文摘

高血糖诱导氧化应激和在血管疾病的发展中起着重要的作用。在这里,我们证明了过氧物酶体的潜力proliferator-activated受体(PPAR)β/δ在衰减高glucose-induced氧化应激激活内皮细胞和糖尿病老鼠,指着核转录因子的参与红细胞2 (Nrf2)两个相关因素。HUVECs显示暴露于高葡萄糖水平的提高活性氧(ROS)和调节NOX-2, NOX-4, Nrf2, NQO-1 PPAR明显逆转的影响β/δ受体激动剂GW0742 L165041。两个PPARβ/δ受体激动剂、浓度的方式诱导的转录和蛋白质upregulation血红素oxygenase-1低收入和high-glucose条件下(HO-1)。所有PPAR的影响β/δ受体激动剂是由药物抑制或逆转的PPAR差别siRNA-based对这些β/δ。这些在体外发现被证实在糖尿病大鼠GW0742对待。总之,PPARβ/δ激活授予血管防止高血糖诱导的氧化应激通过抑制NOX-2 NOX-4表达式加上HO-1的直接感应;的差别与后续对这些Nrf2途径。因此,PPARβ/δ感兴趣的激活可能是预防糖尿病血管并发症的进展。

1。介绍

控制高血糖的糖尿病是与许多微观——和macrovascular并发症(1]。几行证据倡导者的角色发展的内皮功能障碍心血管疾病(CV) (2]。早期内皮功能障碍(ED)代表的关键步骤和糖尿病危害血管并发症的预后标记的特点是减少血管舒张药的生物利用度3]。在高血糖、氧化应激和高浓度的活性氧(ROS)的血管ED(息息相关4]。生产过剩的活性氧报道导致广泛的潜在的破坏性中间体,破坏DNA,蛋白质,膜结构,代谢活动,从而引起细胞功能和细胞死亡,最后导致改变prooxidants之间的平衡和抗氧化剂产生一些疾病的结果(5]。

核因子红细胞两个相关因子2 (Nrf2)是一个基本的亮氨酸拉链蛋白质,抑制氧化应激通过激活多个防御和抗氧化基因的转录6]。内皮,Nrf2报道通过增加活性氧生成被激活(7)和多个研究已经证明的有效性Nrf2信号在抵消有害活性氧的反响内皮(8,9]。

过氧物酶体proliferator-activated受体-β/δ(PPARβ/δ核受体)是一组的成员扮演不同的角色在新陈代谢,发育和细胞分化。PPARβ/δ调节许多基因参与葡萄糖稳态,因此和脂肪酸代谢是广泛表达在代谢活跃的组织(10,11]。在高脂肪饮食- (HFD)诱导2型糖尿病,PPARβ/δ激活改善葡萄糖和脂类代谢和授予血管保护(12]。先前的研究已经表明,独立的代谢行为,PPARβ/δ受体激动剂改善内皮功能障碍动物模型与ROS增加相关的疾病,如肥胖,糖尿病和高血压12- - - - - -16]。此外,PPAR的激活β/δ恢复改变胰岛素信号通路在人类内皮细胞暴露于高葡萄糖水平(17)和改进的动脉血管反应性糖尿病啮齿动物(13,14,18]。论文内皮保护作用似乎是通过抑制线粒体介导的,17)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH) oxidase-derived ROS生产(14和ERK1/2激活17]。尽管PPARβ/δ激活保护对糖尿病危害氧化损伤内皮血管通过减少活性氧的来源,目前尚未报道的角色Nrf2信号调解PPAR的保护作用β/δ。因此,我们证明了PPAR的调节效应β/δ激活Nrf2及其目标基因上使用在体外和高glucose-induced内皮细胞模型在活的有机体内糖尿病动物模型。

2。材料和方法

2.1。细胞培养和治疗

人类脐静脉内皮细胞(HUVECs),隔绝线静脉如前所报道(14一些适应,被用于所有在体外实验。199年媒介分离细胞培养(M199),和细胞通道2 - 5是用于实验。2 h后血清饥饿,HUVECs服用10−7-10年−6M GW0742或L165041 24 h在低糖(LG;5毫米)或high-glucose (HG;30毫米)条件。其他HUVECs preincubated 10−6M GSK0660, PPARβ/δ拮抗剂,1 h与PPAR治疗之前β/δ受体激动剂。

