文摘

多糖分离的影响石斛兰officinale(计划)对乙酰氨基酚(APAP即)诱导肝毒性和底层机制。男性癌症研究所(ICR)小鼠被随机分配到六组:(1)控制,(2)车辆(APAP即230毫克/公斤),(3)N乙酰半胱氨酸(100毫克/公斤),(4)50毫克/公斤夹住,(5)100毫克/公斤夹住,(6)200毫克/公斤夹住。丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)水平在血清中谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)、总抗氧化能力(T-AOC)、髓过氧化物酶(MPO)和活性氧(ROS)水平在肝脏测定死后的老鼠。肝脏的组织学检查也执行。计划的影响在Kelch-like ECH-associated蛋白1 - (Keap1)核转录因子红细胞两个相关因子2 (Nrf2)信号通路是评估使用免疫印迹分析和实时聚合酶链反应(PCR)。结果表明,夹住治疗显著减轻肝脏损伤。减少血清ALT和AST水平和ROS、MDA,和MPO含量在肝脏,以及增加谷胱甘肽,猫,和T-AOC肝脏,夹住后观察治疗。夹住治疗显著诱导离解的Nrf2 Nrf2−Keap1复杂和促进了Nrf2核易位。随后,DOP-mediated Nrf2激活触发的转录和表达glutamate-cysteine连接酶催化亚基(GCLC), glutamate-cysteine连接酶调节亚基(GCLM)、血红素oxygenase-1 (HO-1)和NAD (P) H脱氢酶醌1 (NQO1) APAP-treated老鼠。目前的研究显示,夹住治疗产生潜在王亚南影响对APAP-induced肝损伤。进一步调查关于机制表明,计划对王亚南通过抑制氧化应激和激活Nrf2−Keap1信号通路。

1。介绍

药物引起的肝损伤(帝力)已经成为最常见的原因导致停止测试药物在临床试验中,对药物使用的限制,和撤回批准药物(1]。帝力的整体发生在0.00001%和0.01%之间(白细胞数量2,3]。帝力大致可以分为可预测和摄入量有关,如对乙酰氨基酚(扑热息痛,APAP即),和不可预知的或特殊帝力(IDILI)。IDILI是一个重大的健康问题由于其不可预测性,死亡率、潜在原因和知之甚少发病机理4,5]。APAP即过量急性肝衰竭占50%的情况下在一个可预测的,本质上存在剂量依赖的相关性,肝毒素的方式(6,7]。此外,将近一半的肝移植病例由于帝力美国归因于APAP即单独或结合其他药物(8]。APAP即是一种非处方药物广泛用于解热和镇痛(9]。APAP即在治疗剂量是安全的,但是很容易被过度使用由于个体差异。此外,APAP即过量引起的肝损伤发生后24 - 48小时内快速摄入(10]。目前,临床治疗APAP-induced肝毒性是非常有限的。N乙酰半胱氨酸(NAC)是最有效的一线的良药11),但其效力仅限于APAP-induced毒性的早期阶段(12]。因此,更有效和安全的药物来减轻肝损伤引起APAP即迫切需要发展。

最近,草药产品已经引起了极大的关注作为替代医学的重要组成部分13,14]。人口多选择自然派生的药物来维持健康和治疗疾病(15]。公司也正在试图发现新的药物的植物起源和执行结构的修改。草药药物促进肝细胞的再生,加速愈合过程在肝脏疾病(16]。

石斛兰officinale木村等货物移动,称为“Tie-Pi-Shi-Hu”在中国,是一个原始的食品材料和药用植物。中药在中国,d . officinale通常被用来强化胃功能和产生体液(17]。现代药理研究表明,d . officinale显示免疫调节、治疗糖尿病药、抗炎、抗癌、王亚南,抗氧化活动(18,19]。化学成分研究表明,d . officinale主要是由多糖、生物碱、氨基酸、微量元素(18,19]。在这些化学成分中,多糖分离d . officinale有一个积极的作用在人类食物和健康饮食20.]。特别是,多糖提取d . huoshanense,另一种石斛兰王亚南显示活动对乙醇-和碳tetrachloride-induced肝损伤(21,22]。然而,效果和多糖分离的作用机理d . officinale(计划)对APAP-induced肝损伤仍然未知。

