内皮素受体拮抗剂Macitentan改善Isosorbide-5-Mononitrate (ISMN)和硝酸异山梨酯(ISDN)诱导内皮功能障碍,氧化应激,炎症和血管

文摘

客观的。有机硝酸盐等isosorbide-5-mononitrate (ISMN)和硝酸异山梨酯(ISDN)用于治疗慢性症状稳定的冠状动脉疾病患者和慢性充血性心力衰竭。这些nitrovasodilators限制的副作用包括硝酸宽容和/或内皮功能障碍由氧化应激。这里,我们测试了治疗效果的双重内皮素(ET)受体拮抗剂macitentan ISMN -和ISDN-treated动物。方法和结果。有机硝酸盐(ISMN、ISDN、硝化甘油(GTN))增强氧化破裂,白细胞介素- 6在培养的巨噬细胞释放,而macitentan氧化破裂在孤立的人类白细胞减少。雄性C57BL / 6 j小鼠服用ISMN(75毫克/公斤/天)或ISDN(25毫克/公斤/天)通过南卡罗来纳州注入了7天,一些老鼠除了macitentan 30毫克/公斤/天(填喂法,每天一次)。ISMN和ISDN在活的有机体内治疗引起的内皮功能障碍,但没有硝酸(或跨)宽容有机硝酸盐,分别。ISMN / ISDN血nitrosative压力增加,血管/心脏氧化应激通过NOX-2(荧光和化学发光方法),ET1表达式,ET受体信号,炎症标记物(蛋白质和mRNA水平)。ET受体信号封锁macitentan规范化内皮功能,血管/心肌氧化应激和炎症表型硝酸在两个治疗组。结论。ISMN / ISDN治疗引起的激活NOX-2 / ET受体信号轴导致血管增加氧化应激和炎症和内皮功能障碍。封锁我们的研究首次表明,ET受体信号的双重内皮素受体阻滞剂macitentan改善有机硝酸盐ISMN和ISDN的副作用。

1。介绍

有机硝酸盐等三硝酸甘油酯(GTN)、硝酸异山梨酯(ISDN)和isosorbide-5-mononitrate (ISMN)仍然是最重要的口头可用药物治疗慢性症状稳定的冠状动脉疾病患者,急性心肌梗死、慢性充血性心力衰竭(1- - - - - -3]。最极限的副作用包括硝酸宽容和/或内皮功能障碍的发展,它被描述发生在应对慢性治疗人类GTN, ISDN, ISMN [2,4- - - - - -6]。而病理生理学基础GTN-induced内皮功能障碍已经广泛的特点(1,2),尤其是对血流动力学和自主反应的负面影响7,8),只有有限的数据可用来解释为什么ISMN或ISDN对血管内皮有不利影响。相比之下GTN和pentaerithrityl硝酸酯(PETN), ISMN和ISDN不受bioactivation线粒体醛脱氢酶(ALDH-2)位于线粒体9,10]。其他ALDH亚型识别bioactivate各种有机硝酸盐体外(11,12),它是假定胞质ALDH-2负责至少在某些细胞类型(例如,血管细胞)GTN bioactivation [13]。ISDN和GTN应该bioactivated P450酶(14,15]。此外,黄嘌呤氧化还原酶被证明为ISDN和ISMN-metabolizing酶与更高的营业额与黄嘌呤代替NADH作为电子源,虽然只在suprapharmacological有机硝酸盐水平(16]。

ISMN治疗导致内皮功能障碍在人类主题,由维生素C完全纠正政府表明活性氧簇(ROS)的至关重要的作用在调节这种现象(17]。最近,我们已经表明,ISMN治疗导致endothelin-1 (ET-1) upregulation NOX-2激活,以挪士解偶联(18]。非常相似的副作用,包括增强血管ET-1水平,也报道GTN疗法在动物19,20.)和ET-1 mRNA协会ISDN-induced公差在人类21]。相比之下,其他组织未能遵守upregulation ET-1回应ISMN体内政府兔子(22),无法防止GTN-induced体外通过等公差_一个受体拮抗剂(23),没有观察过敏性血管收缩剂ET-1在人类内乳动脉从硝酸盐治疗患者24)或孤立的牛冠状动脉在体外诱导GTN公差(25]。安吉丽的盐硝酰的阴离子供体,据报道,它可能克服ET-1-induced小鼠主动脉血管功能障碍,而GTN未能显示有益作用[26]。之前发现硝酸公差(主要是为了应对GTN)对激活endothelin-1系统及其与氧化应激的交互也总结了一些评论文章(1,2,27]。观察别人在GTN-induced激活全血的ROS生成指向硝酸盐在白细胞激活的角色28]。与我们最近的研究,我们可以证明吞噬NADPH氧化酶在循环白细胞增加慢性GTN和ISMN疗法(18,29日]ISMN-induced血管并发症的程度是实现协同增加1型糖尿病和动脉高血压的设置(30.,31日]。别人至少观察到没有任何有益的效果ISMN治疗动脉粥样硬化和内皮功能障碍在cholesterol-fed兔子32]。几乎没有什么了解ISDN-induced副作用的机理到目前为止,据我们所知,从来没有临床前研究表明,ISDN可能导致内皮功能障碍,这可能也与是否增加氧化应激和内皮素的表达增加。

