文摘
心肌细胞外基质(ECM)是正常心脏功能和结构完整性的必要条件;因此,ECM内稳态的破坏与一些病理过程有关。女性Wistar鼠接受卵巢切除术手术(OVX)或虚假的操作(这样),然后被分成八组基于类型的饮食(标准食物或饮食高甘油三酯/ HT)和运动(有或没有运行)。12周后,心脏MMP-2活动,组织抑制剂metalloproteinase-2,胶原蛋白类型的内容,我的水平硝基酪氨酸(3 nt)、谷胱甘肽(GSH)和梗塞大小的比例确定。我们的结果表明,OVX和HT饮食过度引起胶原蛋白的积累;然而,这种增加训练动物没有被观察到。十二周的锻炼提升海拔3 nt的含量、谷胱甘肽和同样增加MMP-2所以和OVX动物的活动。OVX造成的高梗塞面积比和HT饮食减轻了体育锻炼。我们的研究结果表明,卵巢雌激素损失和HT饮食造成胶原蛋白积累和梗塞大小的比例增加。然而,运动心脏重塑作为补偿机制,加强MMP-2活动和减少纤维化,从而减少缺血/再灌注损伤。
1。介绍
绝经前妇女患心血管疾病的风险更低(CVD)比同龄男性;然而,这种性别优势逐渐消失后更年期的女性,这表明性激素代谢疾病有很强的影响参数(1]。一些生理变化中发展更年期也可能影响心血管疾病的发病率和表现,如体重、肥胖及其并发症(2]。在心血管疾病的发病机理,研究表明,雌激素缺乏和肥胖导致结构和组织重构,以及心脏功能的变化(3- - - - - -5]。
心肌细胞外基质(ECM)作为心脏发展的一个重要的中介因素,体内平衡,重塑6]。最丰富的结构组件ECM的胶原蛋白,特别是胶原蛋白I型和III型胶原,这主要由成纤维细胞产生(7),其合成和降解对心脏结构和功能正常(至关重要8]。在病理条件下,心脏衰竭和重构的特点是胶原蛋白积累,肌细胞的损失,受损的心脏结构的重排9- - - - - -11),证明破坏ECM /胶原蛋白体内平衡发展的一个关键因素是心脏功能障碍。纤维胶原蛋白和其他ECM的降解蛋白质是由基质金属蛋白酶催化(基质金属蛋白酶),这是一个家庭的zinc-dependent蛋白酶有超过25个成员国。MMP-2是其中一个最常见的已知在上述既定的丰富的蛋白质和酶几乎所有的细胞类型和特点是变性胶原的降解效果(明胶)和其他细胞外基质蛋白(12]。类似于其他酶、基质金属蛋白酶是由天然抑制剂称为组织金属蛋白酶抑制剂(TIMPs),防止过度ECM降解基质金属蛋白酶(13]。功能之间的平衡基质金属蛋白酶和TIMPs决定心脏重构(14]。
体育锻炼是广泛和一致作为一种非药物治疗心血管疾病的预防和治疗的工具。后者可以发起心血管适应性,包括降低血压,并促进心脏重塑生理肥大的发展和减少心脏纤维化(15,16]。此外,exercise-mediated心脏保护与抗氧化防御机制的激活和减少代谢危险因素(17]。在早期的研究中,我们证实,12周自愿运动结合卡路里限制(CR)可以减弱代谢参数,经常与主要的心血管风险处于estrogen-deficient状态(18]。
我们假设12周自愿的运动可能会导致修改心脏重构效果的一种有效策略处于estrogen-deficient状态。因此,当前研究的目的是调查潜在的保护作用与放松管制和不利影响MMP-2和胶原蛋白含量,与后坏死率的检测缺血/再灌注损伤。
2。材料和方法
2.1。动物
女性Wistar鼠体重180 - 200克获得Toxi-Coop Zrt。,Hungary, and acclimated for at least 1 week prior to experimental use and were maintained under controlled conditions of illumination (12/12 h light/dark cycle) and room temperature (20–23°C). All experimental procedures were performed in accordance with the standards of the European Community guidelines on the care and use of laboratory animals and had been approved by the Institutional Ethics Committee.