本研究旨在调查王亚南老鼠夹住反对APAP-induced肝损伤的影响。具体来说,水平的丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)血清中测量评估肝损伤。谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)和髓过氧化酶(MPO)水平在肝脏决心证明氧化损伤。过氧化氢酶(CAT)和总抗氧化能力(T-AOC)也进行测试的抗氧化能力。同时,Nrf2-Keap1信号通路的潜在机制研究使用免疫印迹分析和实时聚合酶链反应(PCR)。

2。材料和方法

2.1。化学药品和试剂

d . officinale请提供了广东林业科学院(广州)。APAP即是购自上海Macklin生化有限公司有限公司(上海,中国)。南京汽车获得了从广州Feibo生物科技有限公司有限公司(广州)。生化分析工具的ALT (C009-2)、AST (C0010-2)、谷胱甘肽(A006-1), MDA (A003-1), MPO (A004),猫(A007-1)和T-AOC (A015)购自南京建成生物工程研究所(中国南京)。小鼠组织活性氧酶联免疫吸附试验(ELISA)工具包(e - 20634)从北京买了程林生物科技有限公司有限公司(中国,北京)。Nrf2 (sc - 365949)和Keap1 (sc - 365626)抗体是来自圣克鲁斯生物技术有限公司(美国CA)。组蛋白H3 (E021130-03),β肌动蛋白(E021020-03)和二级抗体(E030110-01)是由EarthOx, LLC(美国CA)。引物的glutamate-cysteine连接酶催化亚基(GCLC) glutamate-cysteine连接酶调节亚基(GCLM)、血红素oxygenase-1 (HO-1), NAD (P) H脱氢酶醌1 (NQO1)和glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH)是由上海Sangon生物技术有限公司(上海,中国)。美国试剂盒试剂购买从英杰公司(CA)。ChamQ SYBR qPCR大师提供的混合是Vazyme生物技术有限公司有限公司(中国南京)。除非另有明确规定,其他化学药品和试剂被用于分析等级满足研究的需要。

2.2。准备的计划d . officinale

多糖分离d . officinale(计划)的准备(如前所述)(23,24]。首先,d . officinale(100克)被和提取三次蒸馏水(1:20 wt / wt) 2 h。结合提取过滤去除杂质。然后,上层清液集中,除蛋白通过添加Sevag试剂。获得的液体的酒精浓度调整为80%使用食用酒精。之后,一夜之间液体沉淀在4°C。在3000 rpm离心法收集的沉淀是10分钟在4°C和重新溶解适量的蒸馏水。最后,溶解液冻干使用真空冷冻干燥机(FreeZone Labconco,密苏里州,美国)获取夹住干粉。多糖的产量计划计算如下:

可溶性碳水化合物的总量在夹住的蒽酮−硫酸法(25]。首先,2毫升的计划解决方案(0.04毫克/毫升)和6毫升的硫酸蒽酮(1毫克/毫升)在90°C和加热15分钟紧随其后的是冷却到室温。反应液的吸光度测量使用Multiskan频谱(热、芬兰)625海里。不同浓度的葡萄糖(2、4、6、8、10和12毫克/ 100毫升)准备根据上述方法绘制标准曲线。

