文摘

胡芦巴(生长foenum-graecuml .)是一个著名的一年生植物,在世界范围内广泛分布,具有明显的低血糖和高胆固醇血症的特点。在我们之前的研究中,多酚三芪从胡芦巴种子中分离了出来。在这里,我们调查的影响多酚对称二苯代乙烯在3 t3-l1脂肪细胞脂肪形成和胰岛素抵抗。油红O染色和甘油三酯化验表明,多酚不同的对称二苯代乙烯脂质积累减少了抑制adipocyte-specific蛋白质的表达。此外,多酚芪改进的2 - (N - (7-nitrobenz-2-oxa-1 3-diazol-4-yl)氨基)2-deoxyglucose (2-NBDG)通过促进磷酸化蛋白激酶B(一种蛋白激酶)和活化蛋白激酶(AMPK)。在目前的研究中,发现多酚对称二苯代乙烯有能力清除活性氧(ROS)。结果三磷酸腺苷(ATP)生产和线粒体膜电位表明线粒体发挥重要作用在胰岛素抵抗和相关信号激活,如AKT, AMPK。Rhaponticin,胡芦巴的对称二苯代乙烯,最强的活动在三个化合物体外。未来的研究将集中在线粒体生物起源和功能。

1。介绍

胡芦巴(生长foenum-graecuml .)是一个著名的一年生植物,属于豆科植物家族,广泛分布在中国,印度,和北非国家(1]。胡芦巴被广泛用作食用蔬菜和药用植物几十年(2]。分数已报告的种子和一些具有广泛的生理和药理作用3,4),包括抗氧化剂(5,6),低血糖(7- - - - - -10),高胆固醇血症(11- - - - - -13),和免疫调节活动14]。不同的胡芦巴有益的功能有关的各种自然组件(15]。胡芦巴被报道含有半乳甘露聚糖,烟碱酸、生物碱、黄酮、水杨酸和氨基酸(16]。尽管一些研究已经表明,胡芦巴种子降低血糖水平,改善脂质代谢,有效成分是未知。在我们之前的研究中,我们成功地从胡芦巴种子提取分离和纯化化合物,包括不饱和脂肪酸(17[]、类黄酮和多酚物质18,19]。我们所知,这是第一个报告,多酚对称二苯代乙烯(rhaponticin、desoxyrhaponticin rhapontigenin)生长foenum-graecuml .种子可以通过高速逆流色谱(HSCCC)分离(图1)[20.]。


图1
从胡芦巴多酚的化学结构对称二苯代乙烯。

多酚化合物组成的一组物质具有不同化学结构和活动,广泛存在于自然界21]。在各种各样的植物酚类、芪最近吸引了广泛的科学的关注。白藜芦醇(3、5、4 -trihydroxy-trans-stilbene)是一个著名的多酚化合物,具有广泛的活动包括典型药物、抗糖尿病的心血管保护和神经保护属性(22]。最近的研究表明,其他多酚芪可能有类似的甚至更高的生物利用度比白藜芦醇(23]。虽然有几种报告在胡芦巴的活性成分,是知之甚少的影响多酚芪葡萄糖和脂类代谢及其作用机制尚未阐明。

在我们之前的研究中,我们展示了降糖效果的胡芦巴提取物对链脲霉素(STZ)——诱导2型糖尿病与高脂肪食物的老鼠。结果暗示芪提取物的抗糖尿病的作用是抗氧化的影响(24]。因此,在当前的研究中,我们调查的影响多酚对称二苯代乙烯从胡芦巴种子脂质积累和3 t3-l1脂肪细胞胰岛素抵抗在体外。探索行动的潜在机制,调制的对称二苯代乙烯AMPK途径和活性氧(ROS)也进行了讨论。

2。材料和方法

2.1。分化3 t3-l1 Preadipocytes和诱导胰岛素抵抗脂肪细胞

3 t3-l1细胞从细胞获得银行上海生物化学与细胞生物学研究所(上海,中国)。Preadipocytes培养在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)含10%小牛血清(CS), 1.5 g / L碳酸氢钠,1% penicillin-streptomycin解决方案。细胞培养在37°C在湿润的气氛中含5%股份有限公司2每隔一天,媒介是取代,直到细胞汇合的。如前所述(25),3 t3-l1细胞完全分化成熟的脂肪细胞和诱导胰岛素抵抗增强脂肪细胞26)(图2)。


