文摘

从女性花序hydroalcoholic提取忽花布l .(啤酒花提取)是评价其抗流感活动。的能力,提取干扰病毒复制的不同阶段进行评估,以及对细胞内氧化还原状态的影响,是不平衡和感染细胞的氧化状态。自由基清除能力、抑制lipoperoxidation和铁减少活动被化验抗氧化机制。植物化学的特征的提取也执行。我们发现,啤酒花提取物显著地抑制多种病毒株的复制,在不同时间从感染。病毒复制时在一定程度上抑制病毒潜伏在提取之前感染,建议直接影响病毒粒子。由于啤酒花提取物能够恢复减少感染细胞的条件下,通过增加谷胱甘肽含量,其抗病毒活性也可能由于一个干扰病毒复制所需redox-sensitive通路。因此,提取物对自由基清除和减少和抑制lipoperoxidation tBOOH-induced细胞毒性的影响。在植物化学的分析,确定了不同的酚醛树脂,它完全可能导致跳抗病毒效果。总之,我们的研究结果强调了抗流感和啤酒花提取物的抗氧化性能,进一步鼓励在活的有机体内研究,评估其可能的应用程序。

1。介绍

如今,流感仍然是全球发病率的主要原因之一,与季节性流感和周期性的大流行。这种疾病是由一种包膜,RNA病毒,主要是上呼吸道感染,但是在可能发生下呼吸道并发症,尤其是在儿童和老人(1]。

尽管不同的策略已经成为了防止疾病和/或管理其并发症,唯一的抗流感药物FDA批准属于两类抑制剂,目标病毒基质蛋白2和神经氨酸酶(2]。不幸的是,他们的效果往往是有限的毒性和小说的出现耐药病毒突变体,因此需要选择和更有效的治疗策略3]。研究领域正在寻找替代分子,天然和合成的起源可能干扰不同的目标,包括细胞主机结构和利用途径,病毒的复制,并减少耐药性的概率(4- - - - - -6]。

几种流感病毒激活细胞内途径redox-sensitive [7,8),有趣的是,一些抗氧化分子,包括多酚类物质,能够调节细胞内的氧化还原平衡,也显示抗流感活动(9- - - - - -11]。天然多酚类化合物,原花青素和儿茶素,已发现具有抗病毒特性,特别是抗甲型流感(12- - - - - -14]。

雌球果花序(跳或锥)忽花布l . (Fam。Cannabaceae)广泛应用于啤酒酿造工业防腐剂和香料添加剂;事实上,h . lupulus被认为是啤酒的一种关键配料,导致苦涩的味道和蛇麻草的香气特征和提供防腐剂和抑菌作用15- - - - - -18]。啤酒是通常被认为是“功能性饮料”的促进健康的物质(19]。其中,多酚类化合物,主要是prenylflavonoids和原花青素,连同类化合物(即xanthohumol)和植物雌激素8-prenylnaringenin,获得了最多的关注[17,20.]。此外,h . lupulus提取用于传统医学苦健胃药,治疗轻度睡眠障碍,结合其他镇静剂缬草等草本植物,西番莲,柠檬香油(21]。

h . lupulus和它的多酚成分具有其他有趣的生物学性质,包括抗菌、抗氧化,抗炎,chemopreventive活动(22- - - - - -24]。虽然抗菌(抗菌和抗真菌)属性是众所周知的,很少报道关于原油啤酒花提取物及其抗病毒活性的纯化组件。Buckwold等。(25发现iso -α酸和xanthohumol温和的抗病毒活性对不同的RNA和DNA病毒,因此建议他们可能作为铅化合物更积极的抗病毒药物。

符合这个证据和我们的初步结果26),在目前的研究中,抗流感活动的hydroalcoholic提取的雌性花序h . lupulus(啤酒花提取物)评估。跳的能力干扰病毒复制的具体步骤使用在体外模型,用宽容上皮细胞系感染不同的流感病毒株。

啤酒花提取物为特征的酚类成分由高性能薄层色谱法(分离法和高性能液相色谱(HPLC-PDA)和总多酚、单宁、黄酮量决心colorimetrically。最后,游离基清除剂能力,藏红花素漂白活动,抑制lipoperoxidation,铁尽可能减少活动进行评估啤酒花提取物的抗氧化和cytoprotective机制。

2。材料和方法

2.1。啤酒花提取

一个hydroalcoholic提取的雌性花序h . lupulusl .(啤酒花提取;批处理n。1101385;代码n。3120004;比毒品/提取4:1),请提供的EPO开发(意大利米兰),被用来执行实验。类黄酮的提取标准包含0.4%,确定芦丁等价物。