血管收缩剂的同时upregulation ET-1和增加血管氧化应激可以最好地解释了这一事实ET-1增加血管过氧化物的形成通过NADPH氧化酶的活化和刺激炎症过程在轻度高血压模型(33,34]。亦然,它也表明,NADPH oxidase-derived超氧化物形成强化ET-1[血管收缩剂的特性35)和ET-1氧化应激诱导的启动子,因此其表达式(36,37]。这提供了相声的基础或恶性循环血管收缩剂和有机硝酸的氧化应激通路治疗(了2,38])。在我们的研究中,我们观察到激活白细胞在回应ISMN体内疗法以及体外与ISMN挑战,外生ET-1,或等_一个受体激动剂bq - 3020 (18,39),应用波生坦被cotherapy在选定的实验。

治疗慢性ISMN和ISDN的老鼠是一个合适的模型来测试这个相声的假说涉及ET-1详细和氧化应激和炎症。目前的研究,我们进一步阐明的基本机制的影响ISMN ET-1信号和ISDN疗法,NOX-2激活,炎症和血管功能障碍与内皮素受体拮抗剂cotreatment macitentan,显示缓慢明显受体协会动力学导致显著降低受体离解速率和较长的受体入住率半衰期(40]。

2。材料和方法

2.1。试剂

硝酸异山梨酯(ISDN;50% (w/w)和50% (w/w乳糖)是分析品位和获得Sigma-Aldrich或丙烯酰胺。Isosorbide-5-mononitrate (ISMN)从LKT实验室(美国圣保罗、锰)。Macitentan (act - 064992;N - [5 - (4-bromophenyl) 6 - (2 - (5-bromopyrimidin-2-yloxy)乙氧基的)pyrimidin-4-yl] - N - - - - - -propylaminosulfamide)是一种礼物Actelion股价制药有限公司(瑞士Allschwil)。GTN等长张力研究来自于一位Nitrolingual输液(1毫克/毫升)从g . Pohl-Boskamp (Hohenlockstedt,德国)。布拉德福德试剂是来自Bio-Rad(德国慕尼黑)。所有其他化学物质都来自丙烯酰胺,Sigma-Aldrich或默克。

2.2。细胞培养

264.7原始细胞巨噬细胞从LGC购买标准(Wesel,德国)。细胞培养在DMEM-NM(# 21885 - 025)包含GlutaMAX从生活技术GmbH / Gibco(达姆施塔特,德国)与10%胎牛血清(FCS, PAA)、青霉素(50国际单位/毫升),链霉素(50μg / ml), 10%的有限公司₂描述(41]。到达融合,细胞分裂1:3。最后实验,细胞被播种到96年——或者6-well板块(最终的细胞的数量每1×10⁵)和类似井的数量与中独自孵化(基底)或有机硝酸盐浓度增加(ISMN GTN, ISDN) 24小时。96 -孔板是由l - 012用于ROS测量增强化学发光分析(100μ米)在PBS含有钙和镁(1毫米)。6-well板块与PBS缓冲洗两次,干,在液态氮冷冻和储存在−80°C,直到点污点分析il - 6的内容。兔多克隆抗体对il - 6 (Abcam 1: 5000年,剑桥,英国)以及使用二级peroxidase-conjugated兔抗体(向量实验室。1:10000年,伯林盖姆,CA)描述(42]。光密度的antibody-specific点进行量化ChemiLux成像仪(csx - 1400 M,落脚,哥廷根,德国)和Gel-Pro分析仪软件(媒体控制论,马里兰州贝塞斯达)。

