棕榈酸酯刺激上皮细胞钠离子通道,提高细胞内钙、活性氧,磷酸肌醇3-Kinase活动

文摘

先前的研究表明,上皮细胞钠离子通道(钠)在糖尿病肾脏的调节。在这里,我们表明,在远端肾单位细胞钠单通道活动显著增加了棕榈酸酯,一个游离脂肪酸升高糖尿病。我们还表明,棕榈酸酯增加细胞内钙^{2 +}细胞内钙螯合后,^{2 +}BAPTA-AM,棕榈酸酯未能影响钠活动。治疗的细胞2-aminoethoxydiphenyl硼酸(2-APB IP的抑制剂₃细胞内钙受体)废除的高程^{2 +}和博活动。治疗的细胞apocynin (NADPH氧化酶抑制剂)、二硫苏糖醇/硫氢化钠(减少代理),或LY294002(磷酸肌醇3-kinase (PI3K)抑制剂)阻止palmitate-induced ENaC活动,而硫柳汞(氧化剂)模仿棕榈酸酯钠活动的影响。然而,这些治疗方法没有改变细胞内钙的水平^{2 +},表明海拔活性氧(ROS)和激活下游的PI3K的信号级联。因为我们已经表明,ROS刺激即通过激活PI3K,这些数据表明,棕榈酸酯第一提升细胞内Ca^{2 +},然后激活一个NADPH氧化酶提升细胞内ROS和PI3K活动,最后通过激活PI3K增加钠的活动。

1。介绍

上皮细胞钠离子通道(钠),主要表达在上皮细胞顶膜的内层的远端部分肾元,肺气道,肺泡,降结肠,内皮细胞(1在调停Na),起着重要的作用⁺进入这些细胞。Na⁺运输在肾元对Na至关重要⁺内稳态,从而起着至关重要的作用在维护盐平衡和系统性血压。其他更频繁地观察病理因素改变钠活动可能有更大的临床意义治疗高血压。高血压是一种常见的糖尿病并发症。以前的研究已经表明钠被激活在糖尿病肾病患者由于海拔ENaC-activating尿液中酶(2]。它也表明,高葡萄糖刺激即表达人类皮质集合管细胞(3]。这些研究表明,钠在糖尿病条件下不仅是病态释放酶激活的尿液也由高血糖直接或间接激活高血糖诱导代谢压力。在2型糖尿病控制不佳的患者血浆游离脂肪酸浓度(远期运费协议)升高(4]。远期运费协议被认为是导致高血压的发病机制5]。然而,它仍然未知的高架远期运费协议是否糖尿病引发高血压通过刺激即在远端肾单位细胞。

远期运费协议通常指nonesterified脂肪酸存在于血液。棕榈酸酯,远期运费协议的重要组成部分,可以引起Ca^{2 +}流出的内质网(ER) (6,7]。细胞内钙的再分配^{2 +},不知何故,刺激线粒体产生活性氧(ROS) (8,9]。多项证据表明,ROS不仅刺激磷酸肌醇3-kinase (PI3K)还灭活PTEN [10,11]。两者都可以提升phosphatidylinositol-3 4 5-trisphosphate (PIP)₃),这是一个有效的激活钠(11- - - - - -15]。这些研究进一步表明,远期运费协议,尤其是棕榈酸,可能会刺激即在远端肾单位参与糖尿病高血压的发病机制。尽管博可以专门被阿米洛利,阿米洛利可能不是一个有用的药物治疗高血压diabetes-induced因为最近的研究表明,阿米洛利引起急性肾损伤(16]。因此,调查即信号转导通路的激活在糖尿病临床意义重大。我们已经表明,还原剂,硫化氢,阻止钠活化ROS (11,17),这可能提供了一种替代方法来治疗ROS-induced高血压。在目前的研究中,我们表明,棕榈酸酯刺激细胞内钙钠升高^{2 +}ROS和PI3K活动,硫化氢的刺激是可以纠正的。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