2.2。化学物质

所有的化学物质,包括3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT);98%纯度),叔丁基氢过氧化物(tBOOH 70% wt在H2O),特里同x - 100, 1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH;95%纯度),2,2 -azino-bis (3-thylbenzothiazoline-6-sulfonic酸)联胺盐(abt;98%纯度),2,2 -azobis (2-methylpropionamidine)盐酸盐(AAPH;97%纯度),ferrozine(纯度97%),盐酸羟胺(纯度98%),铁(III)氯(FeCl3×6小时2O;硫酸97%纯度)、铁(II)七水硫酸锌(FeSO4×7 h2O;99%纯度),亚铁氰化钾(III)(纯度99.9%)、铁(II)氯(FeCl2×4 h2O;99%纯度),Trolox(纯度97%),标准的酚类化合物(纯度> 95%),溶剂乙醇(EtOH;99.5%纯度)和甲醇(甲醇;99.5%纯度)和antiactin抗体来源于Sigma-Aldrich有限公司(圣路易斯,密苏里州,美国)。碳酸钠(Na2有限公司3;99.999%纯度),Folin-Ciocalteu酚试剂,鞣酸(Ph欧元纯度)和六水合氯化铝(AlCl3×6小时2O;Ph值纯度)从默克公司购买欧元(达姆施塔特,德国)。此外,抗病毒研究试剂,如果不是另有规定,从英杰公司购买(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。

2.3。植物化学的分析
2.3.1。色谱分析

效果和HPLC-PDA酚醛模式进行评估根据先前的标准方法27]。执行效果分析,提取和选择的标准多酚芦丁、绿原酸、儿茶素,和没食子酸溶解在甲醇浓度的30毫克/毫升,1毫克/毫升,分别。酚醛树脂是识别与选择的标准相比(Rf值、颜色和紫外光谱)。

HPLC-PDA,啤酒花提取(20μl)溶解在流动相(1:10稀释系数)和注入HPLC-PDA系统。标准的酚醛树脂,包括苯甲酸、香荆芥酚、儿茶素、绿原酸、表儿茶素、没食子酸,harpagoside,柚苷配基,柚皮苷,警:哦苯甲酸,槲皮素、芦丁、sinapinic酸,syringic酸,t-cinnamic酸,t-ferulic酸、香草酸、封闭的分析。

2.3.2。总多酚、单宁和类黄酮

总多酚、单宁和类黄酮含量是根据标准化分光光度方法,有微小的变化27]。多酚类物质和单宁的总量计算为鞣酸等价物(TAE),而黄酮类化合物被表示为槲皮素等价物(量化宽松政策)。

2.4。抗病毒活性
2.4.1。细胞培养

MDCK细胞(Madin-Darby犬肾)和人类肺癌细胞A549生长在RPMI 1640 - DMEM培养基,分别补充10%胎牛血清的边后卫,0.3毫克/毫升谷氨酰胺,100 U /毫升青霉素,100μ克/毫升链霉素。

2.4.2。细胞毒性试验

的细胞毒性治疗评估使用3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化还原试验(28]。啤酒花提取物溶解在DMSO溶液(浓度范围是20 - 180μg / ml)并将其添加到A549和MDCK细胞24 h。降低细胞毒性是按照百分比计算的可行性HOP-treated细胞相比,控制,也就是说,细胞治疗DMSO孤单。

cytoprotection试验,24小时后用啤酒花提取物预处理,一种低毒浓度(大约40%细胞毒性初步实验中)的prooxidant代理tBOOH (5μ米)添加2 h细胞,然后是细胞生存能力测量如上所述。

2.4.3。病毒感染、滴定和病毒mRNA量化

汇合的层的MDCK或A549细胞与以下甲型流感病毒株:挑战人类/波多黎各/ 8/34 H1N1 (PR8) / NWS / 33 H1N1 (NWS),加州和大流行性流感A / H1N1 / 04/09 (pH1N1)菌株或禽流感鹦鹉/阿尔斯特/ 73 H7N1(阿尔斯特)应变,在感染复数(m.o.i) 3(高m.o.i。)和0.3(低m.o.i)。1 h在37°C。病毒吸附后,细胞用磷酸盐(PBS)然后孵化与媒介补充2%的边后卫24或48小时。

抗病毒活性的评价,啤酒花提取物在DMSO溶液溶解,然后稀释到最终的浓度在细胞培养基。最高的DMSO浓度培养基中是0.2%。控制细胞治疗DMSO独自住在相同的浓度。

跳了治疗如下:1 h在感染(我)之前,1 h吸附期间(组长),和吸附后(postinfection、p)或之前,期间和之后感染(b.d.p.i)。

评价杀病毒的效果,孕育了啤酒花提取物直接与病毒1 h在37°C。然后,混合物被用来感染细胞培养如上所述。

病毒在感染细胞的上清液生产确定24和48 h p。,by measuring the hemagglutinating units (HAU) or the tissue culture infectious dose 50 (TCID50), as previously described [29日]。

