雌二醇减轻椎间盘变性通过调节抗氧化酶和抑制自噬在更年期大鼠模型

文摘

客观的。探讨更年期的影响在椎间盘和氧化还原平衡是否氧化应激和自噬与更年期大鼠椎间盘变性有关。方法。三十岁女性Sprague-Dawley老鼠被随机分为三组(骗局,切除卵巢的车辆,和切除卵巢的雌激素)。最后三个月的治疗,老鼠被3.0 T MRI检查。测定血清雌二醇(E2)水平。氧化还原平衡的髓核决心通过测量总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(氧化酶)、谷胱甘肽(GSH)和氧化谷胱甘肽(GSSG)。透射电子显微镜(TEM)、免疫组织化学染色和免疫印迹被用来确定髓核自噬水平。与此同时,斯皮尔曼相关系数是用于描述椎间盘等级之间的关系,氧化应激状态,血清E2,自噬水平。结果。血清E2水平明显减少卵巢切除术,可以纠正的雌激素替代疗法(ERT)。OVX大鼠氧化应激增加和高水平的自噬被观察到在髓核组织。ERT阻止椎间盘变性(类),恢复了氧化还原平衡,以及自噬水平降低。结论。卵巢切除术诱导氧化应激、自噬和椎间盘变性。自噬的椎间盘与氧化应激负相关,和自噬的水平可以减少ERT通过调节自噬水平的氧化还原平衡和表达下调。调节试管的氧化还原平衡可能是一个潜在的治疗选择变性椎间盘的绝经后妇女。

1。介绍

更年期逐渐发生时年龄在45 - 55岁女性的生活,导致雌激素水平的一个重要抑郁症(1]。这个过程影响许多器官和系统的新陈代谢在绝经后妇女。最近,越来越多的证据表明,老年妇女有较高的患病率和严重椎间盘变性而成熟的男人(2- - - - - -5]。一个椎间盘(试管)是纤维软骨的组织,由三个不同但相互依存的组织:环纤维化(AF)、髓核(NP)和软骨终板(EP)。试管,减振器系统,可以将负载和削弱能量对骨骼脊椎(6]。椎间盘变性(类)的特点是含水量降低,抑郁的蛋白合成,不恰当的胶原蛋白类型和异常细胞外基质(ECM)的生产(7,8]。一般,NP组织中起着重要作用在试管的功能性成分,和NP组织的病理改变是椎间盘变性的重要原因(9]。变性的椎间盘背部疼痛是主要的贡献者。背部疼痛对人类社会(沉重的经济负担10]。遗憾的是,当前的治疗策略,如保守治疗和/或手术,不要把试管的正常功能。因此,试管的发病机理和治疗方法类仍然是主要的研究领域关于试管。几篇文章表明,17岁β雌二醇(E2)可以促进房颤细胞和NP体外细胞增殖减少细胞凋亡水平(11- - - - - -13]。有趣的是,绝经后妇女接受雌激素替代治疗(ERT),可以维持较高的试管高度比未经处理的更年期女性(14]。动物椎间盘,先前的研究已经表明,OVX雌性老鼠对类敏感,和E2的补充可以阻碍进步的病理学的类15,16]。然而,虽然取得了重大进展,以了解E2的保护作用,可以逆转或延缓类的发病机制,底层的机制并不清楚。

类雌激素引起的损耗的过程可能是由氧化应激引起的,这被定义为氧化剂和抗氧化剂之间的不平衡(17]。最近的研究报告说,类的发生和发展有关氧化应激(18,19]。更重要的是,绝经后妇女有更高水平的氧化应激,这表明抗氧化能力可能与雌激素减少有关(20.,21]。有趣的是,雌激素替代疗法(ERT)能够恢复抗氧化状态(22]。自噬,一个重要的细胞保护机制,可以应对不同类型的细胞的压力。此外,一些体外研究表明,自噬对试管细胞有重要的保护作用[23,24]。证据主要来自上面的研究表明,氧化应激诱导的雌激素类的损失可能是一个风险因素,和自噬水平可能与缺乏雌激素发挥保护作用。然而,雌激素和氧化还原系统/自噬水平之间的关系没有解决到目前为止在椎间盘。因此,我们的目标是探讨雌激素水平的变化的影响,氧化还原平衡,自噬在椎间盘切除卵巢的老鼠。