2.3。测定的分子量和高效凝胶渗透色谱法夹住

分子量(多工作站系统)计划进行评估的高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)根据文献[26]。HPGPC系统配备了1525高效液相色谱仪器(美国水域,MA), 2414年示差折光检测器(水域),和717 +自动取样器(水),这是表现啧啧g - 5000PWXL(7.8×300毫米2,Tosoh有限公司、日本)和啧啧g - 3000PWXL(7.8×300毫米2Tosoh有限公司)列系列。然后,5毫克的样品溶解在2毫升的0.02米磷酸二氢钾缓冲溶液和过滤0.45μm得到上层的过滤器。此外,10μL上层清液的注入HPGPC设备进行分析。0.02 KH的分析2阿宝40.6毫升/分钟的流量下的列和探测器的温度35°C。已知的八个葡聚糖标准多工作站系统被用来计算兆瓦(D5200, 11600, 23800, 48600, 148000, 273000, 410000,和668000年)。

2.4。动物和治疗

雄性ICR小鼠(6−8周大)从广东购买医学实验动物中心(佛山,中国)和维护以50±10%的湿度23±2°C为12 h光/暗周期。他们有免费的食物和水。所有程序都是按照规定执行的实验动物管理科技部颁发的中华人民共和国。所有动物实验机构批准的动物保健和使用委员会广州中医药大学。

所有的老鼠被随机分配到以下六组( /组):(1)控制,(2)车辆(APAP即230毫克/公斤),(3)NAC(230毫克/公斤APAP即+ 100毫克/公斤NAC),(4)低剂量的计划(230毫克/公斤APAP即+ 50毫克/公斤夹住),(5)中等剂量的计划(230毫克/公斤APAP即+ 100毫克/公斤夹住),和计划(6)高剂量(230毫克/公斤APAP即+ 200毫克/公斤夹住)。从控制和车辆组小鼠口服给予蒸馏水。其他四组接受相应剂量的南汽和夹住口头30天。所有小鼠腹腔注射APAP即4 h后治疗30天,而对照组注射同样体积的生理盐水。老鼠的血液收集从后轨道后静脉丛12 h APAP即挑战。然后,老鼠牺牲和肝脏组织收集后用生理盐水洗涤三次。血液和肝脏组织用于生物和组织学评价研究。

2.5。组织学分析

肝脏组织在4%多聚甲醛固定,嵌入在石蜡,切割5点μm厚度,苏木精和伊红染色(圆))与少量修改标准协议后(27]。肝组织病理学变化与光学显微镜捕获200×放大(E100,尼康公司,日本东京)。

2.6。测定血清中ALT和AST水平

血液样本保存在室温下2 h,然后在3000转离心10分钟在4°C获得血清。血清ALT和AST水平量化使用商业试剂盒(南京建成生物工程研究所,南京,中国)。

2.7。谷胱甘肽,测定MDA,猫,T-AOC, ROS水平和肝脏组织MPO活性

肝脏组织解冻和均质9折(g / mL)的冰冷的生理盐水。匀浆离心机在2500转10分钟4°C得到上层清液。谷胱甘肽、MDA、猫、T-AOC和ROS水平和MPO的活动浮在表面的测量使用商业试剂盒(南京建成生物工程研究所、南京)和酶联免疫试剂盒28根据制造商的协议)。

2.8。免疫印迹分析

短暂,肝组织均质使用radioimmunoprecipitation化验(里帕)缓冲区(R0020) (Solarbio,北京)包含phenylmethanesulfonyl氟化物(PMSF) (Beyotime、上海、中国)。胞质及核蛋白质提取使用注册机核装备和胞质蛋白提取工具包(凯基生物生物技术、江苏、中国)根据制造商的协议,分别。蛋白质含量是量化使用Bicinchoninic酸工具包(BestBio、上海、中国)。等量的蛋白质样品分离使用钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳,然后转移到一个聚乙二烯二氟化物膜。被屏蔽后Tris-buffered脱脂奶粉5%生理盐水和渐变20 (TBST) 1 h在室温条件下,膜是在4°C以下主要抗体孵育过夜:Keap1(1: 200稀释),Nrf2(1: 200稀释),组蛋白H3(1: 1000稀释),β肌动蛋白(1:1000稀释)三洗TBST紧随其后。然后,屁股被孵化与辣根过氧化物酶(合)共轭二次抗体(1:2000稀释)在室温下2 h三洗使用TBST紧随其后。最后,膜是西方增强化学发光试剂盒使用清晰的可视化(美国CA Bio-Rad实验室Inc .)和一个自动化学发光图像分析系统(Tanon科技有限公司,上海,中国。