A6细胞建立肾细胞系来自远端肾单位的部分非洲爪蟾蜍光滑的为研究钠和构成一个适当的细胞模型。A6细胞从美国购买类型文化集合(罗克维尔市,医学博士,美国),生长在三部分组成的介质DMEM / F-12(1: 1)介质(美国Gibco)和1 H₂O, NaHCO 15毫米₃(总钠⁺= 101毫米),2毫米谷酰胺,10%胎牛血清(美国表达载体),25个单位/毫升青霉素、链霉素和25个单位/毫升,如前所述。A6细胞培养用塑料水瓶的1μM醛固酮在26°C和4%的公司₂。融合后的细胞达到70%,他们是亚文化的聚酯膜Transwell插入(美国康宁合演有限公司)或共焦显微镜分析Snapwell插入(美国康宁合演有限公司)cell-attached膜片钳实验。让他们完全极化,细胞培养至少2到3周之前执行实验(10]。

2.2。膜片箝记录

即单通道电流记录使用cell-attached膜片箝配置与axopatch b - 200放大器(轴突仪器,美国)如前所述17]。A6细胞被彻底清洗解决方案包含(100毫米)氯化钠,氯化钾,3.4 1 CaCl₂1 MgCl₂,和10玫瑰,调整与氢氧化钠pH值7.4。这个氯化钠溶液用作浴录音和填充电极的解决方案。试剂添加到浴的解决方案。硼硅玻璃电极的提示抵抗7 - 10 MΩ当充满生理盐水溶液。实验在室温(22 - 25°C)。数据是通过应用0 mV吸管潜力,取样5 kHz和低通滤波1 kHz使用Clampex 10.2软件(分子器件、桑尼维尔,美国)。在分析之前,单通道进一步过滤30 Hz的痕迹。补丁功能的总数渠道是由观察当前幅度直方图峰值检测的数量在录音期间至少10分钟。开放概率(_O之前和之后)的值即计算化学应用程序使用Clampfit 10.2(分子器件、桑尼维尔,美国)。控制钠活动记录2分钟后cell-attached模式成立和钠稳定的活动。一个补丁是典型的记录实验操作之前至少30分钟。

2.3。共焦激光扫描显微镜分析

共焦显微镜(日本奥林巴斯Fluoview 1000)研究进行如前所述[11,17]。A6细胞被洗两次与上述相同的氯化钠溶液之前,任何的性能实验。实验操作后,聚酯膜支持迅速切除和安装在载玻片上一滴氯化钠溶液保持细胞存活。A6细胞种植在Transwell插入装有2.5μ5 - (6)-carboxy-2 ,7 - - - - - -二乙酸dichlorodihydrofluorescein (carboxy-H₂DCFDA) membrane-permeable ROS-sensitive荧光探针(美国表达载体),当氧化成为荧光。棕榈酸酯的应用之前,A6细胞与铁螯合剂治疗,50μ2米2, - - - - - -联吡啶,3分钟17]。标记细胞被洗两次修改之前DPBS共焦显微镜分析。ROS水平基于荧光强度的测定。确定细胞内钙^{2 +}水平,与5细胞被孵化μM Fluo-3,荧光Ca^{2 +}指标,60分钟(18]。共焦显微镜XY扫描的细胞5 - 15分钟内完成。在每组实验中,图像被使用相同的参数设置。

2.4。化学药品和试剂

除非另外注明,所有化学药品和试剂购自Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。所有的解决方案都是半成品,存储在一个−20°C冰箱在使用前或新鲜。棕榈酸是购自σ,BSA (FFA-free)从罗氏公司购买。棕榈酸溶解在0.1 M氢氧化钠在70°C,然后包裹着10% BSA 55°C 10分钟来实现最终的棕榈酸酯浓度的0.3毫米。股票的解决方案3毫米棕榈酸酯为10% BSA和10% BSA控制实验前1天就做好了准备。

2.5。数据分析

数据提出了均值±S.E.使用SigmaPlot和SigmaStat执行统计分析软件(Jandel科学、钙、美国)。学生的 - - - - - -测试是用来比较预处理和后处理活动。方差分析(方差分析)是用于执行多个各种治疗组之间的比较。被认为具有统计显著性差异 。