M1 mRNA量化,总RNA隔绝A549细胞溶解产物(总RNA净化+装备,一起Biotek, Thorold,,加拿大)和用作模板生成cDNA (iScript cDNA合成装备,Bio-Rad、米兰、意大利)。一个整除的cDNA受到40 rt - pcr扩增的周期(95°C, 10秒;60°C, 30秒)使用智商SYBR绿色Supermix LightCycler智商5 (Bio-Rad、米兰、意大利)。管家基因核糖体蛋白L13A (Rpl13a)是用于规范化。相对定量评价是由比较ΔΔCt方法。

2.4.4。免疫印迹分析

流感病毒感染和HOP-treated(如上所述)MDCK或A549细胞细胞溶解和sds - page其次是西方墨点法分析了抗流感(默克密理博,达姆施塔特,德国)和antiactin抗体。HRP-linked抗体和anti-mouse(杰克逊ImmunoResearch,纽马克特,英国)被用作二次抗体。膜是用清晰的开发西部ECL衬底(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。

2.4.5。免疫荧光分析

孵化后PR8病毒啤酒花提取和混合感染(或单独使用PR8), A549细胞被固定和甲醇,permeabilized Triton x - 100和0.1%沾anti-NP抗体(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。Alexa-Flour 488 -共轭anti-mouse用作二次抗体。核沾染了4 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)。

2.4.6。谷胱甘肽测定

谷胱甘肽水平量化在A549细胞溶解产物PR8 -或pH1N1-infected HOP-treated (pi和b.d.p.i。)细胞,如前所述[30.]。谷胱甘肽水平也以细胞治疗的溶解产物prooxidant代理tBOOH (5μ米)。在这些实验中,啤酒花提取物的抗氧化作用是评估在预处理及后处理cotreatment +协议。蛋白质含量测定与布拉德福德试剂(Bio-Rad、大力神、钙、美国),谷胱甘肽水平表示为nmol /毫克的蛋白质。

2.5。抗氧化活性

所有测试在96年进行多井微型板块远离直射光;实验至少重复两次,在每个实验中,每个浓度测试一式三份。从至少两个实验获得的数据集中进行统计分析。

进行化验,啤酒花提取物溶解在去离子水中,在每个测试,合适的正面或负面的控制(Trolox、芦丁和槲皮素作为标准抗氧化剂代理)都包括在内。的吸光度测量标(时代微型板块分光光度计,BioTek)。

2.5.1。自由基清除活性

abt和DPPH自由基清除活性测定根据Di et al。(27用微小的变化)。简单地说,DPPH解决方案(40μl;0.1毫米在EtOH 100%v/v样本(160)和测试μl)孵化30分钟在黑暗中在室温下,然后DPPH自由基的吸光度测量在517海里。abt化验,相同体积的abt(5毫米在PBS 0.1 M, pH值7.0)和AAPH(2毫米在PBS 0.1 M, pH值7.0)混合和孵化45分钟在68°C,获取abt激进的阳离子。样例(20μl)添加到激进的解决方案(180μl)和盘子被孵化10分钟在黑暗中在37°C,然后读取在734海里。食腐动物活动的百分比计算如下: ,在哪里 单独的吸光度是激进的, 是激进的样本。

2.5.2。藏红花素漂白试验

分析是根据Di Majo et al。(31日用微小的变化)。执行分析,藏红花素的解决方案(40μl;3.5毫米在PBS 0.1 M, pH值7.4),AAPH (10μl;0.25年的PBS 0.1米,pH值7.4),提取(40μl)和PBS (110μl;0.1米,pH值7.4)涨跌互现;然后在黑暗中混合是在40°C的环境为60分钟。孵化后,藏红花素吸光度是阅读在443海里。抗氧化活性的百分比计算如下: ,在哪里 藏红花素的吸收,而 是激进的样本。

2.5.3。抑制脂质过氧化作用

试验是由硫氰酸铁方法根据Di音调甚et al。32]。简单地说,样例(125μPBS (500 l)μl;0.2米,pH值7.0)和亚麻油酸乳液(625μ在37°C l)孵化96 h。一些整除(100μ每24 h和l)被进一步添加乙醇(470μl;75%v/v),FeCl2(10μl;200毫米在3.5%w/v盐酸)和亚铁氰化钾(KSCN 10μl;30%w/v在去离子水中)。发布过氧化物在亚油酸过氧化反应,铁离子氧化亚铁,因此形成一个红色的硫氰酸铁(III)复杂,测量在500 nm spectrophotometrically。lipoperoxidation抑制(LPI)的比例计算如下: ,在那里 吸光度的车辆 的测试样本。

2.5.4。铁减少活动

活动由ferrozine评估分析,根据之前发表的方法(27]。简单地说,等于FeCl卷3×6小时2O (200μM在醋酸盐缓冲溶液0.1 M, pH值4.5)和样本混合2分钟,然后ferrozine解决方案(5毫米醋酸缓冲溶液0.1米,pH值4.5)被添加到混合物中。ion-ferrozine亚铁复杂,相应的减少活动样本,测量在562 nm和活动的百分比计算如下: ,在那里 车辆的吸光度, 的测试样本。