2。方法和材料

2.1。研究设计

目前的研究包括三十六女Sprague-Dawley老鼠,他们被随机分为三组,这是虚假的手术(假的),卵巢切除术(OVX)和10μ17克/公斤/天β雌二醇(OVX + E2)。双侧卵巢切除术与戊巴比妥麻醉下进行的骗局,OVX + veh和OVX + E2组。E2补充进行了12周;然后,我们使用3.0 T MRI(德国西门子交响乐,埃朗根)检查老鼠的试管。类是由定量评估在矢状面MRI T2映射。影像学检查后,椎间盘和血液样本获得的老鼠接受过量戊巴比妥。没有老鼠死在研究之前,他们对待安乐死。所有的实验都依照指导实验室动物保健和使用的和瑞金医院伦理委员会的批准。

2.2。磁共振成像检查

T2映射磁共振(先生)成像序列是一个可靠的方法监测质子偶极相互作用的水分子运动的细胞外基质胶原和蛋白多糖25]。三组的腰椎MRI图像得到3.0 T先生机(西门子),覆盖L1-L6试管。同样的过程是用来扫描刺:收购时间T2映射序列的每个脊椎的L5-6盘大约是15分钟。然后,感兴趣的区域(roi),显示在图1(一)T2弛豫时间映射,进行评估;ROI 1覆盖腹侧纤维环(VAF), ROI 2覆盖腹侧的边界区(BZ), ROI 3覆盖NP, ROI 4介绍了背,和ROI 5介绍了背纤维环(DAF)。这些ROI的标准比例确定基于在显微镜下微观结构评价:ROI 1盘直径的25.3%,占ROI 2和4都是13.8%,ROI 3 35.9%,测量和ROI 5 11.2%。

2.3。组织学评价

4%多聚甲醛用于修复脊髓组织,这是洗两次磷酸盐(PBS)。24小时后,组织进行了脱钙作用过程的一个月。后,立即组织嵌入石蜡。然后,L5-L6盘段切成4μ米厚的部分。获得在矢状面,二甲苯处理以除去石蜡,患者在一个梯度酒精浴,然后冲洗3次,PBS。部分都沾hematoxylin-eosin(他),safranin-O(所以)绿色,或picrosirius撕裂(公关)。幻灯片用电子显微镜观察(奥林巴斯、日本),和一个评分系统,根据前面的研究(16),被用来评估椎间盘变性。这些幻灯片被2观察员,独立地、盲目地评估和平均2观察家视为最终结果数据。

2.4。免疫组织化学自噬水平的试管

石蜡包埋的L5-L6段切成4μ米厚度,然后幻灯片进行清蜡在分级患者酒精浴。处理抗原后检索和屏蔽解决方案,幻灯片是孵化与LC-3B单克隆抗体(1:100年,春秋国旅Inc .)、美国)在一夜之间在4°C。然后,与二次孵化的部分抗体稀释(1:500年,春秋国旅Inc .)、美国)30分钟。最后,幻灯片是涂处理解决方案5分钟后双洗PBS。完成工作用电子显微镜观察(奥林巴斯、日本)。半定量的分析方法被用来评估部分的密度Image-Pro + (IPP) 6.0软件,和平均结果解决下400 x放大图像。

2.5。氧化还原平衡测量试管

试管的新鲜NP组织是地面和蛋白质制成匀浆,是离心机在3000 rpm,持续15分钟。抗氧化剂酶活性检测组件(南京建成生物工程研究所、江苏、中国)是用于检测T-AOC的活动,SOD,猫,氧化酶和T-GSH和GSSG水平。所有程序都是根据设备的说明书执行。

2.6。检测血清E2

血液样本站在室温下2小时后离心机在3000 rpm 15分钟在4°C,然后上层清液收集血清样本做准备。雌激素检测酶联免疫试剂盒用于确定血清E2水平(上海生物制品研究所、上海、中国)。所有实验步骤称为产品手册。

2.7。自噬小体由透射电子显微镜观察

新鲜的NP组织样本立即固定在1%戊二醛一天在室温和软化为3周。在那之后,NP组织切成1毫米³。这些样品是后缀有1%四氧化锇与PBS 1小时后洗。治疗样本嵌入Durcupan ACM 7小时,切成薄片,沾染了铀酰乙酸酯和柠檬酸铅,最后检查与飞利浦cm - 80透射电子显微镜(荷兰埃因霍温)。