3所示。结果

3.1。棕榈酸酯钠增加活动,提升细胞内Ca^{2 +}

调查棕榈酸酯是否改变ENaC活动,我们执行cell-attached膜片钳实验。因为糖尿病患者血浆棕榈酸水平升高4棕榈酸),应用于模拟基底外侧浴在活的有机体内的等离子体棕榈酸酯的交付方式。单通道钠电流记录在每个实验至少30分钟。添加棕榈酸酯(0.3毫米)基底外侧浴显著增加钠_O从0.29±0.01(控制之前添加),0.59±0.04(后添加棕榈酸酯)( ; ;数据1(一)和1 (b))。因为棕榈酸酯溶解在溶液中含有2% BSA的控制,我们还应用2% BSA基底外侧浴;它不影响钠_O(0.27±0.01和0.28±0.01; ; ;数据1 (c)和1 (d))。最近的研究表明,细胞内钙海拔^{2 +}靠近基底外侧膜刺激钠(19]。因此,接下来,我们测试如果棕榈酸酯会增加细胞内钙^{2 +}在A6细胞。棕榈酸酯的应用(0.3毫米)显著增加细胞内Ca^{2 +}在大约20年代,随后逐渐下降,但增长仍明显高于治疗前的水平至少3分钟。相比之下,暴露的细胞2% BSA没有改变细胞内钙含量(图1 (e))。博活动逐渐增加剂量的棕榈酸酯升高,从0.28±0.03(控制)0.95±0.05 (1000μ米)(图2(一个))。计算均值_O钠是绘制函数的不同剂量的棕榈酸酯和装有剂量反应曲线分析(固体黑线),EC50 330.5±0.62μM为棕榈酸酯激活钠(图2 (b); 为每个数据点)。因此,300年μM棕榈酸酯(剂量接近EC50)被用于其他的实验。

3.2。棕榈酸酯刺激即通过Ca^{2 +}端依赖途径

检测细胞内钙的影响^{2 +}palmitate-induced ENaC活动,我们对待A6细胞BAPTA-AM (membrane-permeable Ca^{2 +}螯合剂)5分钟前添加棕榈酸酯。管基底不再添加棕榈酸酯钠活动增加BAPTA-AM的存在,尽管BAPTA-AM轻微但显著减少钠的活动。博_O为0.32±0.02(控制),0.25±0.03 (BAPTA-AM)和0.23±0.02(棕榈酸酯)( ; ;数据3(一个)和3 (b))。确定棕榈酸酯诱发Ca^{2 +}从内质网(ER)释放,我们与2-APB A6细胞治疗,IP3受体的抑制剂,5分钟前添加棕榈酸酯。数据表明,棕榈酸酯不再改变ENaC活动2-APB的存在。博_O为0.27±0.02(控制),0.30±0.02 (2-APB)和0.27±0.02(棕榈酸酯)( ; ;数据3 (c)和3 (d))。同样,棕榈酸酯也不再增加细胞内钙^{2 +}治疗后的细胞(数字3 (e)和3 (f))。进一步确定棕榈酸酯诱发Ca^{2 +}释放,我们检查了棕榈酸酯对细胞内钙的含量的影响^{2 +}在缺乏细胞外钙^{2 +}。结果表明,在缺乏细胞外钙^{2 +},棕榈酸酯还是细胞内钙升高^{2 +}(图3 (g)和3 (h))。这些结果表明,棕榈酸酯刺激即可能通过与Ca相关通路^{2 +}释放。

3.3。硫氢化钠逆转Palmitate-Induced氧化应激和ENaC激活

确定如果棕榈酸能诱导氧化应激,细胞内活性氧测定。数据表明,棕榈酸酯并提高细胞内ROS,海拔由硫氢化钠被废除,无论棕榈酸酯或硫氢化钠首次添加到基底外侧浴(数字4(一)- - - - - -4 (d))。同时,palmitate-induced ENaC活动也取消了硫氢化钠(数字4 (e)和4 (f))。如数据所示4 (e)和4 (f),我们多次发现增加0.3毫米棕榈酸酯基底外侧浴显著增加钠_O从0.35±0.02,0.78±0.02 ( ; )。在棕榈酸酯的存在,0.1毫米硫氢化钠应用于基底外侧浴逆转效果。博_O减少,从0.78±0.02,0.33±0.03 ( ; )。相反,在0.1毫米硫氢化钠,棕榈酸酯未能增加钠的活动。博_O保持不变,0.25±0.03(硫氢化钠)和0.23±0.03(硫氢化钠+棕榈酸酯)( ; )。然而,硫氢化钠仅略有降低钠P啊,0.31±0.02(控制)和0.25±0.03(硫氢化钠)( ; )。这些结果表明,H₂年代产生很强的保护作用对palmitate-induced ENaC活动A6细胞通过减少氧化应激引起的棕榈酸酯。细胞内钙的确定高程^{2 +}前发生氧化应激,我们进行预处理细胞BAPTA-AM然后应用棕榈酸酯的细胞。数据显示,BAPTA-AM废除palmitate-induced海拔细胞内ROS ( ; ;数据5(一个)- - - - - -5 (c))。这些结果表明,活性氧,下游信号分子的胞内Ca^{2 +}调解棕榈酸钠的刺激。