2.6。统计分析

抗氧化剂的研究中,所有的值表示为±SE和意思 代表的数量的经验。

抗病毒研究所有值表示为±SD和意思 是复制的数量为每个治疗。

统计分析是由GraphPad棱镜™软件(GraphPad软件公司,圣地亚哥,加利福尼亚州,美国)。

单向方差分析(ANOVA),其次是Dunnett多重比较的后续测试,用于分析不同治疗之间的差异,而学生的 以及用于确定两个不同的实验条件之间的统计学意义。的值 被认为是重要的。

量效曲线建立了使用“希尔方程”: ,在那里 表达的效果是提高亚铁螯合物在给定受体激动剂的浓度, 是最大的螯合亚铁活动,集成电路吗50所产生的浓度是50%的抑制反应, 是摩尔的受体激动剂浓度,HillSlope兴奋剂曲线的斜率。

3所示。结果与讨论

3.1。植物化学的分析

效果分析表明,在不同的多酚类物质的色谱图,证明荧光斑点,和更好的可视化与NPR衍生和茴香醛(图S1)。其中,芸香苷、绿原酸和没食子酸被确定。HPLC-PAD分析证实了芦丁的存在作为最丰富的酚类化合物之一,随着syringic酸和阿魏酸;警:哦苯甲酸低水平突出,没食子酸和绿原酸(表1)。

表1
酚类成分HPLC-PDA啤酒花提取物的分析。

比色决定强调多酚/单宁比约为4,而总黄酮含量由供应商(表同意宣布2)。的基础上火线,啤酒花提取物的总类黄酮含量导致约0.4%的原材料。根据彼得森和德怀尔(33),在食品分类类黄酮浓度低(0.1 - -39.9毫克/公斤),中等(40 - 99.9毫克/公斤),和高(> 100毫克/公斤),原材料是包含一个高黄酮(即。950毫克/公斤),从而证明其作为营养来源可能的作用。

表2
大量的总多酚、单宁和啤酒花提取类黄酮( )。

根据我们的结果,农业等。(24)强调,syringic酸以及原花青素和儿茶素的主要成分是hydroacetone提取的h . lupulus水平较低的植物,槲皮素、柚苷配基、山柰酚、xanthohumol。阿魏酸在methanolic还发现提取的视锥细胞h . lupulus(34]。此外,槲皮素苷、芦丁等异槲皮苷、丙二酸和异槲皮苷,被确认为水的主要生物活性成分提取啤酒花植物(35]。槲皮素和山柰酚苷也发现h . lupulus锥和年轻芽(36,37]。

样本的啤酒花提取不含有槲皮素和柚苷配基,尽管大量的芦丁。这可能是一个温和的结果提取条件(基于浸渍在乙醇90%v/v),它允许一个贫穷的糖苷水解。事实上,芦丁水解酸化条件下被发现发生高浓盐酸和延长加热时间(38]。一个重要的影响在酚浓度提取方法h . lupulus提取报道:尽管非常低的水提取物中酚类金额,hydroalcoholic样本被发现丰富的表儿茶素、绿原酸、没食子酸、儿茶酸、安息香酸、阿魏酸、o-coumaric酸(39]。提取方法也影响prenylflavonoids的总量和苦,长期和热萃取条件下不稳定(40]。

3.2。抗病毒活性
3.2.1之上。啤酒花提取物抑制流感病毒复制的病毒生命周期的不同阶段

为了研究可能的抗病毒活性的啤酒花提取物,首先它是必要排除任何测试细胞株的细胞毒性效应。使用浓度的提取从20到180年μg / ml MDCK A549上皮细胞系,我们表明,细胞生存能力的百分比等于或高于90%直到140的浓度来控制细胞μ在这两个细胞系(图g / ml1(一))。自从略有减少(大约13%)观察细胞增殖细胞治疗时跳180μg / ml,我们选择排除这个浓度以下实验。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图1
(一)MDCK细胞生存能力(的比例控制)和A549细胞的啤酒花提取物不同浓度处理24小时通过MTT实验来评估。(b)抑制病毒效价的比例由啤酒花提取物(10 - 140μg / ml)对MDCK细胞感染PR8病毒(低m.o.i。)和处理跳感染后24 h。数据均值±SD从三个独立的生物复制,每一个在两个技术复制( )。 与学生的未感染的细胞 以及。(c)病毒蛋白免疫印迹分析(HA:血凝素;NP:核蛋白质;拿拿淋:神经氨酸酶;M1:矩阵1蛋白质)从PR8-infected MDCK细胞,治疗跳(80 - 140年μg / ml)感染后24 h。

接下来,我们测试了不同浓度的抗病毒活性(10 - 140μ克/毫升)的跳上肾上皮MDCK细胞,众所周知的流感病毒是非常宽容的。如图1 (b),提取抑制PR8病毒复制在统计学意义( 从50μg / ml)和浓度的方式,集成电路50值为99(保密限制,93 - 110年)μ克/毫升。病毒蛋白免疫印迹分析同样显示出剂量依赖性降低血凝素(HA),神经氨酸酶(NA)核蛋白(NP)和矩阵protein1 (M1)相比,感染和HOP-treated细胞感染的(图1 (c))。