2.2。转染的PPARβ/δ核

支流HUVECs和PPAR转染β/δ或控制siRNAs(美国Dharmacon拉斐特公司)使用Lipofectamine RNAiMAX(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA) 48小时(19]。PPAR的效率β/δsiRNAs转染是确认使用qPCR和免疫印迹。

2.3。细胞内活性氧的测定

HUVECs被播种在96孔板和PPAR对待β/δ受体激动剂或拮抗剂在LG或HG M199然后孵化5μ米2 7 二乙酸-dichlorodihydrofluorescein (CM-H2DCFDA) 37°C为30分钟。洗后,荧光强度是决定使用一个微型板块读者(Fluorostart, BMG实验室技术,Offenburg,德国)。

2.4。基因表达分析

PPAR的影响β/δ激活Nrf2的表达,NAD (P) H醌脱氢酶1 (NQO-1)、血红素oxygenase-1 (HO-1) NOX-4,使用qPCR NOX-2, NOX-1评估。短暂,总RNA是孤立的、量化和反转录成互补脱氧核糖核酸。正如我们之前报道[执行qPCR14),使用在表描述的引物组1。使用2获得的数据进行了分析−∆∆Ct方法β肌动蛋白或GAPDH看家基因和规范化的对照组。

表1
寡核苷酸的实时存在。
2.5。免疫印迹分析

从HUVECs蛋白质sds - page分离和transblotted到PVDF膜(14,15]。这些墨迹与抗体探测(圣克鲁斯生物技术、钙、美国)对Nrf2 NQO-1 HO-1,α肌动蛋白(圣克鲁斯生物技术、钙、美国)二级抗体紧随其后。ECL系统(英国Amersham)被用来开发和可视化的屁股然后分析使用Scion Image-Releaseβ4.02软件(http://scion-image.software.informer.com/)。

2.6。动物实验

PPAR的影响β/δ激活在主动脉Nrf2信号研究使用雄性Wistar鼠体重280 - 320 g和保持在12 h光/暗周期24±1°C标准的鼠粮水随意。实验机构审查委员会批准的协议是格拉纳达大学的(西班牙),和所有程序进行了根据实验动物保健和使用指南由国立卫生研究院出版。1型糖尿病是由注入50毫克。公斤−1链脲霉素(STZ) (Sigma-Aldrich) [14柠檬酸)溶解在缓冲(pH值4.5)尾静脉。三天后静脉(注射)。STZ注射、动物快18 h筛选使用Accu-Chek英杰华glucometer(罗氏诊断S.L.西班牙巴塞罗那)和大鼠血糖200 mg / dL−1以上选择。同时,控制老鼠收到一个输液柠檬酸缓冲。控制和糖尿病动物被分成4组 -10)如下:

组我(控制):老鼠收到车辆填喂法的1%甲基纤维素5周。

第二组(GW-treated):老鼠收到5毫克/公斤/天GW0742溶解在1%甲基纤维素20.,21强饲法每日的]5周。

第三组(糖尿病):糖尿病大鼠收到车辆填喂法的1%甲基纤维素5周。

第四组(GW-treated糖尿病):糖尿病大鼠收到5毫克/公斤/天GW0742溶解在1%甲基纤维素20.,21强饲法)。

治疗结束时,老鼠被牺牲,解剖和胸主动脉被移除。主动脉被切成圈,低温贮藏在0.1 M PBS + 30%蔗糖1 h,包括在10月中期和保持冷冻−80°C,而其他的戒指被用来测定NADPH氧化酶活性。胸主动脉的其他样本被用来隔离RNA,与基因表达决心如上所述。

2.7。原位检测血管过氧化物阴离子生产

冰冻的主动脉环切成10μ米横截面采用低温恒温器(Microm国际HM模型500 OM)。部分是沾染了10μM dihydroethidium(她)30分钟在黑暗中在室温下与DAPI对比染色紧随其后。在接下来的24小时,她/ DAPI-stained部分使用荧光显微镜检查(徕卡DM IRB,位于德国)和图像捕获。她和DAPI荧光量化使用ImageJ(版本1.32 j,http://imagej-1-32j.updatestar.com/)。过氧化物的相对水平估计从她/ DAPI荧光比率22]。的特异性试验测试使用过氧化物清道夫钛试剂。