2.9。定量实时聚合酶链反应分析

肝组织的总RNA提取使用试剂盒试剂(美国表达载体,生活技术,CA)根据制造商的协议。核糖核酸的纯度测定使用热科学NanoDrop 2000(马、美国)。接下来,使用逆转录酶RNA是反向转录cDNA工具包(豆类生物技术,日本京都)。实时定量PCR(存在)分析使用ChamQ SYBR qPCR大师混合(Vazyme生物技术有限公司,南京,中国)与大型管理软件CFX (Bio-Rad实验室Inc .)。在每个样本规范化表达GAPDH进行了分析。在这项研究中使用的引物是列在表中1。2相对表达进行了分析−ΔΔCt方法。

表1
引物用于这项研究。
2.10。统计分析

所有的实验数据都表示为 平均误差(SEM)。单向方差分析其次是最小的多重比较显著差异测试是用于所有数据分析。分析使用统计产品与服务解决方案软件20.0(美国纽约SPSS Inc .)。一个 或< 0.01被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。碳水化合物含量测定夹住

从干多糖(5.15 g)d . officinale(100克)。夹住的收益率为21.07%。碳水化合物含量测定的基础上,建立了线性曲线的葡萄糖 ]。计划的总碳水化合物的含量是29.52±0.99%。

3.2。确定使用HPGPC兆瓦的计划

计划是基于兆瓦的葡聚糖标准的校准曲线( ]。8551兆瓦的计划被发现。

3.3。夹住APAP-Induced肝损伤减轻

提前计划调查给出的老鼠口服夹住在APAP-induced肝毒性的影响。H&E-stained肝脏的病理特征部分如图1。明确肝小叶和核和炎症浸润在对照组观察。然而,大量的肝细胞组织坏死,焦肝内出血,炎症也指出,中央静脉周围病变APAP-treated老鼠。有意义,夹住治疗显著改善APAP-induced肝毒性。


图1
结果小鼠肝组织病理学检查的部分(圆)染色,放大200倍)。比例尺显示50μm。
3.4。夹住缓解APAP-Induced肝酶功能障碍

如图2、ALT和AST水平显著增加在APAP即挑战后的汽车集团( )与对照组相比。然而,夹住(100和200毫克/公斤)治疗显著逆转这些变化( , )。这些数据表明,夹住缓解APAP-induced肝酶功能障碍。

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(b)
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图2
多糖分离的效果石斛兰officinale(计划)的血清丙氨酸转氨酶(ALT) (a)和天冬氨酸转氨酶(AST) (b)在老鼠身上。数据了 ( )。 与对照组。 和 而汽车集团。
3.5。夹住APAP-Induced抑制氧化应激

先前的研究表明,氧化应激与肝损伤密切相关。如图3(一个)汽车组,谷胱甘肽水平明显低于对照组( )。旁边,NAC治疗显著增加谷胱甘肽水平的价格相比汽车集团( )。夹住治疗也显著增加肝脏中谷胱甘肽水平的价格相比汽车控制( )。谷胱甘肽水平在中等和高剂量的夹住组高得多的比南京汽车集团。

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图3
多糖分离的效果石斛兰officinale(计划)谷胱甘肽(a),丙二醛(b),和活性氧(c)水平和髓过氧化物酶活性(d),数据了 ( )。 与对照组。 而汽车集团。

如数据所示3 (b)- - - - - -3(d), APAP即刺激MDA的含量明显增加,活性氧和肝脏中MPO活性与对照组相比, )。与车辆组相比,南汽集团显著降低MDA的含量和活性氧和MPO活动(, )。治疗计划也减少MDA的作品和ROS和MPO的活性(, )。这些结果表明,夹住强烈抑制APAP-induced肝脏氧化应激。