在此基础上初步证据,140年的最高浓度μg / ml被选中的人类肺上皮A549细胞抗病毒化验。特别是,这些细胞被感染不同的流感病毒(NWS PR8, pH1N1,阿尔斯特)和跳在不同时间处理感染:之前(我),(组长),期间和之后(p)或之前,期间和之后感染(b.d.p.i)。如图表所示的图2前,治疗感染无效。相反,当啤酒花提取物添加到培养基在1 h感染病毒,它能够减少病毒效价,部分但是很大程度上PR8, NWS,阿尔斯特株(46%,50%,和29%的抑制,职责)。跳治疗感染后表现显著降低pH1N1, PR8,阿尔斯特效价(75%、44%和29%,分别地。)。有趣的是,在治疗之前执行,期间,感染后,它大大降低了病毒效价的菌株,表明啤酒花提取物的抑制加性效应,不断出现在所有的时候感染的时间。


图2
病毒效价测量浮在表面的A549细胞的感染不同的流感病毒株,140处理μg / ml啤酒花提取1 h在感染(我)之前,1 h吸附期间(组长),和之后吸附(postinfection: p)或之前,期间和之后感染(b.d.p.i)。病毒生产由红血球凝聚试验确定24小时pi, HAU百分数表示,(从未经处理的效价,感染细胞被认为是100%)。数据均值±SD从三个独立的生物复制,每一个在两个技术复制( )。 与学生的未感染的细胞 以及。
3.2.2。啤酒花提取物对部分杀病毒的效果

在尝试解释分子机制对啤酒花提取物对流感病毒感染细胞,我们决定评估病毒生命周期的不同阶段。首先,我们分析了啤酒花提取的效果在1 h感染。在这一步中,我们可以假设一个杀病毒的提取的影响或影响病毒生命周期的早期阶段。啤酒花提取物是孵化直接与病毒然后用于感染细胞的混合物,所述材料和方法。PR8生产,由红血球凝聚试验测量,明显抑制,当高和低m.o.i.的病毒都是使用,但更高比例的抑制低m.o.i.时使用(约70%和近92%的抑制,职责。,图3(一个))。使用TCID50化验结果证实了,也就是说,抑制病毒复制的80%提取时孵化m.o.i.高的病毒,当使用低m.o.i.的病毒,90%以上确认的啤酒花提取病毒的抑制作用存在剂量依赖的相关性,因为它将杀病毒的影响(表3)。免疫印迹分析PR8蛋白质从细胞溶解产物获得感染PR8-HOP混合物显示病毒蛋白的低表达相比仅在细胞感染病毒(图3 (b))。当细胞被感染也获得了类似的调查结果与其他病毒株preincubated啤酒花提取(见图S2)。此外,在这些条件下,一个病毒核蛋白(NP)的免疫荧光分析了使用低m.o.i.的病毒。和免疫印迹结果显示,图像在图4表明,NP少表达细胞感染virus-HOP混合物而感染的。总的来说,这些结果表明,啤酒花提取产生至少部分直接影响病毒颗粒,减少感染的能力。它已经表明,提取细菌细胞结构产生有害影响;特别是,其疏水组件合并到细胞膜,改变离子交换(23]。因此,它是合理的,跳组件可以包含在包膜病毒的膜,如流感,破坏病毒结构。然而,我们不能排除,跳可以进入细胞,在早期阶段的周期。观察免疫荧光图像,NP出现的定位也受到影响,在HOP-treated感染细胞的细胞核,虽然它是分散在整个细胞(细胞核+细胞质)在未经治疗的感染细胞(图4)。这个结果表明,啤酒花组件也可以进入细胞,通过干扰virus-activated细胞通路,进而控制NP交通和本地化。

(一)
(一)
(b)
(b)
图3
(a)病毒效价测量浮在表面的A549细胞感染PR8病毒m.o.i(高或低),孵化后与140年的病毒μg / ml啤酒花提取。效价测定24小时pi红血球凝聚分析和表达为HAU相比的百分比,从细胞治疗病毒感染。数据均值±SD从三个独立的生物复制,每一个在两个技术复制( )。 和 与学生的未感染的细胞 以及。(b)的病毒蛋白免疫印迹分析获得样本中描述(a),肌动蛋白是用来加载控制。
表3
TCID50从上层的A549细胞PR8病毒感染后潜伏期与140年的病毒μ克/毫升跳。

