。 与CTRL和 酪氨酸+ OA和酪氨酸。
3.7。TFEB激活OA-Mediated有益效果是至关重要的

评估是否TFEB激活OA保护至关重要,我们执行TFEB沉默与TFEB siRNA心肌细胞的转染。我们首先检查TFEB沉默的有效性定量实时反向transcriptase-PCR (rt - pcr)和发现明显降低与TFEB-siRNA TFEB信使rna转染后24小时,相比小干扰rna (SCR-siRNA)争夺转染细胞(图8(一个))。在SCR-siRNA条件,心肌细胞刺激酪氨酸6 h显示肝癌和减少,这也是TFEB-siRNA条件(图中观察到8 (b))。有趣的是,与OA预防肝癌的减少后处理SCR-siRNA条件,但这有益效果是迷失在TFEB-siRNA条件(图8 (b))。总之,OA TFEB是必要的存在给予保护的有害影响是。

(一)
(一)
(b)
(b)
图8
OA的保护作用MAO-A-induced毒性丢失TFEB沉默。(a)心肌细胞就会争夺(SCR)或TFEB核,和TFEB mRNA水平被真正time-RT-PCR 48 h posttransfection检查。结果规范化GAPDH和表示为一个褶皱增加可控硅控制核( )。(b)心肌细胞转染了可控硅或TFEB-siRNA 24小时,然后用是腺病毒转导额外的24小时。然后,心肌细胞被刺激酪氨酸(500μ米)6 h或酪氨酸+ OA在过去4 h,和MTT测试执行( )。 和 。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们报告,OA调节心肌细胞自噬流量在休息和恢复自噬缺陷造成MAO-dependent氧化应激,保护心肌细胞线粒体功能异常和细胞死亡。此外,我们所知,我们提供了第一个证据的作用TFEB在OA的保护作用与激活自噬缺陷。OLE的心血管效应和/或事先已被归因于OA等机制减少氧化和nitrosative压力(32)以及抗血小板(33,降血脂药34),和抗炎35)活动。最近的一项研究[36)表明,OLE减少促炎细胞因子和增加抗氧化剂的标记。这些调查结果类似于先前的研究显示,OLE减少prooxidants和促炎细胞因子和抗氧化指标增加阿霉素毒性32,35)和心肌缺血/再灌注(34,37]。全身的另一项研究急性阿霉素(DXR)心肌病表明OLE防止结构,功能,和组织病理学心脏慢性DXR毒性的影响,而不是直接抗氧化作用,但通过调制信号通路以挪士,进气阀打开,ET-1, Akt, AMPK [35]。

细胞自噬是一种进化保守self-digestive过程适应营养饥饿和其他压力条件(11,12,38]。衰老过程的一个主要原因是一个逐步丧失细胞质量控制机制,自噬是一个重要的质量控制途径,维持细胞内稳态(尤其是神经和心脏)和适应压力。减少自噬在衰老模型,观察到有令人信服的证据表明,自噬增强延迟衰老和延长寿命。增强自我吞噬抵消与年龄有关的蛋白质积累总量和受损的细胞器39]。越来越多的研究关注受损的自噬流量之间的因果关系和一些包括神经退化疾病,癌症,肌病和心血管疾病18,23,27,40]。一些数据支持的有利影响植物多酚在autophagy-flux障碍最近报道(41- - - - - -43]。在先前的研究中,我们表明,在神经母细胞瘤细胞,OA诱发自噬通过激活的Ca2 +/ CaMKKβ/ AMPK mTOR信号通路,这一机制按照之前报道的其他多酚(24,25,27]。在活的有机体内,我们发现TgCRND8小鼠模型β沉积,再辅以OA-supplemented饮食表现出显著的改善认知能力,大量减少β斑块数量和规模,惊人的激活自噬流量的皮层,增加表达的自噬标记还发现(27]。

在这项研究中,我们的第一个目标是评估是否OA在心肌细胞诱导自噬,如果是这样,调查TFEB-mediated转录调控能否发挥作用。我们表明,OA能够诱导自噬在短时间治疗后心肌细胞,如图所示的自噬空泡和autophagy-specific标记,如Beclin1和LC3-II。然而,由于自噬体和自噬的增加标记的积累还没有完全表明有效的自噬激活但也能引起自噬小体成熟的封锁,我们执行一个自噬流量分析。“自噬流量”是一个测量的自噬降解完成需要autophagosome-lysosome融合和随之而来的基质降解。因此,完整的自噬降解条件需要确定自噬是否真的保护受损的细胞有利于回收和清洁材料和细胞器。OA-treated细胞这一目的,我们使用了串联传感器RFP-GFP-LC3B,特别是标签自噬体和自吞噬泡,我们发现自噬小体处理溶酶体,自噬流量确实增强。一旦建立了OA诱导新生大鼠心肌细胞自噬流量,下一个步骤是探索主自噬调节TFEB的参与。目前,OA作为TFEB活化剂的作用没有被描述。最近的研究结果表明,姜黄素,另一个疏水多酚,增强了自噬流量在人类结肠癌HCT116细胞和小鼠胚胎成纤维细胞(mef)通过抑制mTOR和TFEB转录活动增加38]。在心肌细胞中,我们发现,OA TFEB能够诱导核易位,因此,上调TFEB目标基因,特别是自噬基因如ATP6-V1 atp酶、p62, LAMP1。TFEB易位可以由两个不同的信号通路参与mTOR激酶和磷酸酶磷酸酶。在营养丰富的条件下,TFEB被溶酶体表面mTORC1磷酸化,隔离,包裹着14-13-3蛋白质。在饥饿、mTOR抑制,减少TFEB磷酸化和激活核易位。此外,在饥饿、Ca2 +释放溶酶体通过MCOLN1通道激活calcium-dependent磷酸酶钙调磷酸酶,这反过来,脱去磷酸TFEB和诱发核易位31日]。在目前的研究中,我们的结果表明,OA作为热量限制模仿,诱导TFEB易位,最终通过mTOR或钙调磷酸酶信号,这就需要进一步调查。