图2
时间轴3 t3-l1分化和诱导胰岛素抵抗。CS / DMEM: 10%小牛血清/杜尔贝科修改鹰的媒介;IMI(感应媒体我):10%胎牛血清(的边后卫)/ DMEM + 0.5更易与L isobutylmethylxanthine (IBMX) + 1μmol / L地塞米松(Dex) + 10μg / mL胰岛素;IMII(感应媒体II): 10%的边后卫/ DMEM + 1μg / mL胰岛素;的边后卫/ DMEM: 10%的边后卫/ DMEM;IMIII(感应媒体III): 10%的边后卫/ DMEM + 1μmol / L敏捷。
2.2。细胞生存能力分析

所有测试化合物来自西藏医学研究的重点实验室,西北高原生物研究所、中国科学院(西宁,中国),包括rhaponticin (RHAc) desoxyrhaponticin (dRHAc)和rhapontigenin (RHAg)。细胞生存能力评估的乳酸脱氢酶(LDH)测定。3 t3-l1 preadipocytes被播种在96 -孔板(0.5×104细胞在DMEM /)中没有丙酮酸钠和含10%胎牛血清的边后卫。细胞培养24小时在37°C,直到confluency分别处理0 - 100μmol / L RHAc、dRHAc RHAg 48小时。然后,介质被转移到1.5毫升微型离心管,离心12000×g和4°C 10分钟删除任何细胞碎片。总共有500μL上层清液加入底物溶液,在490海里使用分光光度计测量吸光度(弗吉尼亚州Chantilly光谱MRTM、丹尼克斯技术,美国)根据制造商的指示LDH的细胞毒性试验包(Beyotime生物技术有限公司、北京、中国)。细胞外的LDH活性在媒体上表示为正常对照组的100%。

2.3。油红O染色

评估的影响RHAc、dRHAc RHAg在3 t3-l1脂肪细胞脂质积累,细胞使用10μmol / L /复合成熟开始前2天。3 t3-l1 preadipocytes分化如上所述在Lab-Tek®有房间的封面眼镜(Nalge Nunc国际内伯威尔市,,美国)。经过诱导的胰岛素抵抗和预处理的化合物,分别3 t3-l1成熟脂肪细胞与PBS轻轻清洗,中性的福尔马林固定在10%。细胞渗透使用0.5% Triton-X 100和沾油红O过滤解决方案(异丙醇60%,水40%)在室温下30分钟。多余的油红O染色与70% EtOH被清洗三次。彩色油滴在3 t3-l1细胞成像使用光学显微镜(日本奥林巴斯)。

2.4。甘油三酯测定

评价细胞内甘油三酯(TG)含量,3 t3-l1 preadipocytes培养在12-well盘子下一节所述2。3。confluency,细胞被洗两次冰冷的磷酸盐在冰冷的裂解缓冲(PBS)和收获。溶菌产物总TG含量是衡量使用TG分析工具,和细胞蛋白质决定使用bicinchoninic酸(BCA)蛋白质化验用品(南京建成生物工程研究所、南京、中国)。

2.5。免疫印迹分析

下一节所述2。33 t3-l1 preadipocytes轻轻地播种到6-well板(1.5×105细胞/)。在成熟或诱导胰岛素抵抗3 t3-l1脂肪细胞,细胞分别对待RHAc, dRHAc, RHAg 2天。然后,细胞被洗瞬间冰冷的PBS,收获于200年μL裂解缓冲,溶解产物离心机在12000 g×20分钟在4°C。上层清液的蛋白质含量测定采用BCA化验设备。细胞溶解产物是由钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和蛋白质都被转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜使用Bio-Rad电泳设备。膜被封锁在Tris-buffered盐水与5%脱脂牛奶含有0.05% Tween-20 (TBST) 1小时在室温和孵化一夜之间与主要抗体(1:1000年,圣克鲁斯生物技术、钙、美国)在4°C。膜清洗和孵化与辣根过氧化物酶(合)共轭二次抗体(武汉博士德生物技术有限公司,中国)在室温下2小时。膜清洗和免疫反应性的蛋白质是可视化使用增强化学发光(ECL)试验设备(Beyotime生物技术有限公司、北京、中国)根据制造商的指示。蛋白质乐队进行了分析使用5200多发光图像分析仪(Tanon科技上海有限公司,中国)。

2.6。2-NBDG吸收

下一节所述2。13 t3-l1 preadipocytes轻轻地播种到12-well板(0.8×105细胞/)和使用RHAc, dRHAc, RHAg诱导胰岛素抵抗前2天。接下来,脂肪细胞被洗两次与PBS和介质改为glucose-free DMEM包含100 nmol / L的胰岛素。1小时后,100年μmol / L 2-NBDG是添加到培养基和细胞培养另一个30分钟。然后,细胞与PBS洗了三次,使胰蛋白酶化,在黑暗中收集。荧光测定(激发在485/20 nm和发射在540/20 nm)使用FACSAria™流式细胞分析仪(美国加利福尼亚州圣何塞,正欲)。并给出了数据作为20000个细胞的平均荧光信号。