2.2。手术
一周后适应期间,10周的年龄的女性Wistar鼠受到卵巢切除术手术(OVX)或虚假的操作(所以)与硫喷妥钠麻醉(5毫克/ 100克i.p。)。OVX期间,两国背外侧切口和卵巢被移除。相反,所以动物的卵巢是形象化的创建类似的压力,但还没有废去。四周后休息时间,来验证OVX-induced更年期,血清雌激素水平(Quantikine鼠雌激素酶联免疫试剂盒,研发系统Inc .)检查使用雌激素定量酶联免疫吸附试验(ELISA) [19]。
2.3。实验设计的饮食时间和运动训练
OVX所以雌性老鼠被随机分成8新子组基于类型的饮食(标准粮(CTRL)和高甘油三酯饮食(HT))和运动(有或没有运行)12周。CTRL子群的老鼠被喂食实验室的食物,而动物HT组受到饮食由40%脂肪含量和60%标准的食物。后者饮食动物组进一步随机分为运行和久坐不动的子组。正在运行的动物分别被放置到笼子里配备了一个转轮,24小时的免费获取车轮每天12周。行使协议定义为自愿wheel-running模型被选为了分离运动的影响从与强制行使协议相关的额外的压力20.]。动物从久坐不动的子组同期被放置在标准的笼子里。实验周期的结束,所以老鼠的发情阶段检查染色染色,以确保所有所以动物丧生在同一阶段的阶段(发情前期阶段)。所有老鼠都牺牲了,和心脏组织收集和系统装在一个Langendorff灌注检测缺血/再灌注损伤体外(每组10大鼠)或夹紧,在液态氮冷冻后切除,然后储存在−80°C,供以后使用生化分析每组的老鼠(10)。该研究的实验设计如图1。
2.4。测量MMP-2活动
MMP-2活动测量从心脏使用明胶zymography样本。50毫克的蛋白质样本在8%聚丙烯酰胺凝胶共聚凝胶电泳(20毫克/毫升;输入一个从猪的皮肤;σ)。经过电泳,凝胶是用2.5% Triton x - 100和孵化20小时37°C的孵化缓冲区。考马斯亮蓝染色进行使用0.05%其次是4%甲醇和8%醋酸溶液使脱色。蛋白质梯(光谱多色广泛蛋白质阶梯,热科学)是用于识别2酶亚型(MMP-2 72 kDa, 64 kDa)。吻合是数字扫描和乐队的强度量化使用数量一个软件(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。
2.5。总谷胱甘肽(GSSG谷胱甘肽+)的测量
心脏样本均相溶液组成的0.25蔗糖,三20毫米,1毫米二硫苏糖醇(德勤)和离心机在15000 g×30分钟在4°C。收集上层的分数,然后0.1 CaCl20.25米,蔗糖,20毫米三,1毫米德勤是补充道。在0°C孵化后30分钟和进一步离心21450 g×60分钟在4°C,一个清晰的胞质部分用于酶化验。磷酸溶液125毫米Na和6.0毫米EDTA作为原液稀释缓冲的谷胱甘肽(GSH),谷胱甘肽还原酶,5、5′dithio-bis-2-nitrobenzoic酸(DTNB)β烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(βnadph)。40的总量μl的空白,标准,或心脏样本、平等(20卷DTNB股票的解决方案μl)和βnadph (140μl)被添加到每个好然后孵化25°C 5分钟。一个10μl的谷胱甘肽还原酶被用来启动反应,和吸光度测量在405 nm标后10分钟的起始反应。
分光光度测定的总谷胱甘肽,谷胱甘肽被DTNB顺序氧化,降低NADPH在谷胱甘肽还原酶的存在。总谷胱甘肽值表示为nmol /毫克的蛋白质。
2.6。测定心脏3 nt、胶原蛋白I型和TIMP-2