图4
免疫荧光图像的病毒核蛋白(绿色荧光)在A549细胞PR8病毒感染24 h (a)和孵化后与140年的病毒μg / ml跳(b)。核与DAPI染色(蓝色)。

机制假设深处,我们进行第二组实验在第一次病毒的复制周期。首先,我们重复的免疫荧光分析病毒NP使用高m.o.i. 4 h和8 h的病毒感染。如图5(一个)左面板,NP是局部感染细胞的细胞核和细胞质中增加强度从4 h pi 8 h p。,因此病毒生命周期的发展。当病毒是preincubated跳(中间面板),图片出现不同,弱,扩散染色可见一些亮在4 h p。,which could represent viral particles sticking to the cell membranes and a lower number of infected cells at 8 h p.i. Moreover, in the cells that were infected, NP was localized mainly in the nuclei. When the cells were infected and treated with HOP after infection (right panel), the main effect was a different NP localization, being the viral protein mainly in the nuclei of infected cells at 8 h p.i.

(一)
(一)
(b)
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(c)
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图5
(一)免疫荧光图像的病毒核蛋白(绿色荧光)在A549细胞感染4 h和8 h PR8病毒(左面板),PR8和140μg / ml跳混合物(中间面板)或跳PR8感染后治疗(右面板)。HAU /毫升值(8 h p。)报告以下图片。(b) M1 mRNA水平测量中存在的A549细胞感染PR8病毒2 h, PR8 /跳混合物或跳在(组长),治疗后(p),或在加上后(结论)感染。(c) TCID50私家侦探从上层的收获8 h (a)的样品一样。

执行的mRNA水平的病毒M1中存在2 h p。(图5 (b))显示减少M1 mRNA的表达在细胞感染和跳对待不同的程序,特别是与virus-HOP混合物,可以被感染细胞的数量减少的结果。因此,浮在表面的感染细胞8 h pi TCID50显示更高的抑制时细胞已感染virus-HOP混合物(图5 (c))。

3.2.3。啤酒花提取恢复流感病毒感染细胞的胞内谷胱甘肽的水平

在目前的研究中,我们还注意到,啤酒花提取物发挥抗病毒效应后,增加了感染特别是之前,期间和之后的感染。这些数据让我们假设跳可以法案还在病毒生命周期的另一个步骤,进一步的机制,即干扰氧化还原平衡由流感病毒引起的。众所周知的事实,一方面,其他h . lupulus提取物和茶多酚抗氧化性能[展出23];另一方面,一些病毒,包括流感,诱导的氧化应激激活redox-sensitive通路用于他们的复制8,41)和氧化还原变化的一个标志是由谷胱甘肽(GSH)消耗在感染细胞29日,42]。因此,我们测量了谷胱甘肽水平在感染细胞和HOP-treated之后或之前,期间和之后的感染。结果相比,感染和未感染的细胞(控制、CTR)。正如我们所料,病毒感染引起了重大的谷胱甘肽耗竭(图6)。有趣的是,治疗感染后的啤酒花提取物能够还原谷胱甘肽水平的30%和40%(相比,PR8 pH1N1-infected细胞,控制)。更重要的抗氧化作用被发现当添加啤酒花提取物,期间,感染后,事实上,谷胱甘肽含量达到60% (pH1N1-infected细胞)和73% (PR8-infected国家),以控制细胞。


图6
谷胱甘肽水平以A549细胞溶解产物PR8或pH1N1病毒感染和治疗140μg / ml啤酒花提取后吸附(postinfection: p)或之前,期间和之后感染(b.d.p.i)。表示为百分数nmol /毫克蛋白水平(从控制细胞水平被认为是100%)。数据均值±SD从三个独立的生物复制( )。 和 与学生的感染细胞 以及。

在试图解释如果谷胱甘肽含量越高跳治疗可能是由于减少病毒感染或提取的监管效果,A549细胞治疗2 h和24小时后prooxidant代理tBOOH预处理啤酒花提取物。在这些实验条件,tBOOH诱导轻微但显著减少的细胞生存能力比汽车低(大约20%),消失在跳(图的存在S3a)。这些数据也证实了在Caco-2细胞(图S3b),它代表了广泛的标准化模型为研究氧化应激毒性和膳食抗氧化剂的作用[43]。此外,谷胱甘肽水平明显降低tBOOH(至少减少70%的车辆所有的实验条件),证实了细胞形态学变化(数据S4和S5)。添加啤酒花提取细胞,在预处理及后处理cotreatment +协议,可以部分抵消tBOOH-induced氧化毒性和细胞形态学变化数据S4和S5)。这个证据证实我们的假设测试样品的抗氧化能力,尽管PR8-infected细胞中谷胱甘肽水平越高对受损的tBOOH表明杀病毒的结合和抗氧化机制有助于抗病毒啤酒花提取的属性。总的来说,结果表明,啤酒花提取实际上充当抗氧化剂在感染细胞。它可以缓冲活性氧(ROS),在感染(生产44),通过这种方式,它可以减少谷胱甘肽耗竭。这个事件反过来可能会阻止一些redox-regulated细胞通路对流感病毒的复制很重要。大量的多酚类物质已被证明能够抑制例如MAP激酶的磷酸化,包括p38 MAPK和ERK,参与NP交通(4,9,45]。还需要进一步的研究来区分所涉及的分子途径啤酒花提取物抗病毒效果。