2.7。活性氧的检测

节中描述2。63 t3-l1 preadipocytes被播种到6-well板(1.5×105/)和细胞培养在37°C。诱导胰岛素抵抗,3 t3-l1脂肪细胞治疗与RHAc dRHAc, RHAg 2天。然后,细胞被洗与新鲜,prewarmed PBS和孵化10μmol / L 2 ,7 二乙酸二氯荧光素(DCFH-DA)染料为30分钟37°C。然后,细胞被洗两次与PBS和收获0.25%胰蛋白酶溶液。发现了释放细胞内ROS FACSAria流式细胞分析仪波长的470/530 nm(前/ em)。提供的数据是20000个细胞的平均荧光信号。

至于线粒体活性氧的检测,DCFH-DA被5所取代μM MitoSOX试剂(热费希尔科学,北京)和检测波长的510/580 nm(前/ em)。

2.8。ATP水平的测量

节中描述细胞进行预处理2。7。与RHAc诱导胰岛素抵抗和治疗后,dRHAc RHAg,细胞被洗两次,冰冷的PBS和收获0.25%胰蛋白酶溶液。ATP的水平是由分光光度计(弗吉尼亚州Chantilly光谱MRTM、丹尼克斯技术,美国)和ATP生物发光分析工具包(Beyotime生物技术有限公司、北京、中国)根据制造商的指示。

2.9。线粒体膜电位的监控

节中描述细胞进行预处理2。8,收获0.25%胰蛋白酶溶液,并与PBS洗两次。然后,细胞resuspended在温暖DPBS包含10μM JC-1 (Sigma-Aldrich)和孵化37°C 30分钟。接下来,细胞被洗一次prewarmed PBS和离心机(1000 g×5分钟)。然后,细胞被轻轻resuspended和分析FACSAria流式细胞分析仪488海里激发。

2.10。统计分析

数据提出了均值±SD从三个独立的实验。统计分析是由单向方差分析或学生的t以及使用统计分析软件SPSS 18.0版(美国SPSS,芝加哥,IL)。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。细胞生存能力分析

多酚是对称二苯代乙烯的测量细胞外的细胞毒性LDH测定在媒体上(如图3(一个))。我们发现,多酚芪没有明显影响的可行性3 t3-l1 preadipocytes测试浓度的0.1 -10μmol / L 48小时。因此,三个多酚的浓度芪被确认为10μmol / L以下实验。和1μmol / L罗格列酮作为一个积极的控制。

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图3
多酚对称二苯代乙烯对生存能力的影响和3 t3-l1脂肪细胞的分化。(一)3 t3-l1 preadipocytes与不同浓度的多酚孵化芪48小时后细胞生存能力是由细胞外LDH测定在媒体上。数据的平均数±标准差表示为三个独立的实验。(b) 3 t3-l1 preadipocytes被诱导分化图中描述为8天2。脂滴被油红o染色反对:未分化3 t3-l1 preadipocytes;国防部:完全分化3 t3-l1脂肪细胞。(c) 8天,细胞甘油三酯(TG)含量测定总蛋白和规范化。数据作为三个独立实验的平均数±标准差( )。 成熟脂肪细胞与preadipocytes; , compound-treated脂肪细胞和成熟的脂肪细胞。(d) Adipocyte-specific蛋白表达在8天是由免疫印迹分析。
3.2。脂肪生成和TG分析

脂肪细胞分化过程中3 t3-l1 preadipocytes,脂滴的形成是一个典型的现象,作为标志的区别(27]。脂滴在分化3 t3-l1脂肪细胞被油红o染色图3 (b)观察表明,更大的液滴完全分化3 t3-l1细胞未分化的控制相比,细胞。这表明,明显脂肪生成发生分化。治疗RHAc和dRHAc显著降低脂滴的积累。量化细胞内脂质含量,TG水平测定。结果呈现在图3 (c)表明,在分化过程中,治疗RHAc, dRHAc, RHAg显著抑制细胞TG积累( 或 )。TG含量RHAc和dRHAc-treated细胞显著降低而成熟的细胞。这些数据表明,不同的多酚芪减少脂质积累在3 t3-l1脂肪细胞的分化。