2.8。NADPH氧化酶活动的分析

NADPH氧化酶的活性在糖尿病大鼠胸主动脉环控制,由lucigenin-enhanced化学发光分析化验如前所述[14]。短暂,主动脉环在HEPES-buffered孵化100解决方案(pH值7.4)μM NADPH补充道。五μM lucigenin添加,发光被记录在200秒内每隔5秒在光度计使用(贝特Lumat磅9507年,德国)。减去基底值后,相对发光单元(RLU) /分钟/毫克干组织被用来表达NADPH氧化酶活性。

2.9。统计分析

所有的数据进行了分析使用GraphPad棱镜5 (GraphPad软件、圣地亚哥、钙、美国)。结果表示为均值±SEM,比较了使用学生的t以及或单向方差分析Bonferroni紧随其后的事后分析。一个 值< 0.05被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。高葡萄糖增加Nrf2和HUVECs的目标基因

HUVECs孵化在HG介质24 h, Nrf2的表达,NQO-1, HO-1化验。HG诱导显著增加Nrf2 mRNA和蛋白的表达(图1)。同样,NQO-1和HO-1基因的表达以及蛋白显著增加HUVECs暴露于汞媒介相比,LG的代表人物之一2和3,分别。

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图1
PPAR的影响β/δ受体激动剂在Nrf2表达式。(c) mRNA和(b, d)蛋白表达的Nrf2 HUVECs暴露于低(5毫米,LG)或高葡萄糖(30毫米汞柱),24小时有或没有GW0742 (GW)或L165041 (L)单独或与PPAR preincubatedβ/δ拮抗剂GSK0660 (GSK)。信使rna数据作为任意单位的mRNA(2的比率−ΔΔCt)。所有的数据都意味着±SEM ( ),独立实验至少重复三次。蛋白质数据表现为光密度值和蛋白质带相应的规范化α肌动蛋白;乐队的代表 5。 而LG。 与汞柱。 分别与L和瓦列。
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图2
PPAR的影响β/δ受体激动剂,GW0742 Nrf2基因诱导目标。信使rna (a, b)和(c)蛋白表达NOQ-1 HO-1。HUVECs,暴露于低收入(LG)或high-glucose 24小时(HG)媒介,与GW0742 coincubated (GW)单独或与GSK0660 preincubated (GSK) GW0742紧随其后。信使rna数据作为任意单位的mRNA(2的比率−ΔΔCt)。所有的数据都意味着±SEM ( ),独立实验至少重复三次。蛋白质数据表现为光密度值和蛋白质带相应的规范化α肌动蛋白;乐队的代表 5。 和 而LG。 与汞柱。 与瓦列。
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图3
PPAR的影响β/δ受体激动剂,L165041 Nrf2目标基因。信使rna (a, b)和(c)蛋白表达NOQ-1 HO-1。HUVECs,暴露于低收入(LG)或high-glucose 24小时(HG)媒介,与L165041 coincubated (L)单独或与GSK0660 preincubated (GSK) L165041紧随其后。信使rna数据作为任意单位的mRNA(2的比率−ΔΔCt)。所有的数据都意味着±SEM ( ),独立实验至少重复三次。蛋白质数据表现为光密度值和蛋白质带相应的规范化α肌动蛋白;乐队的代表 5。 和 而LG。 和 与汞柱。 与L列。
3.2。PPAR的影响β/δ受体激动剂对高Glucose-Induced Nrf2及其目标基因的表达变化

HUVECs处理10−7和10−6M GW0742(图1(一))或L165041(图1 (c))24小时LG中显示Nrf2无意义的表达水平的变化。相反,coincubation PPARβ/δ受体激动剂下调Nrf2 mRNA(数字1(一)和1 (c))和蛋白质表达水平(数据1 (b)和1 (d))HG-induced HUVECs。Coincubation HUVECs的10−6米的PPARβ/δ拮抗剂GSK0660抑制PPAR施加的影响β/δ受体激动剂(图1)。

