文摘

在代谢疾病,增加活性氧(ROS)代表一个血管疾病的致病机制可能通过促进血管平滑肌细胞(SMC)增殖导致动脉重塑和狭窄的发展,高血压和动脉粥样硬化。因此,这项工作进行评估的参与活性氧的线粒体NADPH氧化酶和从主动脉smc模型扩散引起的代谢综合征蔗糖喂养的老鼠。24周后,sucrose-fed (SF)大鼠高血压发展,腹内的肥胖、高胰岛素血,hyperleptinemia。除了从科幻老鼠有一个较高的增长率和smc比控制细胞产生更多的活性氧。治疗smc DPI和apocynin抑制NADPH氧化酶和tempol显著清除超氧化物阴离子阻塞科幻和控制细胞的增殖暗示NADPH氧化酶的参与作为一个超氧化物阴离子的来源。MitoTEMPO目标细胞内的线粒体,也显著地抑制smc的扩散对细胞产生更大的影响比从控制主动脉科幻。更高的利率支持细胞生长的科幻主动脉还有内容的增加和CD147蛋白参与细胞增殖的机制。此外,caldesmon,α肌动蛋白和肌球蛋白轻链磷酸化,收缩表型蛋白,被发现在科幻细胞没有明显降低汇合的状态和增加在汇合的状态但是没有区别这两种细胞类型。我们的研究结果表明,线粒体ROS NADPH氧化酶和显著的参与中发现的差异率科幻和控制细胞之间的细胞生长。

1。介绍

血管平滑肌细胞(smc)在生理条件下呈现出分化收缩/静表型,以相当低的扩散范围和较低的细胞外基质的合成活动和信号分子的表达细胞收缩功能(1,2]。SMC增殖表型可能以减少收缩蛋白等内容α肌动蛋白、肌球蛋白轻链磷酸化和caldesmon和细胞外基质蛋白的增加产量导致动脉狭窄的发展,动脉重塑,高血压和动脉粥样硬化等疾病(3- - - - - -5]。在心血管组织分化等生理过程,增殖和凋亡涉及ROS生成。线粒体和NADPH氧化酶是活性氧的主要来源在心血管组织和参与不同的生理和病理过程的强度取决于ROS生成(6- - - - - -9]。在生理条件下,ROS水平被发现在一个稳定的状态被定义为ROS的生成和消除。在病理条件下,稳态ROS浓度是暂时性的还是长期增加,导致intermediate-intensity氧化应激或高强度氧化应激与细胞代谢改变有关或与细胞组件损坏允许细胞死亡的凋亡或坏死(10- - - - - -13]。在intermediate-intensity氧化应激,ROS描述扮演一个角色作为第二信使来影响信号转导和重新编程的细胞功能移植抗氧化酶的表达和特定基因的细胞增殖13]。事实上,它描述了ROS-induced血管SMC增殖是由还有的分泌(CyPA)行为通过其受体CD147和激活JAK-ERK1/2-Akt信号通路来增强DNA生物合成和SMC(扩散7,14,15]。这种机制的ROS-induced氧化应激和SMC增殖可能被视为一种机制参与心血管疾病的发展代谢疾病,如腹部肥胖,胰岛素抵抗和高血压(16,17]。众所周知,肥胖促进几个因素,如细胞因子的释放和lipotoxic游离脂肪酸(远期运费协议)进行交互,并积累在细胞中,影响线粒体功能和NADPH氧化酶活性增加活性氧生成(18- - - - - -21]。在这种背景下,ROS通过增强细胞功能障碍和改变血管SMC表型和细胞环境可能导致的激活机制,促进血管SMC增殖和迁移或死亡。因此,SMC增殖的研究模型,腹腔肥胖引起蔗糖喂食,在哪里NADPH氧化酶活性和氧化应激标志物被发现在维管组织,增加极大的兴趣阐明代谢综合征(MS)的机制诱导心血管疾病和涉及的参与活性氧生成。此外,模型开发胰岛素抵抗、高血压和血管反应性改变通过增加血管收缩反应苯肾上腺素和血管舒张反应降低乙酰胆碱(22),这使它有用的调查SMC增殖的机制是心血管疾病的危险因素代谢疾病的发展。因此,使用从主动脉SMC提取的模型来阐明ROS对SMC增殖的机制及其收缩蛋白的改变在体外代表了一个相关的方法来理解在活的有机体内ROS的行动。此外,没有数据对SMC的行为在这个模型中蔗糖和腹部肥胖诱导的线粒体的参与或NADPH氧化酶在ROS生成和SMC增殖。NADPH氧化酶,线粒体是视为活性氧的主要来源,如超氧化物阴离子(O₂^⋅−)泄漏所产生的电子从呼吸配合物的氧化还原中心我和III分子氧(23]。在这个模型中蔗糖的饮食引起的肥胖,我们也报道了一些代谢改变,如高循环FFA和氧化应激与肝脏线粒体ROS生成(24]。因此,本研究的目的是调查的参与线粒体NADPH氧化酶和来源的活性氧对SMC增殖,收缩表型的蛋白质,细胞信号模型中涉及CyPA中央高蔗糖饮食引起的肥胖。