3.4。Apocynin变弱Palmitate-Induced ENaC活动但不影响细胞内Ca^{2 +}

确定棕榈酸酯刺激即通过激活一个NADPH氧化酶,我们用0.1毫米apocynin A6预处理细胞,NADPH氧化酶抑制剂,5分钟。如图6(一)棕榈酸预处理后,不再影响ENaC活动。博_O为0.36±0.04(控制),0.34±0.05 (apocynin)和0.33±0.03 (apocynin加上棕榈酸酯)( ; ;图6 (b))。然而,apocynin没有改变细胞内钙的高程^{2 +}由棕榈酸酯(数字6 (c)和6 (d))。这些数据表明,棕榈酸酯刺激即通过NADPH oxidase-mediated生产通过海拔细胞内ROS的Ca^{2 +}。

3.5。棕榈酸酯刺激即通过Redox-Dependent机制

来确定棕榈酸酯刺激即通过redox-dependent机制、德勤、还原剂、硫柳汞,氧化剂,用于预处理细胞之前添加棕榈酸酯。棕榈酸预处理后与德勤(1毫米),不再影响ENaC活动。添加硫氢化钠(0.1毫米)也没有影响ENaC活动。博_O为0.32±0.01(德勤),0.36±0.02(德勤+棕榈酸酯)和0.34±0.02(德勤+棕榈酸酯+硫氢化钠)( ; ;数据7(一)和7 (d))。治疗后与硫柳汞(100μ米),即活动增加,但添加棕榈酸酯没有引起任何添加剂的影响,和0.1毫米硫氢化钠没有反向硫柳汞的影响。博_O为0.58±0.03(硫柳汞;如上所示控制相比, ),0.60±0.05(硫柳汞和棕榈酸酯)和0.65±0.04(硫柳汞+棕榈酸酯+硫氢化钠)( ; ;数据7 (b)和7 (e))。然而,随着硫柳汞和棕榈酸酯的同等待遇,更高浓度的硫氢化钠(0.2毫米)的确能减少钠的活动。博_O为0.56±0.03(硫柳汞),0.51±0.02(硫柳汞+棕榈酸酯)和0.30±0.02(硫柳汞+棕榈酸酯+硫氢化钠)( ; ;数据7 (c)和7 (f))。这些结果表明,棕榈酸酯刺激即通过redox-dependent机制。

3.6。LY294002变弱Palmitate-Induced ENaC活动但不影响细胞内Ca^{2 +}

我们之前的数据表明,ROS刺激即通过增加顶端π(3、4、5)P₃通过激活PI3K的10,17]。确定PI3K介导棕榈酸酯钠活动的影响,A6细胞使用5μM LY294002 PI3K抑制剂,在增加0.3毫米棕榈酸酯基底外侧浴。如数据所示8(一个)和8 (b),即_O略减少从0.35±0.02,0.32±0.03 LY294002,棕榈酸而未能在细胞使用LY294002增加钠活动。博_O保持不变,0.32±0.03 (LY294002)和0.29±0.03 (LY294002 +棕榈酸酯; ; )。然而,LY294002并不影响细胞内钙palmitate-induced海拔^{2 +}( ; ;数据8 (c)和8 (d))。这些数据表明,基底的刺激效果棕榈酸酯钠依赖于Ca^{2 +}端依赖PI3K的激活。

4所示。讨论

在本研究里,我们获得的主要发现如下:(1)棕榈酸酯刺激细胞内钙钠升高^{2 +}ROS,(2)硫氢化钠逆转的影响棕榈酸酯钠活动通过减少palmitate-induced细胞内活性氧积累,(3)硫氢化钠palmitate-induced ENaC活动的抑制作用是通过其还原作用,和(4)棕榈酸酯刺激即通过增加PI3K的活动。