的PPARβ/δ受体激动剂并没有改变NQO-1 mRNA的表达和蛋白质在正常实验条件。high-glucose的媒介,然而,在HUVECs孵化NQO-1 mRNA和蛋白水平下降了GW0742(数字2(一个)和2 (c))或L165041(数字3(一个)和3 (c))。明显与GSK0660 Coincubation废除PPAR的效果β/δ受体激动剂在NQO-1表达,涉及PPARβ/δ激活。

相比之下,在两种情况下,孵化GW0742(数字2 (b)和2 (c))和L165041(数字3 (b)和3 (c))调节HO-1的表达效果与GSK0660 coincubation废除的。

PPARβ/δNrf2信号差别全身对这些证实了PPAR的差别siRNA-based对这些β/δ。与PPAR HUVECs转染β/δ的特殊核显示显著抑制GW0742-induced upregulation Nrf2(图4(一))和NQO-1(图4 (b)high-glucose条件下),而HO-1被废除的表达在两种情况下(图4 (c))。

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图4
PPAR的角色β/δ激活Nrf2 /通路。信使rna表达水平(a) Nrf2, NOQ-1 (b)和(c)在控制核和siRNA PPAR HO-1β/δ细胞培养在低收入(LG)或high-glucose 24 h (HG)中,存在与否的GW0742 (GW, 10−6米)。信使rna数据作为任意单位的mRNA(2的比率−ΔΔCt)。所有的数据都意味着±SEM ( ),独立实验至少重复三次。 而LG。 和 与汞柱。
3.3。PPAR的影响β/δ受体激动剂对细胞内活性氧的生产

氧化应激引起的高血糖据报道在内皮细胞(20.]。因此,我们观察到更高水平的ROS 30 mM的葡萄糖而引起的基线条件(5毫米的葡萄糖)(图5(一个))。的PPARβ/δ受体激动剂L165041 (10−6M)废除ROS high-glucose条件下生产,表明其保护潜在的活性物种的一代。此外,coincubation PPARβ/δ与GSK0660或PPAR激动剂β/δ小干扰rna抑制其特殊功效抑制高glucose-induced ROS生产过剩(图5(一个))。

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图5
PPAR的影响β/δ受体激动剂在细胞内ROS生产。(一)ROS和(罪犯)mRNA的表达水平NOX-4 (b), NOX-1 (c)和NOX-2 (d)在HUVEC PPAR转染β/δ特殊核核PPARβ/δ)在低收入(LG)或high-glucose孵化24小时(HG)介质的存在与否L165041 (L, 10−6米)或GW0742 (GW, 10−6米)。GSK0660 (10−6米)添加与L165041孵化前30分钟。信使rna数据作为任意单位的mRNA(2的比率−ΔΔCt)。所有的数据都意味着±SEM ( ),独立实验至少重复三次。 而LG。 和 与汞柱。

HUVECs high-glucose条件下,显示明显调节mRNA NOX-4丰富(图5 (b))和NOX-2(图5 (d)),而NOX-1的表达没有明显影响(图5 (c))。

在实验低条件,HUVECs的coincubation GW0742下调mRNA大量NOX-4(图5 (b));这似乎与差别NOX-4对这些能力提升HO-1表达的基因和蛋白质表达基因PPAR的目标β/δ。有趣的是,潜在的GW0742抑制mRNA的增加引起的大量NOX-4和NOX-2高葡萄糖被PPAR的差别siRNA-mediated对这些钝化β/δ(数据5 (b)和5 (d))。

3.4。GW0742对血糖控制和糖尿病大鼠

STZ糖尿病大鼠显示高血糖所反映的空腹血糖水平显著升高,与对照组相比。在这两个实验小组,长期GW0742政府并没有改变葡萄糖(图的水平6),这表明PPAR的保护作用β/δ受体激动剂是glucose-independent。


图6
GW0742对血糖控制和糖尿病大鼠。通过比色法测定血浆葡萄糖浓度。值表示为±SEM的意思 -10只老鼠。 老鼠,糖尿病与控制。
3.5。影响口服GW0742 Nrf2通路在糖尿病大鼠的主动脉

STZ糖尿病大鼠主动脉显示在Nrf2显著增加(图7(一)),NQO-1(图7(b)), HO-1(图7(c)) mRNA表达和控制老鼠。慢性治疗GW0742下调Nrf2 NQO-1在糖尿病大鼠的主动脉虽然对正常大鼠主动脉显示没有影响。然而,类似在体外结果,HO-1 mRNA丰度较高的血管壁控制——diabetic-treated老鼠(图7(c))。