3.3。抗氧化活性

在流感病毒感染,NADPH氧化酶同种型4 (NOX4)是生产活性氧的主要来源(8]。事实上,抑制NOX4活动或RNA沉默这种酶,通过阻止活性氧增加,防止MAPK磷酸化,抑制NP交通和病毒释放。为了澄清的可能机制啤酒花提取物对流感病毒感染细胞的抗氧化效果,不同在体外抗氧化剂进行了分析。的自由基清除属性示例中,氢和电子转移的基础上,对合成显色abt和DPPH自由基进行评估。尤其是啤酒花提取物(0.001 - 2毫克/毫升)抑制,显著和浓度的方式,abt和DPPH自由基,证实了IC50值(表4)。积极控制Trolox约为115——150倍更有效对DPPH和abt,分别。根据皮尔森分析,这些活动都显著相关(表5),尽管样本对abt是最有效的(几乎两倍),可能暗示清道夫的电子转移的主要参与活动。考虑到DPPH和abt激进分子强烈的化学结构不同,亲和力,反应动力学,更高的亲和力可以假设abt的酒花成分。一个hydroalcoholic提取物h . lupulus锥表现出彻底的清除DPPH自由基的影响在更高浓度对己烷和甲醇提取,虽然它包含高水平的没食子酸、槲皮素和山柰酚衍生品:这表明这些化合物不能彻底清除的主要负责提取的属性(34]。弱DPPH清除活动也被报道的叶子忽花布(46]。

表4
集成电路50啤酒花提取的值和标准抗氧化剂代理Trolox抗氧化剂化验。
表5
皮尔森相关系数在啤酒花提取物抗氧化活性分析。

在我们的实验条件下,啤酒花提取物也表现出抗氧化作用的藏红花素漂白试验(图7),是集成电路50关于44-fold价值高于Trolox(表4)。藏红花素漂白是一个常见的抗氧化方法,它使用藏红花素作为底物和AAPH自由基来源:抗氧化剂与藏红花素竞争和干扰藏红花素的漂白。这个试验是分类中那些涉及一个氢的转移和适用于水系统(47]。皮尔森分析的基础上,通过提取藏红花素漂白抑制导致显著与abt和DPPH自由基的清道夫活动(表5)。虽然DPPH和藏红花素漂白化验都是基于阻断自由基的氢转移,啤酒花提取了最有力的反对crocin-derived自由基DPPH自由基。这种差异可能是由于每个试验所需的反应介质(水介质的藏红花素增溶,在甲醇或乙醇对DPPH) (48),特定的生物活性化合物的低溶性,因此弱有效。在这种背景下,水介质似乎倾向于激进的啤酒花提取物的清除属性,因此建议水溶性的生物活性成分的存在。


图7
啤酒花提取的效果AAPH-induced藏红花素漂白后24 h(孵化。数据均值±SE从两个独立的实验中,每一个在两个技术复制( )。

啤酒花提取还发现可以抑制脂质过氧化反应在硫氰酸铁试验,已经在低浓度(图8),如由IC确认50价值(表4)。脂质过氧化作用由一系列免费radical-mediated连锁反应过程和与几种类型的生物损伤(48]。硫氰酸铁的方法,这里使用的过氧化物的量,它是由脂质氧化初始阶段中ROS损伤。在这个分析,产生氢过氧化物的autoxidization亚油酸和间接测量硫氰酸铁复杂的形成。根据皮尔森分析,lipoperoxidation由啤酒花提取物的抑制导致了与游离基清除剂显著相关活动(表5),从而表明挡住了激进的物种可以防止脂质过氧化的感应。考虑到脂质过氧化代表一个细胞氧化损伤的主要形式,由羟基自由基通过氢原子的不饱和脂肪酸的提取膜磷脂(49),我们可以假设啤酒花提取物可以干扰细胞生物膜的过氧化反应(通过直接ROS中和或通过阻断他们的一代),防止他们的结构变化,从而导致cytoprotective效果。


图8
啤酒花提取物对亚油酸氧化的影响(24 h(孵化)以硫氰酸铁的方法。数据均值±SE从两个独立的实验中,每一个在两个技术复制( )。

在我们的实验条件下,提取结果也能够降低铁离子,尽管效力较低(大约140倍)积极控制Trolox(表4)。皮尔森分析、估计的铁3 +减少活动似乎与lipoperoxidation抑制(表5)。活性氧物种生产也可以通过元素的物种,如铁,参与metal-catalysed生物基质的氧化和氧活性物种的生成(48]。铁还原能力,基于电子捐赠抗氧化的能力,代表了一个进一步的抗氧化剂和cytoprotective机制,因为减少物种可以被氧化的生物基质(50]。在这种背景下,我们的研究结果表明,啤酒花提取包含减少物种,可以参与脂质过氧化的抑制作用。这种效应也应该有助于抵消氧化还原平衡由病毒感染引起,因此调解cytoprotective和抗病毒效果。因此,皮尔森分析表明啤酒花提取物的抗病毒活性显著相关的抗氧化性能,特别是铁3 +减少活动和lipoperoxidation抑制(表6)。