在12周的治疗期结束后,心脏样本夹和冷冻后切除。样本均质(Ultra-Turrax T8;2×30年代)磷酸盐缓冲剂(pH值7.4)然后在2000 r.p.m.离心20分钟在4°C。心脏3 nt,胶原蛋白I型的内容,和TIMP-2化验与商业工具从GenAsia购买,上海。光密度测量在450 nm(基准标;Bio-Rad)。蛋白质含量是决定使用一个商业蛋白质分析工具包(Bio-Rad实验室),和整除(20μl)的稀释样品(15×25×蒸馏水)与980年涨跌互现μ蒸馏水和200 lμl布拉德福德试剂。10分钟后混合和孵化后,样本化验spectrophotometrically 595海里。指蛋白质的价值观,心脏3 nt水平定义为pmol /毫克蛋白,胶原蛋白类型我被定义为pg /毫克的蛋白质,和TIMP-2水平表示为ng /毫克的蛋白质。
2.7。缺血/再灌注协议
麻醉后,心脏组织被迅速切除和放置在冰冷的Krebs-Henseleit缓冲溶液组成的11.2毫米葡萄糖,1.24毫米KH2阿宝4,20.1毫米NaHCO3氯化钾,氯化钠119毫米,4.7毫米,1.25毫米CaCl2,1.24毫米MgSO4然后安装到一个Langendorff灌注系统。逆行灌注是申请通过主动脉在恒压下心中的75毫米汞柱Krebs-Henseleit缓冲区都洋溢着5%的股份有限公司2和95%啊2在37°C。灌注后,局部缺血引起的阻塞的冠状动脉左前降枝(小伙子)30分钟,之后,随后再灌注120分钟。在每个试验中,小伙子reoccluded和灌注停了下来,心中沾1%伊文思蓝溶液注入主动脉揭示该地区面临风险。心样本冻结在一夜之间−20°C。
2.8。梗塞大小的测量
冷冻心肌组织样本切成2毫米厚的横断面切片,沉浸在1% 2、3,去除氯(TTC)解决方案在磷酸缓冲盐(pH值7.4)10分钟37°C。TTC染色后,组织切片被转移到福尔马林溶液(10%)10分钟,然后放置在磷酸缓冲(pH值7.4)。这个孵化后,双方每片用数码相机拍摄。梗塞大小的百分比计算区域的风险。
2.9。统计分析
结果表示为意味着±S.E.M.组间差异计算使用方差分析测试, 被认为是重要的。
3所示。结果
3.1。评价心脏MMP-2活动雌激素消耗,锻炼,和营养
为了更好地理解雌激素缺乏,机制类型的饮食、运动训练可以影响心脏纤维化,我们评估的活动64和72 kDa MMP-2亚型。在12周的实验周期结束的时候,我们发现了一个显著降低( )活动64 kDa MMP-2 sham-operated(所以/ HT)和切除卵巢的(OVX / CTRL和OVX / HT)久坐不动的老鼠相比,所以/ CTRL组。运动训练导致显著增加( 所以/ HT和OVX组)与nonrunning同行相比。比较MMP-2活动的动物,我们发现高甘油三酯饮食所以和OVX动物造成显著降低( 相比之下,所以/ CTRL)值。
的活动72 kDa MMP-2同种型明显减少( )与卵巢切除术和高甘油三酯饮食(OVX / HT)久坐不动的老鼠的心脏。然而,自愿wheel-running运动造成了显著的高度( )每个所以与OVX组相比/ CTRL动物。心从运行/ CTRL动物表现出最高的活动72 kDa MMP-2同种型。此外,显著差异( )观察运行和nonrunning同行之间的/ CTRL, OVX / CTRL, OVX / HT组。数据如图2(一个)和2 (b)。
(一)
(b)
3.2。心脏3 nt水平的决心
图3(一个)表明心脏3 nt水平明显下降( )OVX / CTRL和OVX / HT组与3 nt的值/ CTRL组。3 nt水平与高甘油三酯的心所以老鼠减少饮食,但这一趋势并没有达到统计学意义。运动训练导致显著增加( )所以和OVX大鼠喂饲高甘油三酯与饮食与nonrunning同行相比,除了OVX / CTRL老鼠,3 nt值显著降低( 所以/ CTRL组)。
(一)
(b)
3.3。测量心肌谷胱甘肽
心肌谷胱甘肽水平测量12周结束时的光度法测定的实验时间。明显降低( )谷胱甘肽的发现心里久坐不动的sham-operated样本(/ HT)和切除卵巢的老鼠(OVX / CTRL和OVX / HT)相比,所以/ CTRL组。由于自愿的运动训练,谷胱甘肽水平显示一个重要高度( 与nonrunning同行相比)。数据呈现在图3 (b)。