一旦有突出的能力OA刺激自噬通量TFEB激活心肌细胞在基底条件下,我们寻求更好的研究假设的保护作用OA在压力条件下自噬缺陷的特征。为了这个目的,我们使用Ad-MAO-A-transduced心肌细胞,心脏模型的自噬功能障碍的特点是过度。众所周知,心脏是表达增加高频的鼠模型,如高血压、主动脉横缢痕,糖尿病和心脏衰老(44- - - - - -46),以及在人类缺血性心肌病(2]。这些病理条件与线粒体功能障碍和心脏损伤,但直到最近,Santin et al。13]阐明线粒体功能失调的原因积累增强是活动的情况。是负责5 -羟色胺的降解和儿茶酚胺的心脏和产生H2O2作为反应的副产品。氧化应激是块自噬流量通过溶酶体功能受损,导致受损的线粒体的积累和心肌细胞坏死(13]。此外,是激活防止TFEB核易位,减少其转录活性。因此我们想知道TFEB易位的OA的增加是否会降低造成的心肌细胞损伤是/ H2O2轴通过恢复自噬流量。我们首次发现OA后能够恢复Ad-MAO-transduced心肌细胞的自噬流量巨大的TFEB易位。排除这一效应的假设仅仅是由于对MAO-produced H OA的抗氧化作用2O2,我们用siRNA针对TFEB转染心肌细胞。转录调节自噬的OA与细胞死亡和线粒体功能的一个重要改进TFEB沉默后消失,我们假设TFEB至关重要的保护作用,对MAO-A-induced OA自噬功能障碍。此外,在基础条件,办公自动化能够诱导TFEB易位和自噬诱导没有任何影响在心肌细胞ROS地位,进一步突出了它的属性作为一个自噬诱导物。

总之,有可能TFEB调制可能会推迟器官退化,防止心脏疾病通过恢复功能的自噬。最近,Sergin et al。15)能够逆转动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞的自噬功能障碍在组织和动物模型通过增加TFEB函数。作者也表明,天然糖、海藻糖、诱发巨噬细胞自噬/溶酶体生物起源,从而概括的atheroprotective性质TFEB在巨噬细胞过度。符合这一点,我们已经表明,OA的防护效果远远超出其已知的抗氧化能力,能够有效地干扰关键信号通路在心肌细胞能量代谢和proteostasis的基础。我们的数据表明可能使用OA作为营养食品协会与当前心血管疾病的特点是自噬功能障碍的治疗方法。然而,因为它已经在最近的一次审查概述(47),酚类化合物的生物活性是严格依赖于它们的生物利用度代表一个关键问题。有关OA和其前身OLE的主要变量是由形式中摄取(纯化合物,提取含有不同比例的化合物,与不同的酚类成分)和全橄榄油,剂量、治疗时间的长短,与不同的食物。普遍共识担心橄榄油苯酚被人类吸收和代谢,因为他们的退化和修改产品检索后尿液中摄取(48- - - - - -50]。然而,吸收资料有所不同,这取决于这些酚类化合物的来源(51,52]。此外,OA比OLE更有效地吸收,可能是因为其高apolarity支持跨细胞膜被动转运(53]。最近的一份报告中进一步表明,OLE政府老鼠后,OA检索在粪便和尿液(连同水解和修改产品)(54]。特别相关的证据表明,老鼠和人类,口头管理橄榄油酚类,包括OA、OLE,和/或它的一个衍生品因组织新陈代谢,分布在许多组织,包括心脏(48,55]。最后,OA和3,4-dihydroxyphenylethanol-elenolic酸醛似乎副膜由于其疏水性(56];这意味着他们可能会积累在细胞水平上,达到局部浓度高于预期的基础上他们的血浆浓度。

更多的信息,主要是在人类主题,仍然缺乏对OA和OLE有效剂量药物动力学和药效学;然而,越来越多的数据支持的可能性与橄榄leaf-based长期治疗老年人保健品和/或EVOO丰富OA / OLE可能相反体内病理症状(57),包括心脏疾病,推迟他们的外表,或降低其严重性。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

珍妮Mialet-Perez及Nediani贡献同样这项工作。

确认

研究得到了法国INSERM (pour la健康和洛杉矶医学研究所),由基金会Cariplo格兰特(2014 - 0672)和烤鸭Cassa di Risparmio di费伦泽2015.0756(批准),资助从“地区Occitanie”。

补充材料

补充1。图S1:: oleuropein在DMSO质谱在539之后米/z和[M + Cl−]离子;底部:颗粒重新溶解在DMSO的377米/z为主要离子对应oleuropein糖苷配基。没有离子在539米/z确认的完全水解糖化的形式。

补充2。图S2: OA在新生大鼠心肌细胞无毒。细胞治疗与OA(100毫米)6 h, MTT(线粒体功能),DCFDA (ROS检测),和LDH测试(细胞坏死)进行。