2.8。免疫印迹分析

所有的NP组织细胞溶解在里帕缓冲区(Beyotime、江苏、中国)包含PMSF和蛋白酶抑制剂。BCA工具包(Beyotime、江苏、中国)被用来确定组织中蛋白质的浓度溶解产物按照产品手册。组织溶解产物(35μg)被使用12% sds - page电泳分离,然后都被转移到硝化纤维膜的蛋白质。阻塞与5%脱脂牛奶1小时后,细胞膜与初级孵化抗体LC3-B(罗福斯1:1000年,美国),Beclin1 (Abcam 1: 1000年,美国),p62 (CST 1: 1000年,美国),Atg5 (CST 1: 1000年,美国),和GAPDH (Proteintech 1: 5000年,中国)一夜之间在4°C。与PBS洗了三次后,膜被孵化LI-COR 800 w二次抗体(美国LI-COR生物科学)。最后,膜是由奥德赛机(美国LI-COR生物科学)和被IPP量化软件。

2.9。统计分析

目前的数据计算和作为意味着±标准差(SD)。单向方差分析 - - - - - -测试被用来分析SPSS 21.0软件的显著差异。相关性分析与血清雌激素水平,自噬水平,氧化还原平衡状态,h值和T2的值映射的试管用斯皮尔曼等级相关系数。 表现出显著差异, 展示了高度显著差异。

3所示。结果

3.1。验证鼠腰椎类

调查是否绝经期起侧作用导致类,我们建立了一个卵巢切除术鼠模型根据先前的研究15,16]。苏木精和伊红染色(他)被用来评估椎间盘(图2(一个))。OVX + veh组细胞表型的变化发生在NP组织。NP组织,有相当数量的脊索细胞减少,虽然许多位于细胞出现在团体,他们包围的减少ECM NP组织。结区房颤和NP之间变得模糊由于裂缝,杂乱无章的胶原纤维,纤维软骨的增殖。然而,虚假的组的情况不同,因为有更多的脊索细胞和少量的cartilage-like细胞。有一个完整的和紧密安排AF虚假的集团的组织结构。雌激素的保护作用是OVX + E2组中观察到的情况下NP组织所观察到的类似的骗局。

椎间盘是评估使用评分系统。一个好的标签给虚假的组织及其h值是最低(1.6±1.26)。有明显的病变椎间盘OVX + veh组得分为5.7±1.25,高于其他( )。补充雌激素可以一定程度上减轻椎间盘变性;的分数为2.9±0.88,低于OVX组( )。

3.2。雌激素会阻碍盘组件的退化

评估体内雌激素的保护作用,雌激素补充每日OVX + E2组执行。蛋白多糖和胶原蛋白的含量决定了所以和公关染色。如图2 (c),减少红染色强度证明了蛋白多糖的降解在髓核和纤维环组织OVX大鼠,表明雌激素补充可以扭转退化。偏光显微镜是用来确定类型的胶原蛋白,胶原蛋白类型下我纤维表现出强烈的黄色双折射,而胶原蛋白II型纤维表现出轻微的多色双折射。虚假和OVX + E2组,内层AF表现出多色,外层AF显示强烈的黄色的密度,表明房颤最接近NP组织主要是胶原蛋白II型。然而,OVX组房颤的光盘呈现黄色染色,这证明他们的主要成分是由I型胶原蛋白(图2 (c))。临床评估的传统方法试管变性通常使用t2加权磁共振成像序列执行。遗憾的是,它未能诊断椎间盘的退行性变的早期阶段。一种新的序列,称为T2映射,是可信可靠的和敏感的工具来监控椎间盘退化的内容(26]。根据我们的数据,大萧条的T2与类映射值呈正相关。从T2值映射的NP (ROI3)减少OVX组与虚假的组。此外,这种降解药物可以抵消干预(图3)。先生的结果与组织学得分负相关(图4(一))。

3.3。补充雌激素恢复氧化还原平衡通过促进抗氧化能力

如表所示1,ELISA结果证明OVX大鼠血清E2水平明显降低(216.51±88.08 pg / ml)。此外,卵巢切除术减少谷胱甘肽的水平(5.46±1.33 U / mg prot)和增加GSSG水平(4.92±1.4 U / mg prot),因此增加的比率GSSG /谷胱甘肽(1.30±0.75)。此外,卵巢切除术导致减少的能力T-AOC (1.69±0.89 U / mg prot), SOD (22.65±8.73 U / mg prot)和氧化酶(34.47±11.92 U / mg prot),虽然没有改变观察猫的能力(29.28±10.86 U / mg prot)。补充雌激素在OVX大鼠血清E2水平(906.14±104.2 pg / ml)接近虚假的集团。氧化还原平衡的检测显示,大量积累的氧化谷胱甘肽(GSSG)和消费减少谷胱甘肽(GSH),表明氧化还原平衡压力可以通过补充雌激素(表更正1)。OVX + E2组中,谷胱甘肽的水平(谷胱甘肽8.12±1.33 U / mg prot)更高,GSSG (3.56±0.87 U / mg prot)低于OVX + veh组;因此,GSSG /谷胱甘肽NP组织被补充雌激素减少。我们的数据表明,雌激素不足NP组织的抗氧化能力下降。这种不平衡的雌激素替代氧化还原可能恢复。的能力T-AOC (2.64±0.92 U / mg prot), SOD (44.24±13.74 U / mg prot)和氧化酶(34.47±11.92 U / mg prot)被雌激素替代增强。相比之下,猫(30.08±11.73 U / mg prot)能力好像并没有受到雌激素的调节。