表6
皮尔森相关系数之间的抗病毒活性和啤酒花提取物的抗氧化活性。

综上所述,目前的结果表明,啤酒花提取物能够直接或间接地影响ROS-mediated细胞损伤。也似是而非的啤酒花提取物可能干扰NOX4酶或下游通过氧化应激通路被激活。

抗氧化性质h . lupulus广泛归因于其酚类成分。最重要的抗氧化活动由prenylated显示类化合物(即。xanthohumol)主要是由于prenyl组(51]。Prenylflavonoids报道能够螯合二价金属,从而抑制ROS的一代。另一方面,不同的茶多酚的抗氧化性能,如槲皮素、绿原酸、syringic酸、安息香酸、儿茶素、儿茶素,已发表(24,52]。因此,这些化合物可以导致提取物的生物活性。

4所示。结论

在目前的研究中,我们描述的抗病毒性能hydroalcoholic提取的雌性花序h . lupulus,关注的能力直接对抗病毒复制和病毒蛋白合成和间接增加抗氧化剂的宿主细胞防御机制,可能由于酚类内容。

的抗病毒性能非常有限的证据h . lupulus和它的成分可以在文学特征。Buckwold等。(25)没有发现跳粗提取物抗病毒作用及其化合物对甲型和乙型流感病毒株。

h . lupulus锥代表酚类化合物的重要来源,据报道,其中一些对一些病毒感染产生抑制效应(53- - - - - -58]。尤其是在多酚中标识啤酒花提取物,据报道,芦丁和槲皮素抑制流感感染动物模型,以及体外病毒神经氨酸酶的活动(59- - - - - -61年)和syringic酸和没食子酸被发现是有效的抗流感化合物(62年,63年]。这一证据支持我们的假设可能参与的酚类成分抗病毒啤酒花提取的属性。特别是,芦丁、syringic酸和没食子酸似乎是潜在的生物活性成分,虽然不能排除所有phytocomplex的贡献。总之,这些化合物可以通过干扰病毒粒子生命周期和增强宿主细胞的防御,主要抵消所需的氧化还原平衡病毒感染。

总之,我们的研究结果表明,啤酒花提取能够起到抗病毒和cytoprotective双重作用,可用于预防和治疗流感。鼓励进一步的调查,以确定可能的应用啤酒花提取物作为抗流感药物或结合传统的抗病毒药物。

数据可用性

高性能薄层色谱分离法的啤酒花提取物及其对复制的影响不同的流感病毒株,对叔丁基氢过氧化物的氧化损伤和谷胱甘肽水平诱导A549细胞的支持材料。

的利益冲突

作者没有要申报的东西。

作者的贡献

安东内拉·迪·拉斯泰利和Paola Checconi同样导致了这项工作。

确认

这项工作是支持的部分Ateneo(卢西亚Nencioni,安东内拉·迪·拉斯泰利压低,安娜特蕾莎修女Palamara)和MIUR-PRIN2015W729WH(安娜特蕾莎修女Palamara)资助。安东内拉·迪·拉斯泰利惊喜之时,西尔维亚Di Giacomo和普Carissimi奖学金支持的“恩里科和艾瑞卡Sovena”基金会(意大利),虽然Paola Checconi奖学金是由巴斯德史Italia-Fondazione森西Bolognetti。

补充材料

图S1:高性能薄层色谱分离法的啤酒花提取的多酚类化合物。(一)可视化在366海里没有衍生化。后在366 nm (b)可视化天然产品试剂(NPR)衍生化。(c)可视化在白光在NPR和茴香醛衍生化。(d)可视化茴香醛/ NPR衍生化后在366海里。在255纳米(e)可视化。图S2:啤酒花提取的效果在A549细胞复制不同的流感病毒株。(一)病毒效价测量在A549细胞感染pH1N1上层清液,NWS,或阿尔斯特紧张,孵化后与140年的病毒μ克/毫升的啤酒花提取物。(b)的病毒蛋白免疫印迹分析获得样本中描述(a)。图S3:啤酒花提取物(60 - 140的效果μg / ml)叔丁基氢过氧化物引起的氧化损伤(tBOOH;5μ米)在A549 (a)和Caco-2细胞(b)。图S4:谷胱甘肽水平以A549细胞溶解产物处理tBOOH tBOOH和啤酒花提取(140μg / ml)预处理(a)和cotreatment +后处理(b)协议。图S5: A549细胞的形态学处理tBOOH tBOOH和啤酒花提取(140μg / ml)下cotreatment +后处理协议。(补充材料)