之前的研究表明,棕榈酸酯能够诱导β细胞凋亡(20.]。然而,我们的数据表明,棕榈酸酯没有引起任何类型的细胞死亡,即使细胞孵化与0.3毫米棕榈酸酯为24 h(数据未显示)。因此,棕榈酸酯的影响即有可能不是由于特异性的对细胞活力的影响。之前的研究表明,棕榈酸酯的Ca^{2 +}可以形成毛孔的Ca膜吗^{2 +}涌入(21]。可能需要高浓度棕榈酸酯通过Transwell膜,被纳入基底外侧膜A6的细胞,并最终形成Ca^{2 +}透水毛孔。然而,我们不赞成这种可能性,因为我们的数据表明,细胞内钙的增加^{2 +}可以通过2-APB被废除,抑制剂的IP₃膜受体位于ER。因此,我们认为,可能需要高浓度的棕榈酸酯通过A6细胞基底膜的最终目标ER膜引起Ca^{2 +}释放。之前的数据表明,海拔胞内Ca^{2 +}抑制钠通过激活蛋白激酶C (22]。然而,最近的数据表明细胞内钙海拔^{2 +}附近的顶端膜抑制钠通过purinergic信号通过P2Y2顶端膜上受体(23]。相比之下,细胞内钙的基底标高^{2 +}靠近基底外侧膜刺激细胞内钙钠通过线粒体隔离^{2 +},造成细胞内钙^{2 +}信号microdomains [19]。

在这里,我们表明,该Ca发布^{2 +}导致活性氧的NADPH oxidase-dependent高程。这并不奇怪,因为之前的研究已经表明,ER Ca之间有一个互动^{2 +}和线粒体ROS肺动脉平滑肌细胞(24]。因为Ca^{2 +}也刺激线粒体NADPH氧化酶4 (NOX-4) (25),我们曾表明,过量的线粒体活性氧显著增加(即活动19]。我们认为NOX-4也可能导致棕榈酸诱导的线粒体ROS升高。这将是有趣的研究主要是线粒体NOX-4介导palmitate-induced ENaC A6细胞活动。我们之前的研究已经表明,过氧化氢,ROS,不会改变切除由内向外补丁(即活动10]。因此,它不太可能palmitate-induced海拔细胞内ROS刺激即通过直接氧化钠。在这里,我们表明,抑制PI3K可以废除棕榈酸钠的激活,因为众所周知,皮普₃PI3K的产物,强烈激活钠(11- - - - - -15]。我们赞成的观点棕榈酸酯刺激即通过相关途径^{2 +}启动细胞内ROS高程和下游激活PI3K因为LY294002不影响细胞内钙palmitate-induced海拔^{2 +}。虽然没有直接证据显示Ca^{2 +}刺激PI3K,我们的数据表明,棕榈酸介导的细胞内Ca^{2 +}随后引起ROS升高。其他的数据显示,ROS增加PI3K活动的水平(26]。以前的研究显示β和γ博子单元是由半胱氨酸修改通过脂肪酸交换化学实验和棕榈酰化β亚基棕榈酰化与增加频道活动(27]。我们的数据进一步证明除了直接调制通道闸门,棕榈酸酯也可以增加钠活动通过调节细胞内信号传导过程。

总的来说,我们提出的底层机制PA移植即可能通过一个连续的通路与细胞内钙海拔有关^{2 +}ROS通过NADPH氧化酶,并通过PI3K PIP3提升血压(图9)。这项研究的重要发现是硫氢化钠可以废除棕榈酸钠的激活,一个主要的FFA高架在糖尿病(4]。然而,硫氢化钠是否可以用于治疗diabetes-induced高血压仍有待研究。

5。结论

棕榈酸酯刺激即通过Ca A6细胞活动^{2 +}端依赖NADPH氧化酶的活化,活性氧的生产,和PI3K的激活。的palmitate-induced刺激可以抵消钠硫氢化钠。

缩写

2-APB:	2-Aminoethoxydiphenyl硼酸
钠:	上皮细胞钠离子通道
远期运费协议:	游离脂肪酸
PA:	棕榈酸酯
PI3K:	磷酸肌醇3-kinase
皮普3:	Phosphatidylinositol-3 4 5-trisphosphate
O:	开放的可能性
ROS:	活性氧物种。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者没有利益冲突的声明。

作者的贡献

王综合组和陈梁同样这项工作。

确认

本研究重点项目支持的中国国家基础研究与发展计划(973计划2014 cb542401 Z-RZ),中国国家自然科学基金(91639202和91639202 Z-RZ和91639202 Q-SW),国立卫生研究院的资助(100582年R01 DK H-PM)和黑龙江省自然科学基金(QC2016128 Q-SW)。

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