3.3。在3 t3-l1分化Adipocyte-Specific蛋白的表达

脂肪细胞的分化从3 t3-l1 preadipocytes与adipocyte-specific基因的表达包括FAS、C / EBPα,PPARγ(28]。因此,我们调查了这些蛋白的表达(图3 (d))。在preadipocytes,这些蛋白质都表达了在低水平,成熟脂肪细胞的显著增加。一般来说,RHAc镇压这些蛋白质的表达,和dRHAc RHAg增加FAS和PPAR的水平γ。在一起,这些数据表明,多酚对称二苯代乙烯在脂肪生成的不同的效果紧密相关的调节脂肪细胞分化期间adipocyte-specific蛋白质的表达。

3.4。2-NBDG吸收

研究多酚对称二苯代乙烯对葡萄糖吸收的影响3 t3-l1脂肪细胞在胰岛素抵抗(IR),荧光脱氧葡萄糖模拟(2-NBDG)被用来测量葡萄糖吸收的速度。2-NBDG在不同的研究中得到了广泛的应用,特别是探索细胞代谢功能与过剩相关系统(29日]。如图4(一),2-NBDG吸收IR组显著降低。罗格列酮(Rosi),被称为积极的药物治疗胰岛素抵抗显著增加刺激在3 t3-l1脂肪细胞葡萄糖摄取1的浓度μmol / L。这些数据表明,本研究建立IR模型是成功的。治疗和RHAc dRHAc增强葡萄糖的吸收与IR组。

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图4
的影响多酚芪2-NBDG吸收和p-AKT p-AMPK表达式3 t3-l1脂肪细胞。(一)结果提出了三个独立实验的手段±SD ( )。 胰岛素抵抗(IR)成熟脂肪细胞和脂肪细胞; , compound-treated脂肪细胞与红外脂肪细胞。(b) p-AKT和p-AMPK表达式3 t3-l1脂肪细胞被免疫印迹分析确定。
3.5。P-AKT和P-AMPK表达

在以前的研究中,据报道,一种蛋白激酶和AMPK信号控制代谢紊乱至关重要,尤其是在胰岛素信号级联通过葡萄糖运输(30.]。我们确定的表达总Akt和phospho-Akt Ser473以及总AMPK phospho-AMPK Thr172通过免疫印迹分析,阐明多酚对称二苯代乙烯促进红外3 t3-l1脂肪细胞葡萄糖摄取。

数据呈现在图4 (b)展示的影响多酚一种蛋白激酶的激活AMPK对称二苯代乙烯。我们的研究结果表明,一种蛋白激酶的磷酸化和AMPK在红外脂肪细胞明显减少。胰岛素在100 nmol / L显著刺激一种蛋白激酶,AMPK活性。Rosi (1μmol / L),一个著名的AMPK激活用于这项研究显著逆转减少AMPK磷酸化。此外,RHAc治疗显示出非凡的效果比其他两个化合物。正如预期的那样,我们表明,治疗多酚对称二苯代乙烯增加ATP水平在红外3 t3-l1脂肪细胞(图5(一个))。

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图5
多酚对称二苯代乙烯对活性氧的影响生产3 t3-l1脂肪细胞。1μRosi和10 mol / Lμmol / L的三种多酚芪被用于实验。结果显示三个独立实验的平均数±标准差( )。 、红外成熟脂肪细胞和脂肪细胞; , compound-treated脂肪细胞与红外脂肪细胞。
3.6。ROS水平的检测

最近的研究表明,一些自然派生的活性成分可以防止代谢疾病。在脂肪细胞的增殖和分化,ROS的生成有关的AMPK激活(31日]。因此,在这项研究中,我们评估使用DCFH-DA染料ROS的产生。如图5(一个),细胞内ROS在红外快速调节脂肪细胞。在相同条件下,不同化合物治疗对ROS的产生不同的影响。例如,Rosi和RHAc显著降低ROS的表达( ),而对细胞内ROS RHAg没有明显的影响。

线粒体是细胞的主要提供者也主要食腐动物氧化应激。因此,我们观察线粒体ROS MitoSOX通过测量荧光。图5 (b)显示,线粒体ROS的红外脂肪细胞明显升高约40%相比,成熟的脂肪细胞。治疗Rosi和多酚对称二苯代乙烯对线粒体活性氧的清除(有明显的影响 或 )。综上所述,RHAc影响最显著的抑制ROS的生成,不管它是细胞内或线粒体。

3.7。ATP生产和线粒体膜电位

线粒体是真核细胞的“能量屋”。线粒体的主要功能是产生细胞能量来源,ATP。因此,ATP生产和可以用来评估线粒体膜电位函数。的membrane-permeant JC-1染料被广泛用于监控线粒体。JC-1染料生产potential-dependent积累在线粒体,显示荧光发射的转变从绿色(~ 529 nm)红色(~ 590 nm)。因此,线粒体去极化的比率下降表明,红/绿荧光强度(32]。图中给出的数据6建议红外脂肪细胞的线粒体功能显著受损( )。Rosi和RHAc可以显著增加ATP生产和线粒体膜电位。然而,RHAc的影响比Rosi。这些结果与化合物的活性氧清除能力评估之前,所图所示5。