2.3。隔离从人体血液白细胞和测量氧化破裂和炎症

处理人类所有材料符合赫尔辛基宣言,并经当地机构伦理委员会批准。人类从健康的志愿者是采集的新鲜全血heparin-containing Monovettes(3×7.5毫升)。多形核白细胞(中性粒细胞,中性粒细胞)沉降分离的红细胞与右旋糖酐和随后的离心聚蔗糖如前所述[43]。在重复低渗的裂解细胞的颗粒与纯水消除残余红细胞,白细胞总数和中性粒细胞的纯度分数是评估使用一个自动化的方法与血液学分析仪KX-21N (Sysmex欧洲GmbH, Norderstedt,德国)。典型的宪法的血细胞之前我们报道该方法获得的分数(44]。中性粒细胞的激活(10⁴细胞/毫升)量化了活性氧形成氧化破裂中回应佛波醇酯衍生物(PDBu 1μ使用l - 012 M)增强化学发光(ECL) (100μ米)与1毫米PBS钙/镁在37°C Centro板读者,使用96孔板,200μl每口井的样品,和ECL信号(数量/ s) 20分钟(坏Wildbad Berthold技术,德国)。

过氧化物形成刺激中性粒细胞(10⁶细胞/毫升,10μM在PBS PDBu 1毫米钙/镁)是由孵化与50μM dihydroethidium(她)30分钟在37°C和量化superoxide-specific氧化产品2-hydroxyethidium(他)高效液相色谱法(HPLC)描述(45]。50μl的上层清液进行高效液相色谱分析。这个系统由一个控制单元,两个泵、搅拌机、探测器,柱温箱,脱气装置,和一个autosampler (- 2057 +) Jasco (Groß-Umstadt、德国)和C₁₈-Nucleosil 100 - 3(125×4)列从Macherey-Nagel (Duren,德国)。高压梯度分析,50 mM柠檬酸缓冲pH值2.2(溶剂)和乙腈10%水(溶剂B)移动阶段与有机溶剂的百分比如下:0分钟,40% B;7分钟,45% B;8 - 12分钟,100% B;13分钟,40%。流1毫升/分钟,她是被其吸收355海里,而2-hydroxyethidium和ethidium被荧光检测(480 nm / Em。580海里)。的影响macitentan ROS和过氧化物的形成是由coincubation macitentan浓度增加(1 - 1000μ米)。

2.4。动物和体内治疗

所有动物都是依法处理指导实验室动物保健和使用的采用美国国立卫生研究院。所有动物实验协议综述了伦理委员会的约翰内斯古腾堡大学医学中心和经Landesuntersuchungsamt(科布伦茨,德国;# 23177 - 07年/ G 12-1-084和G 12-1-084)。组织筹备工作都是根据已建立的标准执行人道对待动物。雄性Wistar鼠(8周大,350克)来自查尔斯河实验室(Sulzfeld、德国)和根据标准操作程序被安置在动物设施的约翰内斯古腾堡大学和服用ISDN(0, 10、25或50毫克/公斤/天)通过政府在7天的饮用水。雄性C57BL / 6 j小鼠(10 - 12周大,25 - 30 g)是来自我们自己的内部动物设施和根据标准操作程序被安置在动物设施的约翰内斯古腾堡大学。老鼠接受ISMN(75毫克/公斤/天)或ISDN(25毫克/公斤/天)或车辆单独(二甲亚砜(DMSO))通过皮下渗透迷你泵(美国ALZET模型2007年,Cupertino)为7天(31日,45]。氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉下所有行手术(1毫升/公斤的准备使用的解决方案包含80毫克/毫升氯胺酮和甲苯噻嗪12毫克/毫升,Sigma-Aldrich)。控制泵应用的溶剂(DMSO)。cotherapy,我们使用口服剂量30毫克/公斤/天macitentan疗法(填喂法,每天一次)46]。经过一个星期的有机硝酸盐治疗有或没有macitentan治疗大鼠或小鼠被放血在异氟烷麻醉,和血液,主动脉,收集和心脏。

2.5。等长张力录音

(描述的方法是第一个47]。每胸主动脉血管周的脂肪被撤,两环段(长度5 - 6毫米)被用于等距张力的研究每个鼠标或老鼠。环段被preconstricted氯化钾浓度的方式(80毫米最大浓度)为了测试的功能完整性的组织。接下来,环段被前列腺素preconstricted F_2α(2 - 4μ为老鼠或苯肾上腺素(0.5米)1μ米)对大鼠产生一个稳定的高原50 - 60%的收缩最大KCl-dependent血管收缩。Concentration-relaxation曲线响应增加乙酰胆碱的浓度(ACh), ISMN、ISDN、GTN进行描述(18,48,49]。Concentration-constriction ET-1浓度增加曲线响应进行主动脉环没有preconstriction描述(18]。