3.4。增加的自噬水平OVX + veh组

自噬作为一种保护作用,当NP细胞由炎症刺激,压缩压力、饥饿、和/或氧化应激。自噬的hallmarkers NP组织,如LC3-II /我,p62, Atg5,通过免疫印迹和Beclin1评估。蛋白质螺栓结果表明Atg5, LC3, Beclin1提高OVX + veh组,而E2治疗Atg5的水平下降,LC3, Beclin1。然而,p62水平没有区别与其他两组相比(图1)。进一步确认NP细胞产生自噬,采用免疫组织化学。LC3的相似趋势决心与蛋白质水平污点的结果(图5)。此外,利用TEM检测NP细胞的自噬小体。如图5 (d)OVX组的NP细胞自噬小体拥有比其他两组。目前的结果表明,有一个高水平的自噬的NP细胞OVX组。此外,没有组织学评分之间的相关性和LC3的水平( , )(图4 (b))。

3.5。血清E2水平之间的相关性和h值,抗氧化生物标志物,NP的自噬水平的组织

评估E2和氧化还原平衡变化之间的关系,斯皮尔曼相关法是用于描述与h血清E2水平的相关性,T2的值映射,T-AOC的能力,SOD, CAT,氧化酶,GSSG,谷胱甘肽,GSSG /谷胱甘肽比,自噬水平的试管OVX大鼠和OVX + E2老鼠。报告的结果数据4和6。有显著相关性的E2和T2映射值( , ),T-AOC ( , ),SOD ( , ),氧化酶( , ),与谷胱甘肽( , );相比之下,E2与h值负相关的变化( , ),GSSG ( , ),GSSG /谷胱甘肽比( , ),和LC3B ( , )。E2水平的变化,然而,不能表明猫的变化能力( , )。此外,LC3B水平之间有显著负相关,T-AOC活动( , )与谷胱甘肽( , )。然而,LC3B之间没有显著相关水平和SOD ( , ),猫( , ),氧化酶( , ),和GSSG ( , )。

4所示。讨论

由于盛行的下腰痛与绝经后妇女类和治疗方法的局限性2,4,6),重要的是找到新颖的方式来阻碍类和恢复正常的椎间盘功能。许多先前的研究已经证明了ERT在绝经后妇女骨质疏松症的影响,但是很少有报道集中在椎间盘变性(2,14]。有趣的是,我们的研究表明,变性之间的负相关的阀瓣和雌激素水平在OVX大鼠。低水平的抗氧化状态与椎间盘变性和NP诱导自噬水平高的组织。此外,氧化还原状态的失衡可以纠正了ERT盘;与此同时,试管变性可以逆转,自噬可以由雌激素表达下调。非常有趣的是,在这里我们报道了ERT充当了椎间盘变性的保护性因素,通过调节自噬水平的氧化还原平衡和表达下调。

类,异常引起的轴向载荷和不适当的内部环境光盘(27),是主要发病机理导致下腰痛,和更高的患病率与绝经相关的疼痛已经在一些文献报道[25,28,29日]。证据表明,雌激素水平降低可能在绝经后妇女(类的主要因素4,5,30.]。然而,很少有研究解决类雌激素的监管效果。在这项研究中,我们采用卵巢切除术鼠模型诱导腰类中执行先前的报道(15,16),发现OVX大鼠容易类,在变性的发病机理显示在早期阶段。类的早期阶段常常始于细胞表型的改变,细胞外基质的降解,心房颤动和NP之间模糊的边界区(8,31日- - - - - -33]。OVX组,脊索细胞的数量减少,出现位于NP细胞组织,而雌激素补充可以停止上述OVX + E2组的病理过程。先前的研究表明,雌激素直接监管的胶原和蛋白聚糖的合成和功能(34]。事实上,类包含各种胶原和蛋白聚糖。II型胶原蛋白,发挥着重要的作用在NP和NP和房颤之间的界限,为阀瓣提供抗拉强度(35]。NP组织的主要蛋白多糖在试管,aggrecan,发挥了重大作用,维持渗透压和组织水合作用[36]。这里,目前的研究表明,类,由低水平的雌激素,始于aggrecan和II型胶原蛋白的降解OVX大鼠相比,虚假和OVX + E2老鼠。贾et al。16)报道,基因水平的aggrecan OVX大鼠胶原蛋白II降低,同时,ECM酶可以抑制E2治疗。