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图6
的影响多酚芪ATP生产(a)和线粒体膜电位3 t3-l1脂肪细胞(b)。1μRosi和10 mol / Lμmol / L的三种多酚芪被用于实验。结果提出了三个独立实验的平均数±标准差( )。 、红外成熟脂肪细胞和脂肪细胞; , ,compound-treated脂肪细胞与红外脂肪细胞。

4所示。讨论

2型糖尿病(T2DM)病人体内已经成为世界上最重要的公共卫生问题。胰岛素抵抗似乎归因于渐进失效的2型糖尿病和代谢综合征(33]。脂肪细胞中发挥核心作用在维持脂质体内平衡和能量平衡34]。诱导3 t3-l1 preadipocytes可以分化为成熟脂肪细胞,广泛用于调查在脂肪细胞葡萄糖和脂质代谢在体外(35]。对抗代谢紊乱、科学研究重点是有效的功能性天然分子从草本植物,水果和蔬菜(31日]。在这些分子,对称二苯代乙烯,一群多酚在最近几年得到了极大的兴趣。在我们之前的研究中,我们表明,提取从对称二苯代乙烯胡芦巴有有益的糖尿病小鼠血糖过低的影响,和三个多酚对称二苯代乙烯(RHAc、dRHAc RHAg)被HSCCC[胡芦巴种子分开20.]。因此,在当前的研究中,我们进一步探讨这些多酚对称二苯代乙烯在脂肪生成的影响,在红外3 t3-l1脂肪细胞葡萄糖摄取。

本文提供的数据显示,这些对称二苯代乙烯可以抑制脂质积累在3 t3-l1分化抑制adipocyte-specific蛋白质浓度的10μmol / L。此外,葡萄糖摄取不同的改善治疗后三个化合物。当比较使用的化合物的影响,RHAc有最好的效果。RHAc显著刺激一种蛋白激酶的激活和AMPK在红外3 t3-l1脂肪细胞。然而,RHAg最低活动尽管其酚羟基结构包含3。

它已经表明,反激进主义的积极和过氧化氢清除活动由酚类化合物与羟基的位置和数量约束与芳环(36,37]。此外,构效关系分析表明,治疗效果的天然酚类化合物包括减少ROS和包括多酚对称二苯代乙烯(38]。这些对称二苯代乙烯的血糖过低的活动确认后,我们进一步研究了细胞和线粒体ROS生产红外3 t3-l1脂肪细胞(图5)。氧化应激与二型糖尿病的发展密切相关39)和活性氧可以抑制胰岛素反应,导致胰岛素抵抗的发展,二型糖尿病的一个重要病理特征(40]。我们的结果对于ROS测量支持这个结论。看来可能是一种蛋白激酶的激活和AMPK ROS的产生有关30.]。关于多酚对称二苯代乙烯、ROS生成RHAc-treated组明显减少。这是符合ROS清除这些化合物的结构与活性关系。此外,化合物与活性氧清除能力强也可以激活AMPK和其他相关途径(41]。最终,这将导致低效率的调制的葡萄糖和脂质代谢,是证明了RHAc在这项研究中。脂质积累和葡萄糖吸收相关红外脂肪细胞中线粒体的代谢能力减弱。几个自然活跃的产品,比如RHAc改善线粒体功能、增强胰岛素敏感性,促进碳水化合物和脂肪酸的代谢。

总之,我们的结果表明,多酚芪隔绝胡芦巴种子显示显著改善胰岛素敏感性和线粒体功能3 t3-l1脂肪细胞。RHAc拥有最好的效果在体外。此外,结果强烈表明,线粒体发挥重要作用在胰岛素抵抗和相关信号激活。在未来,我们将专注于线粒体生物起源和功能探索潜在的作用机制。

的利益冲突

作者报告没有利益冲突。

作者的贡献

李刚和Guangxiang菜肴的贡献同样这项工作。

确认

这项工作是由美国国家科学基金会支持的中国(31470426,31300292),“个性化Medicines-Molecular基于签名的药物发现和发展”,中国科学院的战略重点研究项目(批准号XDA12040320),山东省科学基金会(ZR2017MH024),烟台的Shuangbai项目,青海省科学基金会(2016 - zj - 929 q, 2015 - sf - 121),和中国科学院青年创新促进会。