3.6。计划增加对APAP-Induced氧化应激的抗氧化能力

如数据所示4(一)和4 (b)汽车组中,猫和T-AOC水平(APAP即)明显低于对照组(, ),而南汽调节猫和T-AOC(的水平, )。有趣的是,三个剂量的夹住猫级别(增加, ),夹住(100和200毫克/公斤)增加了T-AOC级别( 与车辆组相比)。然而,夹住(50毫克/公斤)对肝脏T-AOC水平没有影响。数据还表明,计划对APAP-induced氧化应激有强大的抗氧化能力。

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(b)
图4
多糖分离的效果石斛兰officinale(计划)过氧化氢酶总抗氧化能力(a)和(b),数据了 ( )。 与对照组。 而汽车集团。
3.7。夹住Nrf2核易位的影响

Nrf2核易位和细胞质Keap1测定用免疫印迹分析估计计划是否影响Nrf2−Keap1信号通路。如数据所示5(一个)和5 (b),APAP即刺激引起减少核Nrf2水平与对照组相比,小鼠(75.1%, )。然而,计划大大促进了Nrf2核易位与APAP即组。的变化水平Nrf2夹住治疗如下:50毫克/公斤,增长了0.27倍( );100毫克/公斤,增长了0.06倍( );和200毫克/公斤,增长了0.16倍( )。此外,独自APAP即也造成细胞质Keap1的增加(112%, )。然而,细胞质Keap1的表达水平显著降低了200毫克/公斤夹住治疗相比APAP即集团( )。这些结果表明,夹住Nrf2增强核易位。

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图5
(a - c)免疫印迹分析是用来测量核Nrf2和细胞质Keap1蛋白表达。特定的乐队量化和标准化的组蛋白H3和强度β肌动蛋白分别(罪犯)。数据了 ( )。 和 与对照组。 和 而汽车集团。
3.8。计划对肝脏Nrf2目标基因的表达

四个指标,包括GCLC GCLM、HO-1 NQO1、在肝脏样本测量使用中存在调查计划Nrf2目标基因的影响。如图6,APAP即刺激导致GCLC mRNA表达水平的降低,GCLM HO-1, NQO1。然而,夹住治疗显著调节GCLC的信使rna表达水平,GCLM, HO-1, NQO1相比APAP即组。在三个剂量的夹住,200毫克/公斤计划显示最强的信使rna表达水平的提升GCLC (1152%)、GCLM (747%)、NQO1(1180%),和HO-1 (229%), )。

(一)
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图6
多糖分离的影响石斛兰officinale(计划)的mRNA表达水平GCLC (a), GCLM (b), NQO1 (c)和HO-1 (d)。从肝脏组织中提取总RNA,反转录成互补脱氧核糖核酸定量实时PCR分析之前探测mRNA表达GCLC GCLM, NQO1、HO-1。数据了 ( )。 与对照组。 而汽车集团。

4所示。讨论

本研究调查计划反对APAP即overdose-induced肝毒性的保护作用。结果表明,夹住施加的王亚南减轻氧化应激通过Nrf2-Keap1信号通路。

首先,APAP即是优化的剂量。研究发现,230毫克/公斤APAP即能引起显著和稳定的肝毒性的初步实验。因此,230毫克/公斤APAP即被用来诱导肝损伤在以下研究。ALT和AST,两个肝功能指标,反映肝损伤的程度(29日]。显然,APAP即政府的ALT和AST水平明显增加(如图2),而夹住治疗显著地抑制血清中ALT和AST的活动。此外,肝脏组织病理学分析组织还透露,夹住治疗降低焦肝内肝细胞组织坏死和出血,除了安排肝小叶排列整齐。上述结果表明,夹住施加对APAP-induced肝损伤保护作用。