2.6。检测Nitrosative压力由EPR谱全血

有机nitrate-derived^⋅没有水平全血测定使用电子顺磁共振(EPR)谱nitrosyl-iron血红蛋白(HbNO) [50]。HbNO可以被视为读出nitrosative压力在全血之前报道GTN-induced公差在老鼠51]或lipopolysaccharide-triggered内毒素在老鼠和老鼠52]。样本静脉麻醉大鼠的血液通过心脏穿刺获得;血液样本被临时冻结,后来存储在液氮中。EPR测量进行了在77 K使用一个x波段桌面光谱仪MS400 (Magnettech,柏林,德国)。仪器设置如下:10兆瓦的微波功率,7000毫克调幅,100 kHz频率调制,中心场3300克、300克扫描宽度,60年代的扫描时间,3扫描。HbNO水平表示为任意单位的第一个峰值强度三联体的信号特征。

2.7。点污点和免疫印迹分析

3-nitrotyrosine——(3 nt)积极的水平蛋白质和F4/80表达式被点污点分析评估(31日,53]。3 nt的检测,主要鼠单克隆抗体硝基酪氨酸(美国Billerica微孔)的稀释1:使用1000年。F4/80成像的主要鼠单克隆抗体F4/80(美国eBioscience,圣地亚哥,CA)使用的稀释1:250。发射极耦合逻辑进行了检测和量化的peroxidase-conjugated二级抗体鼠标或鼠(向量实验室。1:10000年,伯林盖姆,CA)。光密度量化antibody-specific点进行如上所述。

孤立的从小鼠主动脉组织在液态氮冷冻,均质在缓冲区(Tris-HCl 20毫米,蔗糖250毫米,乙烯glycol-bis (β氨乙基醚)- N, N, N ,N - - - - - -四乙酸(EGTA) 3毫米,乙二胺四乙酸(EDTA) 20毫米,蛋白酶抑制剂鸡尾酒(罗氏公司完成,1片在100毫升),和triton - x - 100 1v/v%)。在硝化纤维膜蛋白分离通过sds - page和涂抹(18,53]。阻塞后,与下面的抗体进行免疫印迹:多克隆老鼠β肌动蛋白(42 kDa)α辅肌动蛋白(100 kDa)作为加载和控制转移(美国从Sigma-Aldrich)单克隆鼠标NADPH氧化酶2 (BD生物科学NOX-2, 1: 500年,美国),和多克隆兔等_B受体(等_B1:5000年,美国Abcam)。发射极耦合逻辑进行了检测和量化的peroxidase-conjugated二级抗体老鼠或兔子(向量实验室。1:10000年,伯林盖姆,CA)。光密度定量进行如上所述。

2.8。免疫组织化学(包含IHC)分析ET-1表达式

主动脉样本固定在多聚甲醛(4%),嵌入在石蜡,沾主要鼠抗体ET-1(皮尔斯#马- 005:1:200)。生物素化的二次抗体(包括anti-mouse M.O.M.工具包,矢量实验室。伯林盖姆)是用于稀释根据制造商的指示。免疫化学检测,ABC试剂(向量),然后轻拍试剂(过氧化物酶底物装备,向量)作为底物。

2.9。评估氧化应激和NADPH氧化酶活动在心脏和主动脉

膜NADPH氧化酶活动分数的心脏组织是由lucigenin (5μ在200年的存在M)发射极耦合逻辑μM NADPH [42,43]。ROS在主动脉组织中形成,孤立的主动脉环段是OCT-embedded(美国Tissue-Tek)和染色dihydroethidium(她1μ米)、氧化荧光微貌决定报道(53,54]。

2.10。实时逆转录聚合酶链反应(存在)

信使rna表达进行了分析和定量实时rt - pcr(如前所述41,42,54]。简而言之,总RNA从小鼠主动脉或心脏被隔离(RNeasy纤维组织小型设备;试剂盒、希尔登,德国),50 ng的总RNA与QuantiTectTM探针用于实时rt - pcr分析rt - pcr试剂盒(试剂盒)。TaqMan®NADPH氧化酶的基因表达分析同种型2 (NOX-2) endothelin-1b受体(等_BR), endothelin-converting enzyme-1 (ECE-1)、单核细胞化学引诱物蛋白1 (MCP-1) CD11b,白细胞介素- 6 (il - 6)和塔塔框结合蛋白(真沸点)购买探针和引物组(应用生物系统公司,培育城市,CA)。比较Ct方法用于相对mRNA量化。基因表达是规范化内生控制(真沸点mRNA)和目标基因mRNA表达在每个样本表示相对于控制。

2.11。统计分析

结果表示为±SEM。双向方差分析(与Bonferroni调整比较多个意味着)用于比较的血管舒张药效力和有效性。单向方差分析(Bonferroni或邓恩的校正的比较多个意味着)被用于所有其他参数的比较。值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。研究培养和孤立的免疫细胞