3.4。评价心脏TIMP-2浓度
确定的角色MMP / TIMP系统在ECM营业额,心脏TIMP-2也检查了。我们的研究结果显示,运动训练显著提高TIMP-2值,由雌激素减少损耗和高甘油三酯的饮食。显著提升 跑步和nonrunning同行之间的)指出。数据如图4(一)。
(一)
(b)
3.5。心脏胶原蛋白I型的浓度
来测试假设运动训练可能调节纤维组织的积累,心脏胶原蛋白类型我通过ELISA测定。而雌激素水平和高甘油三酯饮食导致过度积累的胶原蛋白I型,物理运动训练显著( )减少胶原蛋白积累OVX大鼠的心脏再辅以高甘油三酯的饮食。数据呈现在图4 (b)。
3.6。心肌梗塞扩展
图5清楚地表明,雌激素消耗和高脂肪饮食显著增加( )的坏死延伸心脏心肌梗塞而/ CTRL组。然而,12周的运动废除了不利影响卵巢切除术和高甘油三酯饮食显著减少梗塞的面积在每一个跑步小组。
4所示。讨论
心血管疾病(CVD)是死亡的主要原因之一,它可以导致心脏衰竭包括心脏重构、心肌细胞凋亡和纤维化。炎症,抗氧化状态,中断和雌激素消耗的风险因素可以导致心脏肥大。运动训练是一个安全的非药物治疗心血管疾病的预防和治疗工具促进有利影响,如降低aging-induced心肌细胞凋亡,减少心力衰竭的风险,改善心脏功能。越来越多的研究已经解决,严格监管ECM内稳态的变化可以产生深远影响心脏的结构和功能(8,21]。心脏纤维化的特点是过度沉积的ECM蛋白质,尤其是胶原蛋白,导致病理与增加心肌重塑刚度、肥大,急性心肌损伤,如心肌梗死(10]。间质胶原沉积增加是造成衰老22),心肌缺血(23),炎症过程24)、糖尿病(25,26),和激素(27]。出现,性激素及其受体发挥关键作用的规定ECM蛋白质。MMP-2的相互作用,过氧亚硝基(ONOO−)、谷胱甘肽(GSH)在心脏组织显示新的见解在estrogen-deficient条件下心脏的病理生理学。
我们检查了雌激素depletion-induced胶原蛋白积累和纤维化的机制,通过和心脏肥大差别MMP-2对这些可能发生。我们的研究结果清楚地表明,雌激素水平和高甘油三酯饮食造成胶原蛋白含量显著增加,心脏3 nt和谷胱甘肽水平降低。然而,12周的适度体育锻炼可以减弱OVX-induced心脏纤维化通过谷胱甘肽/ 3 nt和MMP-2监管。我们之前的研究结果证明,海拔引起的血压OVX可能参与这些变化(1,28]。内源性和外源性雌激素的抗氧化作用可能发挥关键作用诱发vasoprotective影响,氧化应激增加绝经后妇女和动物(29日,30.]。Pedram等人表明,雌激素可以防止对myofibroblast开发和生产胶原蛋白、纤粘连蛋白的蛋白质导致心脏重构(4),而E2减少ECM的营业额和施加对心肌细胞凋亡的保护作用,雌激素导致左心室肥大,胶原蛋白沉积,并增加对压缩性的代理商,如血管紧张素ⅱ(31日]。按照文学,我们的研究结果表明,卵巢切除术造成损害心脏形态学与胶原蛋白I型内容的提高。纤维化是多因素疾病,ECM代谢的分子机制与监管涉及多个信号通路。人们普遍认为不活动或久坐不动的生活方式,减少循环雌激素水平,衰老过程,氧化应激可导致过度积累的胶原蛋白矩阵和级数的增加心脏功能障碍(32];然而,负责减少心脏纤维化的机制引起的体能训练不能完全确定。在当前的研究中,我们关注的角色自愿体育锻炼和饮食的类型的修改影响MMP-2监管。基质金属蛋白酶及其组织抑制剂调节ECM的概要文件在正常和病理条件下,基质金属蛋白酶之间的平衡和TIMPs决定心脏重构(33]。在先前的研究中,费利克斯等人证明了卵巢激素不足造成重大损害心脏形态,而低强度的有氧运动使心脏纤维化的增加。然而,他们并没有检验监管的影响MMP-2 [34]。夸克等人研究了胶原蛋白的改变概要针对运动训练和证明,体育锻炼的差别防止老年性对这些活性基质金属蛋白酶(15]。