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图7
影响口服GW0742 Nrf2通路在糖尿病大鼠的主动脉。Nrf2 mRNA的表达(a)、(b) NQO-1, (c) HO-1主动脉的所有实验群体。数据提出了任意单位的信使rna(2的比率−∆∆Ct)。结果显示为±SEM -10只老鼠。 ,糖尿病患者与对照组。 ,GW0472-treated糖尿病与参与糖尿病大鼠。
3.6。GW0742减少血管ROS和NADPH氧化酶活性

评估在hyperglycemia-provoked GW0742氧化应激的影响,从所有实验组主动脉环沾染了她和NADPH氧化酶活性的决心。染色显示增加超氧化物水平在糖尿病大鼠的主动脉中描述的数据8(一个)和8 (b)。在相同的情况下,糖尿病大鼠的主动脉显示显著增加NADPH氧化酶活性(图8 (c))。虽然在正常大鼠施加任何影响,GW0742抑制ROS水平和NADPH氧化酶STZ糖尿病大鼠的主动脉。

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图8
GW0742减少血管ROS和NADPH氧化酶活性。(a)的左面板显示蓝色荧光核DAPI染色(×400放大),动脉和右面板显示在她面前孵化生产红色荧光当氧化ethidium ROS。(b)的平均价值,意味着±SEM ( -10环从不同的老鼠),红色ethidium荧光规范化的蓝色DAPI荧光。(c) NADPH氧化酶活动衡量lucigenin-enhanced化学发光( -10)。 和 ,糖尿病患者与对照组。 和 ,GW0472-treated糖尿病与参与糖尿病大鼠。

4所示。讨论

氧化应激是艾德的主要原因,此前在糖尿病与心血管并发症(4]。在此,我们提供PPAR的第一个证据β/δ受体激动剂可以间接表达下调Nrf2通路通过抑制HG-induced活性氧积累在血管壁。鉴于血管疾病活性氧的作用,我们的研究表明一个PPAR的潜在治疗作用β/δ在糖尿病血管并发症。

高血糖糖尿病血管病变的作用已经盛典。虽然血管内皮自适应机制来抵消高血糖诱导的氧化应激,多余的活性氧水平诱导内皮功能障碍。在内皮细胞,增加超氧化物生成代表hyperglycemia-mediated氧化应激的标志(23]。因此,HUVECs暴露于汞和STZ糖尿病大鼠的主动脉显示明显的活性氧水平升高。这些发现解释为增加NADPH氧化酶的活动代表超氧化物高血糖的条件下生产的主要来源(17,24]。这里,HUVECs显示增加NOX-4表达式后暴露于汞水平。NOX-4是著名的和主要的NADPH氧化酶亚基的一代超氧化物阴离子引发内皮细胞(25,26]。因此,NOX-4可以诱导氧化损伤(27)和内皮损伤(28细胞应激反应。先前的研究也证明了增加NADPH氧化酶在糖尿病动物(9,26)和人类患者(29日]。此外,ROS水平的增加可能是由于高血糖诱导以挪士解偶联、线粒体电子传递链之前证明(30.- - - - - -32]。有趣的是,一个功能性NOX-4报道出现在线粒体(33]。制备的纯线粒体,击倒的NOX-4 siRNA阻塞引起的线粒体超氧化物生成葡萄糖(33]。此外,实验证据表明,遗传击倒或抑制NOX-4降低血管内皮(ROS生产27,34]。随着调节NOX-4, HG-induced HUVECs显示NOX-2表达的增加,一个NADPH氧化酶亚基表达在大量HUVECs以及大鼠主动脉内皮细胞(26]。

GW0742抑制NADPH氧化酶活性和NOX-4感应和防止氧化应激,表明PPAR的抗氧化作用β/δ激活相关的抑制影响NOX-4汞引起的激活水平。因为药物抑制和PPAR击倒β/δ废除了抑制GW0742对氮氧化物的影响表达式和活性氧生成,我们的结果指向PPAR的特定的抑制作用β/δ激活HG-induced氧化应激。这些发现被证实在活的有机体内在治疗GW0742废除过氧化物的生成和减少NADPH氧化酶STZ糖尿病大鼠的主动脉。因此,PPARβ/δ全身抑制NOX-4可以显著提高血管的完整性,防止损伤在糖尿病。因此,结果从实验动物模型STZ -和HFD-induced糖尿病治疗GW0742 [12,14支持添加到我们的发现。通过激活PPAR的能力β/δ,GW0742显著抑制NADPH氧化酶活性以及其亚基的表达,p47phox p22phox,导致减少过氧化物水平在糖尿病动脉(12,14]。