在培养生264.7细胞巨噬细胞、GTN ISDN, ISMN增加氧化破裂信号在这些巨噬细胞在佛波醇酯刺激(数字1(一)-1(c))。Suprapharmacological浓度的ISDN和ISMN抑制ROS信号(数字1(b)和1(c)),可能由于释放^⋅没有淬火超氧化物阴离子。因此,我们建立了高蛋白质酪氨酸硝化水平更高浓度的GTN(图1(d))。所有有机硝酸盐在这些巨噬细胞il - 6表达增加,至少在一个特定的浓度(数字1(e) -1(g))。内皮素受体阻滞剂macitentan抑制超氧化物信号佛波醇ester-stimulated人类粒细胞(中性粒细胞)(图2),在这个过程中表明内皮素信号的作用。

3.2。试点研究ISDN的老鼠

因为之前我们没有专业知识在ISDN体内治疗的动物,老鼠体内剂量反应研究。ISDN是饮用水管理增加剂量。ISDN剂量的25 - 50毫克/公斤/ d诱导内皮功能障碍不显著,尽管受损acetylcholine-dependent放松的趋势(图可见3(一个))。相比之下,ISDN-dependent放松明显受损,以应对25 - 50毫克/公斤/天的ISDN(10毫克/公斤/天concentration-relaxation曲线)的一个点表示一个温和的硝酸盐对ISDN(图的高剂量3 (b))。治疗与ISDN 25毫克/公斤/天也导致过敏性血管收缩剂ET-1(图3 (c))。成功吸收药物的有效剂量测试测量的nitrosyl-iron血红蛋白(HbNO)、全血的一个标志nitrosative压力由于高水平的NO-derived nitrosating物种之前我们报道endotoxin-induced败血症或硝酸GTN-induced宽容。ISDN的治疗剂量依赖性增加了老鼠的全血HbNO水平证明药物的成功交付剂量(图3 (d))。根据我们之前的经验成功南卡罗来纳州ISMN管理局通过渗透老鼠迷你泵和目前发现在口头ISDN-treated老鼠缺乏内皮功能障碍,我们决定使用的南卡罗来纳州协议ISMN ISDN管理局小鼠模型。成功吸收ISMN(75毫克/公斤/天)和ISDN(25毫克/公斤/天)在有效剂量测试测量nitrosyl-iron血红蛋白(HbNO)。有机硝酸盐诱导一个明确检测HbNO信号,这是几乎2倍ISMN组(图3 (e))。Macitentan nitrosative压力信号在两组减少了大约50%,至少在趋势。

3.3。ISMN体内治疗

3.3.1。血管功能和心血管氧化应激小鼠主动脉参数

ISMN治疗导致内皮功能障碍,但没有明显的宽容ISMN,无交叉抗性GTN(数据4(一)- - - - - -4 (c))。内皮功能障碍是提高macitentan cotherapy(图4(一))。脉管系统的敏感性前列腺素F_2α端依赖收缩既不影响ISMN治疗或macitentan cotherapy(图4 (d))。ISMN主动脉ROS增加生产由macitentan纠正cotherapy(图5(一个))。心脏蛋白质酪氨酸硝化,作为标记在活的有机体内过氧亚硝基形成,增加了ISMN疗法和规范化macitentan(图5 (b))。心脏NADPH氧化酶活性增加了macitentan ISMN和规范化(图5 (c))。然而,这些氧化压力参数更有效地在心脏组织规范化和主动脉组织相比,表明不同的ROS的贡献来源ISMN-mediated这些组织的氧化损伤。

3.3.2。蛋白质和mRNA表达

主动脉NOX-2蛋白表达显著增加了ISMN治疗和减少macitentan(数字6(一)和6 (c))。表达模式几乎是类似在mRNA水平(图7(一))。的蛋白表达等_B受体没有修改(图6 (b)- - - - - -6 (c))。蛋白质水平的炎症标记物增加主动脉ISMN-treated小鼠所设想的更高F4/80表达式(图6 (d)),而且MCP-1和CD11b (mRNA表达水平的数据7 (b)- - - - - -7 (c)),所有这些大多是规范化macitentan cotherapy。ET-1蛋白表达是设想通过免疫组织化学和ISMN组更明显(图6 (e))。的mRNA表达endothelin-converting enzyme-1 (ECE-1)显示无显著变化(图7 (d))。

3.4。ISDN体内治疗

3.4.1。血管功能和心血管氧化应激小鼠主动脉参数

ISDN治疗导致内皮功能障碍,但没有明显的宽容ISDN和交叉抗性GTN(数字8(一个)- - - - - -8 (c))。内皮功能障碍明显改善macitentan cotherapy(图8(一个))。前列腺素F_2α端依赖收缩既不影响ISDN治疗或macitentan cotherapy(没有显示)。主动脉ROS形成明显增强,以应对ISDN和规范化macitentan(图8 (d))。