越来越多的证据证明了一个重要的角色的氧化应激引起的肝损伤APAP即[30.- - - - - -32]。主要使用细胞色素P450酶,APAP-induced肝毒性是归因于的形成N乙酰-p苯醌亚胺(NAPQI),导致肝脏谷胱甘肽(GSH)的有毒代谢物枯竭和氧化应激(33,34]。之后,残余NAPQI结合线粒体蛋白质和导致线粒体功能障碍和ROS生产过剩,最后导致DNA碎片和肝损伤(35]。此外,脂质过氧化(法律流程外包)一直在频繁调用机制ROS-induced细胞死亡和肝损伤36]。重要的是,大规模的法律流程外包引起大规模的肝损伤和急性肝衰竭APAP即过量(后4小时内37]。此外,谷胱甘肽,ROS、MDA猫,T-AOC水平视为肝功能的指标27,38]。脂质过氧化反应评估是评估肝组织MDA的(39]。

在目前的研究中,APAP即挑战明显减少谷胱甘肽的水平,猫,和T-AOC老鼠与控制。同时,活性氧的产生和MDA与APAP即显著增加小鼠治疗。然而,夹住治疗显著调节的谷胱甘肽,猫,和T-AOC水平和下调ROS、MDA的产生表明计划缓解肝APAP即引起的氧化应激。MPO活性是氧化应激和炎症的另一个标志40]。MPO的活性在老鼠APAP即侮辱后显著增加,导致严重的肝脏炎症。然而,夹住治疗显著地抑制MPO的活性。结合这些结果,得出的结论是,夹住治疗减毒APAP-induced肝脏氧化应激。

接下来,本研究调查计划的基本机制与APAP-induced肝损伤。Nrf2,抗氧化防御系统的主要监管机构,调节抗氧化反应的元素(是)41]。相反,Keap1的Nrf2是负的调节器结合Cullin 3-based E3泛素连接酶和结果的退化Nrf2 [42]。当激活时,Nrf2把从细胞质到细胞核和调节细胞内解毒和抗氧化基因的表达,如GCLC GCLM, HO-1, NQO1 [43,44]。Glutamate-cysteine连接酶,由GCLC GCLM子单元,据报道,促进谷胱甘肽的合成45]。随后NQO1可以减少NAPQI生产和减轻线粒体功能障碍引起的APAP即[46]。HO-1了促进血红素加速胆绿素形成的乳沟,减少细胞内ROS生产(47]。此外,Nrf2-ARE信号通路被证明参与APAP即[引起的肝毒性48]。先前的研究显示,增加蛋白质和信使rna表达水平的有效的药物治疗后Nrf2 APAP即[41,49,50]。重要的是,目前的研究发现,夹住治疗可能增加Nrf2的信使rna表达水平上调GCLC的表达,GCLM, NQO1、HO-1相比APAP即组。此外,夹住治疗可以促进Nrf2核易位和减少Keap1的表达,表明计划可能产生一种保护作用对APAP-induced通过激活Nrf2-Keap1通路肝毒性。

5。结论

这部小说研究表明,夹住治疗产生潜在王亚南影响对APAP-induced肝损伤。底层机制的进一步研究表明,夹住施加王亚南效应通过抑制氧化应激和激活Nrf2-Keap1信号通路。集体,计划可能会发展成为一个潜在的王亚南药物,饮食疗法,或功能食品对APAP即overdose-induced肝损伤。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

罗Guosheng林和丹丹的贡献同样这项工作。

确认

这项工作是支持由广东省林业科技创新具体项目(2016 kjcx006和2017 kjcx007号),国家重点研发项目中国没有。2017 yfc0506200),广东省科技发展专项项目(没有。2017 a050506044),广东省教育部功能创新项目(没有。2016 ktscx018)、广州(没有的科技项目。201704030028),广东省科技计划项目教育办公室(没有。2014 gkxm032),广东省科技计划项目(没有。2013 a022100001)。