PPAR的长期管理β/δ受体激动剂并没有降低STZ糖尿病大鼠的血糖水平,表明其有益血管效应是独立的血糖状态。因此,我们调查的可能作用Nrf2 /是/抗氧化信号。在糖尿病、激活Nrf2是一种自适应机制,保护内皮。这个概念是由几个支持在体外和在活的有机体内研究。牛主动脉内皮细胞,激活Nrf2路径代表一种防御机制对先进的糖化结束产品导致的氧化损伤(35和高血糖32]。一致的研究结果阐明了Ungvari et al。20.在冠状动脉内皮细胞的自适应感应Nrf2防止高血糖的有害影响。在Nrf2 (+ / +)小鼠,HFD喂养引起增加HO-1 mRNA的表达而不是Nrf2 (−−/)的老鼠20.]。此外,HFD-fed Nrf2 (−−/)老鼠增加血管ROS水平和减少血管反应性相比Nrf2 (+ / +)老鼠收到相同的HFD,证实Nrf2作为一种自适应机制的作用,以抵消糖尿病危害内皮功能障碍(20.]。在我们的在体外高血糖模型,HUVECs展出调节基因和蛋白质表达的Nrf2 NQO-1表达的增加和HO-1,支持添加到先前的结果。同样,糖尿病大鼠显示调节主动脉Nrf2, NQO-1, HO-1。结合Nrf2激活信号,糖尿病大鼠的主动脉展出过氧化物水平和NADPH氧化酶活性增加。ROS产生的氮氧化物活动可以激活Nrf2 [36,37),因此氮氧化物防御机制提供了一个反馈抵消氧化应激(38]。在相同的情况下,啤酒等。39]表明NOX-4潜在的作用在调节心肌细胞的氧化还原状态在活的有机体内通过激活Nrf2通路。

在我们的在体外和在活的有机体内高血糖模型,PPARβ/δ激活显著降低Nrf2和NQO-1表达,而移植HO-1。这些结果证实了研究结果的阿里et al。40),他的作用进行了探讨HO-1调停vasculoprotective PPAR的功效β/δ和它共激活剂PGC1α针对oxidant-induced受伤。它因此可以建议PPARβ/δ受体激动剂诱导HO-1 Nrf2-pathway的独立。HO-1被建议作为一种保护性因子对血管氧化应激和炎症(41),其基因的多态性催化剂与血管疾病(41,42]。因此,GW0742-induced upregulation所观察到的HO-1 PPAR的抗氧化潜力β/δ。此外,通过PPAR NADPH氧化酶的活性下降β/δ激活我们的实验模型的差别可能与对这些Nrf2 NQO-1。GW0742施加显著影响表达式HO-1相比,l - 165041。这是解释为GW0742是高亲和性PPAR的事实β/δ激动剂虽然l - 165041是一个非选择性。

总之,本研究显示,PPAR的第一次β/δ激活授予血管防止氧化应激在糖尿病通过直接诱导HO-1 NOX-4,差别和对这些基因在较小程度上,NOX-2。此外,结果表明,独立于血糖状态,PPAR的激活β/δ减少ROS水平、NADPH氧化酶活性和表达Nrf2 NQO-1。这项研究强调了PPAR的潜力β/δ受体激动剂作为新的治疗方法以减少血管并发症的糖尿病。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

这项工作是支持由Ministerio de隐藏y Competitividad和洋底Europeo de Desarrollo区域(菲德尔)(saf2010 - 22066 - co2 - 01, saf2010 - 22066 - co2 - 02, saf2011 - 28150, saf2014 - 55523 r),军政府的安达卢西亚(四面八方de excelencia p12 - cts - 2722),和皇家研究院祝您健康卡洛斯三世(RIC RD12/0042/0011),西班牙。