3.4.2。信使rna表达

的mRNA表达Nox2不是增加了ISDN注入,而是显示一个健壮的减少macitentan cotherapy(图9(一个))。的mRNA表达ECE-1呈现增加趋势在ISDN治疗和一个完整的规范化与macitentan cotherapy(图9 (b))。的mRNA表达炎症的标记,MCP-1,增加了ISDN注入和规范化macitentan cotherapy,通过趋势(图9 (c))。细胞因子il - 6的mRNA水平增加了ISDN注入和规范化与macitentan cotherapy(图9 (d))。免疫组织化学染色对ET-1透露一个小ISDN集团和适度增加减少macitentan疗法(图9 (e)

4所示。讨论

本研究的结果表明,有机硝酸盐ISMN和ISDN导致增加全血nitrosative压力和血管/心脏氧化应激,激活ET受体信号通路,诱导的炎性表型血管系统导致内皮功能障碍。通过使用双重ET受体阻滞剂macitentan,我们能够避免这些主要心血管副作用的有机硝酸盐治疗(虽然氧化应激参数本身更有效的规范化的心比主动脉指向不同的ROS数据源所激活的ISMN治疗这些组织),进一步支持ET受体信号的一个关键的角色在这些ISMN / ISDN-induced副作用。小说方面目前的研究中,除了评估保护作用的双重ET受体阻滞剂macitentan硝酸设置的宽容,主要是识别的基础上增加ET-1表达式,过敏性ET-1-dependent血管收缩,紧随其后的是不良ET受体信号,增加氧化应激,炎症和血管功能障碍ISDN-treated动物。ISDN-induced内皮功能障碍之前所示人类但却没有提供一个机械的解释(55]。

之前的研究,我们小组和其他证明GTN和ISMN治疗移植ET-1表达动物的血管(18- - - - - -20.]。唯一的有机硝酸盐到目前为止是没有硝酸盐治疗的主要临床副作用(如硝酸氧化应激和宽容)是季戊四醇四硝酸酯(PETN) (1,27]。这是在健康受试者(56),肺动脉高血压患者(57),在慢性稳定性心绞痛患者58),在子痫前期的女性59),或在实验模型如1型糖尿病,动脉高血压、肺动脉高压(30.,31日,39,60)以及充血性心力衰竭(61年,62年]。以季戊四醇四硝酸酯治疗会导致高保护性酶的诱导血红素oxygenase-1 (HO-1),铁蛋白(63年- - - - - -66年),谷胱甘肽过氧化物酶(60)和超氧化物歧化酶重新挂钩以挪士(67年)导致改善动员内皮祖细胞(68年]。以季戊四醇四硝酸酯的保护作用不是由GTN共享,ISMN或ISDN和需要转录因子Nrf-2 [30.,69年)和缺席HO-1基因敲除小鼠(31日]。因此,以季戊四醇四硝酸酯诱导抗氧化酶基因表达,一个属性不是由GTN共享70年和可能由有益的表观遗传变化71年]。

与肺动脉高压大鼠,我们最近证明,以季戊四醇四硝酸酯干扰ET-1信号(ECE-1 downregulation ET-1的,等_一个和等_B受体信使rna表达),从而改善心脏和血管功能和减少心血管和肺部氧化应激和炎症(39]。此外,以季戊四醇四硝酸酯抑制ET受体激动剂引起的氧化破裂bq - 3020全血白细胞和规范化粘附分子(ICAM-1) mRNA表达培养内皮细胞(EA.hy926)。这些数据进一步突出ET受体信号的关键作用的不利影响有机硝酸盐和强调ISMN患者的潜在好处,ISDN、GTN macitentan等结合ET受体阻滞剂。相比之下,ET受体阻滞剂cotherapy可能不会进一步改善的临床效益以季戊四醇四硝酸酯治疗,因为这种有机硝酸已经没有大多数临床副作用如硝酸宽容,内皮功能障碍和氧化应激由于内在感应保护途径(27,72年- - - - - -74年和抑制ET受体信号通路39]。

到目前为止,它不是完全明白ET-1增加血管过氧化物的形成。ET-1激活NADPH氧化酶和导致高血压炎症动物(33,34),反之亦然,NADPH oxidase-derived超氧化物形成增加ET-1-mediated血管收缩(35),最有可能由氧化应激preproET-1基因启动子的激活(36,37]。GTN疗法激活蛋白激酶C (PKC) [19)和PKC活动增加诱发的表达等_B受体(75年]。PKC激活所需的NADPH氧化酶亚型NOX-1 NOX-2。此外,ET-1触发PKC-dependent以挪士解偶联和随后的内皮功能障碍;这些都是提高了应用波生坦治疗76年]。因此,NADPH氧化酶途径,尤其是NOX-2同种型,以及ET-1信号之间相互关联,相互刺激,导致一个恶性循环NOX-2 / ET受体信号轴(审查,请参阅[2,38])。激活PKC的有机硝酸盐和ET-1甚至可能变得越来越重要在更广泛的背景下由于PKC激活树突状细胞和成熟的主要监管机构中扮演着中心角色适应性免疫反应的抗原加工(交叉)激活的T细胞(77年]。