氧化还原的不平衡引起的氧化压力,可能造成损害细胞和组织组件(37]。最近的研究报告说,类的病理形态和发展是与氧化应激有关18,19],氧化应激有针对性的治疗可能是一个潜在的方法来扭转类(38]。重要的是,雌激素消耗比拼氧化还原平衡在绝经后妇女39),而ERT可降低脂质过氧化物和提高抗氧化能力40]。先前的研究已经报道,E2提升清除自由基的能力,表明E2可以发挥对氧化损伤的保护作用控制抗氧化信号通路(41,42]。这个研究显示,第一次氧化还原状态的试管由血清E2有密切的关系。谷胱甘肽、三肽和细胞存活率的主要因素,充当细胞内抗氧化系统[基石43]。有两个谷胱甘肽在细胞和组织,二硫化谷胱甘肽(GSH),谷胱甘肽(GSSG) [44]。GSSG /谷胱甘肽的比例代表氧化状态的细胞和组织,和正常的比细胞的生存是至关重要的(45,46]。萨等人报道,OVX大鼠有较高的比例/谷胱甘肽(GSSG47),最近的一份报告显示,损耗的氧化酶在OVX大鼠雌激素诱导高水平的48]。否则,一系列的抗氧化酶,包括T-AOC、SOD, CAT,和氧化酶活性自由基的主要工具来删除生产过剩。累积证据对雌激素的影响这些酶的活动报告(20.]。Kawvised等人报道,OVX大鼠的海马匀浆SOD的活动,猫,氧化酶减少(48]。最近的研究报道促进雌激素的抗氧化酶系统的影响(22,40]。雌激素促进抗氧化酶的表达系统通过激活MAPK和NFκB通路体外(49]。切除卵巢的雌性的另一个证据提供循环显示,ERT增加抗氧化基因表达(22]。我们目前的结果明确支持这样的观察。

除了氧化还原平衡,沈et al。23解决,自噬作为一种保护性因素对氧化应激通过减少氧化应激。首先,我们表明,自噬在OVX大鼠椎间盘水平增加。我们的研究结果表明,自噬可能发挥保护性作用下氧化应激激素不足。此外,我们发现自噬水平逆趋势与抗氧化生物标志物(T-AOC和谷胱甘肽)。自噬可能保护细胞消化氧化受损蛋白质和细胞器50]。我们的研究结果表明,自噬的椎间盘是一个应对氧化损伤,和自噬的水平下降后雌激素恢复了氧化还原平衡。

有一些限制,应考虑在这个研究。首先,只有一个时间点进行调查的影响ERT椎间盘的氧化还原平衡。它可能是更好的动态氧化还原平衡和治疗效果的ERT multitime分下类应该被评估。第二,未来的研究可以包括证实我们的结论,如治疗OVX大鼠抗氧化应激药物解决类是否可以延迟通过调节氧化还原平衡在试管中。最后,试管的发病机制环境老鼠和人类之间是不同的;进一步的研究应该人类试管的讨论此事。

总之,这些数据表明,盘氧化还原平衡与E2水平;此外,试管OVX大鼠容易变性是由于雌激素缺乏症。ERT能够提高抗氧化能力和反向试管的退化,即使有也很少有研究调查menopause-related椎间盘变性。这些研究结果强烈表明,雌激素可能部分控制抗氧化剂酶蛋白的表达(图7)。此外,类与更年期有关可能取决于氧化还原生物学,和接受方可能为椎间盘变性带来积极影响。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

信息披露

金LY和Lv ZD co-first作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

李XF,金LY实验设计。金LY, Lv ZD,王K,钱学森L进行实验并获得数据。歌XX和沈HX分析数据。金LY和李XF监督项目和写的手稿。金LY和Lv ZD同样这项工作。

确认

这项工作是支持由中国国家自然科学基金(81772292,81772292,81772292,81270027),上海人才发展基金(201453),和上海交通大学的Medico-Engineering合作基金”(没有。YG2012MS25也没有。YG2016MS54)。

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