我们的研究小组最近表明,12周自愿运动显著增加MMP-2活动,表明运动的保护作用与胶原蛋白的积累和纤维化。MMP-2降解ECM蛋白质负责心脏重塑。此外,我们还发现,运动训练导致胶原蛋白I型内容的减少和改善MMP / TIMP概要文件导致保护作用对心脏损伤。在目前的研究中,12周的运动训练显著减少梗塞大小,降低雌激素水平,高甘油三酯饮食和肥胖引起的缺血/再灌注后增强的坏死面积的比例。许多研究支持了这样的观点,即女性在更年期和绝经期为心血管病有更大的风险,包括心肌梗塞(MI),这是与氧化应激增加和减少一氧化氮(NO)生物利用度(35,36]。体育锻炼已经成为非药物治疗选择心血管疾病预防和治疗的男性和女性。运动诱发心肌斜阳能力,改善细胞内氧化还原平衡,内皮功能障碍的增加没有生产可以减少梗塞大小的比例(37,38]。阿尔梅达等人报道,运动训练的蛋白表达降低的一个主要途径产生ROS也增加了抗氧化剂过氧化氢酶的酶,这有助于改善心脏功能和重塑过程在心肌梗死后切除卵巢的老鼠31日]。临床研究结果也表明,心脏纤维化与肥胖密切相关,有助于在肥胖女性的心脏功能障碍。Kosmala等人得出的结论是,左心室功能异常有关的变化MMP / TIMP系统可能促进ECM降解的衰减,MMP-2的差别主要是由于对这些肥胖女性(3]。实验协议与运动训练sham-operated和切除卵巢的老鼠导致显著增加MMP-2活动和减少胶原蛋白积累的心,代表一个重要的保护策略来治疗心脏疾病。胶原蛋白营业额和心脏保护机制相关的产生是由于MMP / TIMP概要和MMP的激活途径的结果。MMP-2可以激活蛋白水解和nonproteolytic方式。蛋白水解的激活72 kDa发酵菌发生通过切除autoinhibitory前肽来呈现一个活跃的64 kDa MMP-2或转译后的修改造成的过氧亚硝基(ONOO−)在细胞谷胱甘肽(GSH) (39]。ONOO的能力−,这是一个产品的超氧化物阴离子和一氧化氮(NO),抑制(40,41)或激活(39]MMP-2是有争议的。Rajagopalan等人发现ONOO−增强的gelatinolytic活动unpurified MMP-2在平滑肌细胞(42]。氧化应激转译后的修改可能会导致MMP-2的激活。细胞内的谷胱甘肽水平的存在,ONOO−导致S-glutathiolation构象的变化,导致一个活跃的MMP的形式(43]。
在细胞谷胱甘肽是一种非酶的抗氧化剂,其损耗被认为是氧化应激的重要生物标志物(44]。谷胱甘肽水平的显著减少在我们目前的研究指出雌激素水平和高甘油三酯的饮食。12周的运动训练的持续时间可以恢复心脏的谷胱甘肽水平与他人一致(44,45]。谷胱甘肽在心脏功能起着至关重要的作用,维持体内氧化还原平衡(17]。弗雷泽等人证明了体育锻炼保持心肌谷胱甘肽池和减少心肌损伤后缺血性侮辱(46]。
基质金属蛋白酶的功能性质的复杂性带来了一些局限性,并激活MMP-2不是统一整合,尤其是心血管疾病。此外,没有类似的研究调查的角色改变生活方式(雌激素水平,锻炼,和类型的饮食)的激活和调节MMP-2。
总之,12周的练习导致增强心脏3 nt,谷胱甘肽的水平。海拔高度在3 nt和谷胱甘肽水平,激活72 kDa MMP-2可能对心脏纤维化起到补偿作用。这些数据符合我们进一步发现运动激活MMP-2和改善MMP与TIMP平衡有助于心脏保护和作为治疗在心脏重塑的代理。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
Renata萨博和Zoltan Karacsonyi同样本文作为第一作者。
确认
这项工作是支持的UNKP-17-3(萨博Renata), UNKP-17-4 (Posa Aniko)和UNKP-17-2 (Borzsei丹尼斯)的新国家卓越计划人力能力,efop - 3.6.1 - 16 - 2016 - 00008和2.3.2 ginop - - 15 - 2016 - 00062。