NOX-2免疫和血管细胞代表ROS的重要来源,它在心血管疾病的发病机制中发挥重要作用,尤其是nitrate-induced宽容和内皮功能障碍。NOX-2氧化还原调控的方式可以激活线粒体ROS生成如图所示的硝酸GTN-induced宽容和内皮功能障碍(45)以及血管紧张素II-induced高血压和衰老过程53,78年]。因此我们评估NOX-2表达式和氮氧化物活动以及不同的血管/心肌氧化应激标记。过氧化物水平升高与eNOS-derived反应^⋅不ONOO⁻(79年),它可以降低^⋅没有生物利用度,从而导致内皮功能障碍。我们评估nitrooxidative ISMN-treated老鼠的压力在心脏组织3-NT-positive蛋白质含量反映了过氧硝酸盐增加(ONOO⁻ISMN)在血管形成和活性氧的形成——和ISDN-treated老鼠她荧光微貌。氧化应激的参数都明显增加有机nitrate-treated动物和规范化macitentan cotherapy。

自从macitentan对ISMN-dependent NOX-2激活和表达很明显,在其抗炎作用的同时,我们提出了一个关键的角色NOX-2 ISMN观察血管的不利影响的(也许还ISDN)治疗。然而,由于NOX-2活动的抑制/表达macitentan更明显比ET受体抑制氧化应激参数的封锁,我们也不能排除其他ROS来源(例如,线粒体、NOX-1或NOX-4)导致整个ISMN或ISDN治疗引起的氧化应激状态。不同来源的活性氧主动脉的贡献和心脏也可以解释为什么macitentan治疗对氧化应激的影响参数这些组织并不总是具有可比性。

我们还提供过度的证据^⋅没有一代血液中通过ISDN / ISMN(反映在增加HbNO = nitrosative压力),也曾报道GTN治疗(80年]。最近,我们显示主动脉^⋅没有生物利用度可以减少GTN-treated老鼠(81年尽管大幅增加^⋅没有相关nitrosyl-iron血红蛋白(HbNO)这些大鼠的全血51]。因此,观察到的部分ISMN HbNO水平正常化,ISDN-treated macitentan老鼠可能被解释为有益的ET受体阻断剂。

众所周知,有机硝酸盐激活免疫细胞,刺激免疫cell-dependent活性氧的形成。在我们的以前的研究,我们建立GTN剂量依赖性增加氧化破裂信号全血(51)和AT1受体阻滞剂替米沙坦治疗有效地抑制这种破裂。(29日]。此外,体内治疗GTN redox-sensitive酶线粒体醛脱氢酶的活动减少(ALDH-2)分离白细胞GTN-treated人类志愿者和大鼠(44)和全血自由基增加(28),兼容免疫细胞激活和在这些细胞氧化还原状态的改变对治疗的反应与有机硝酸。ISMN体内疗法以及体外与ISMN挑战,真正ET-1或ET-1_一个受体激动剂bq - 3020引起白细胞激活(18,39],它被应用波生坦cotherapy在选定的实验。

ISMN、ISDN、GTN刺激氧化破裂和培养的巨噬细胞释放细胞因子il - 6,和macitentan人类白细胞抑制氧化破裂信号隔离。这些数据,连同上述炎症的性质ET-1 [33,34),提供ET受体信号之间的直接联系,炎症的发病和氧化应激反应有机硝酸盐治疗,进一步支持上述假定的恶性循环NOX-2 / ET受体信号轴。

本研究的一个重要的观察是,ISDN是导致内皮功能障碍,显然是与氧化应激和激活ET-1血管收缩的途径。有趣的是,ISDN和肼苯哒嗪已被证明有很强的有益的和持久的血流动力学效应,也被证明改善慢性充血性心力衰竭患者的预后82年,83年),可能是因为nitroso-redox平衡的改善(84年]。既然我们证明了肼苯哒嗪是强大的过氧亚硝基冷却器在GTN-induced血管功能障碍(85年,86年),有理由得出这样的结论:ISDN和肼苯哒嗪不仅一起协同工作从血流动力学的角度,肼苯哒嗪可能发挥作用的抗氧化性能,从而防止ISDN-induced血管功能障碍和促炎由其抗氧化性能的影响。

5。结论

我们这里第一次证明内皮功能障碍引起的ISDN与氧化应激增加,endothelin-1感应在维管组织提供一个机械的解释前所述ISDN-induced人类内皮功能障碍(55]。内皮素受体阻滞剂治疗macitentan阻止内皮功能障碍(乙酰反应),血管/心脏氧化应激(她染色、3 nt lucigenin ECL),内皮素受体信号通路的激活,引起血管的炎性表型ISMN和ISDN疗法(图10)。因此,我们目前的数据确定一个恶性循环的NOX-2 / ET受体信号引起的轴ISMN / ISDN导致增强NOX-2活动和ET受体信号。进一步的临床调查必须证明这些副作用ISMN / ISDN疗法可以克服ET受体拮抗(例如,通过macitentan)在人类身上。内皮素受体拮抗剂的长期管理atrasentan已被证实能改善患者的冠状动脉内皮功能早期动脉粥样硬化(87年)和自分泌生产endothelin-1占53.2%的冠状动脉语气先进移植冠状动脉硬化(88年),使cotherapy与内皮素受体拮抗剂在冠状动脉粥样硬化患者非常有吸引力,也代表有机硝酸盐治疗的主要目标群体1,2]。最后,我们目前的数据也证实了独特的属性以季戊四醇四硝酸酯的临床nitrovasodilator药物引起的感应内在抗氧化/防护途径[27,72年,73年和抑制ET受体信号39),强调有机硝酸盐不是同质类药物(74年]。

缩写

3 nt:	3-Nitrotyrosine
哦:	乙酰胆碱
她:	Dihydroethidium
以挪士:	内皮细胞一氧化氮合酶
ECE-1:	Endothelin-converting enzyme-1
EPR:	电子顺磁共振
等:	内皮素
ET-1:	Endothelin-1
等一个受体:	内皮素受体A型
等B受体:	内皮素受体B型
GTN:	硝化甘油
HbNO:	Nitrosyl-iron血红蛋白
il - 6:	白细胞介素- 6
ISDN:	硝酸异山梨酯
ISMN:	Isosorbide-5-mononitrate
MCP-1:	单核细胞化学引诱物蛋白1
⋅没有:	一氧化氮
氮:	NADPH氧化酶
O2⋅−:	过氧化物
以季戊四醇四硝酸酯:	季戊四醇四硝酸酯
ROS:	活性氧
南卡罗来纳州。	皮下注射。

数据可用性

在生成的数据集和/或分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。

信息披露

的工作包含的部分论文Siyer Roohani。数据提出了在目前的手稿的一部分作为一个海报和口头表示国会的欧洲心脏病学会(ESC) 2017年在巴塞罗那(西班牙)和德国心脏协会的年度会议在曼海姆(DGK) 2017(德国)。会议摘要发表在欧元。心J。2017;38 (S1): ehx504。P3470 -10.1093 / eurheartj / ehx504.P3470在中国。研究》心功能杂志。2017;106 (S1): V43——DOI10.1007 / s00392 - 017 - 1105 - 2。

的利益冲突

Andreas Daiber和托马斯·Munzel收到Actelion股价制药研究拨款支持德国GmbH(德国弗莱堡im Breisgau)。克里斯汀·鲍姆的员工Actelion股价制药德国GmbH(德国弗莱堡im Breisgau)。Marc Iglarz Actelion股价制药有限公司的员工(Allschwil、瑞士)。所有其他作者没有利益冲突。

作者的贡献

轮和公元的构思和设计研究;轮,犯罪手法,M.H., S.R., F.K., S.K.-S., J.H., and T.J. carried out the experiments; C.B. and M.I. contributed with the analytic tools; S.S., M.O., M.H., and A.D. performed the data analysis; S.S. and A.D. drafted the manuscript. E.S. and T.M. made critical contribution to the discussion. M.O., C.B., M.I., E.S., and T.M. revised the manuscript. All authors read and approved the final manuscript.

确认

我们感谢当归Karpi, Jorg称,妮可·格拉斯,杰西卡·鲁道夫,贝蒂娜的mro专家技术援助。目前的工作是由血管生物学研究拨款Actelion股价制药德国GmbH弗莱堡im Breisgau(公元和T.M.),金融支持的基金会美因茨赫兹(公元和T.M.)和德国心脏基金会/德国基金会的心脏研究(F / 42/13号)。塞巴斯蒂安·史蒂文持有Virchow奖学金从血栓和止血的中心(美因茨,德国)由联邦教育部和研究(BMBF 01 eo1003党卫军公元,TRP3)。Siyer Roohani和今天沙尼支持由罗伯特·穆勒的医学博士论文奖学金基金会(美因茨,德国)。

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