2。材料和方法

2.1。实验动物

刚断奶的雄性Wistar鼠体重55±5克。动物获得的动物设施心脏病研究所伊格纳西奥·查韦斯,根据美国国立卫生研究院的处理指导实验室动物保健和使用的。动物被分成6组大鼠:对照组(C)收到固体食物(实验室5001年饮食配方,Ralston Purina Corp .),圣路易斯,密苏里州)和水随意。sucrose-fed (SF)组收到蔗糖溶液(精制糖)在30%的饮用水和相同的固体食物随意。24周的治疗后,大鼠禁食过夜,第二天他们牺牲了颈椎错位。蔗糖治疗24周后,收缩压和舒张压测量如前所述[25]。

2.2。瘦素、胰岛素、FFA、TG和葡萄糖

从腹主动脉血液收集到含有抗凝管(0.1% EDTA)和立即离心机在600 g×20分钟在4°C。等离子体从而获得,0.005%的丁羟甲苯(二叔丁基对甲酚)作为一种抗氧化剂和添加混合存储在−70°C到分析。远期运费协议气相色谱法测定如前所述[25),根据获得的方法Folch et al。26]。TG血浆浓度根据Nagele描述的方法测定et al。27]。血糖、血浆胰岛素和瘦素被放射免疫检定法测量使用标准的商业工具(Linco研究)。腹腔脂肪在肾脏和解剖腹膜后腔和立即重。内脏和十二指肠脂肪并不包括在这个过程中。

2.3。主要SMC文化

在无菌条件下从主动脉smc得到。主动脉马上被收集并放置在一个缓冲区包含140毫米氯化钠,氯化钾4.7毫米,1.2毫米Na₂HPO₄,2.4毫米MgSO₄2毫米CaCl₂0.02毫米,5.6毫米葡萄糖,EDTA, 25毫米的玫瑰,pH值7.4和脂肪了。在第一步,脱脂主动脉孵化1毫克/毫升的胶原酶II型(125 U / mg活动,Gibco) 20分钟把动脉外膜平滑肌(成纤维细胞)。第二步包括孵化主动脉没有动脉外膜为40分钟10毫米木瓜蛋白酶(30 U / mg活动,罗氏)分解细胞。随后,获得的悬挂过滤是一个230年μ米孔筛(组织磨床工具包,σ)和播种在25厘米²细胞培养瓶(康宁)D-MEM / F-12培养基(Gibco)补充10%胎牛血清(的边后卫)(Gibco)灭活56°C为30分钟。smc种植在37°C和5%的二氧化碳和90%的湿度。当细胞达到融合性的状态,他们接受0.25% trypsin-EDTA (Gibco)然后在75厘米²细胞培养瓶,在上述相同的培养基5]。

当细胞达到75厘米的融合性的状态²烧瓶,他们接受0.25% trypsin-EDTA (Gibco)然后在多井细胞培养板(24井)在每口井的8000个细胞中含有10%的边后卫和媒介是24小时更新一次。洗后,smc终于固定在不同的时间0,24日,48岁,72年、96年和120年h和绝对乙醇DNA量来确定。DNA决定根据Brunk等的修改方法。284)使用 ,6- - - - - -diamidino2 -phenylindole (DAPI)作为荧光探针在360 nm(激发波长)和450 nm(发射波长)使用珀金埃尔默LS50B荧光谱仪。细胞固定在乙醇处理0.150毫升氢氧化钠(1 N)和1.35毫升0.15 Na₂HPO₄包含DAPI 0.5的最终浓度μm .进一步评估的DNA样本,进行曲线与DNA提取鲑鱼(σ)的浓度的斯托克城的解决方案是调整NanoDrop(热科学)。

2.4。SMC ROS生成

细胞生长在盖玻片处理poly-L-lysine (0.1%)。一旦细胞附着,他们preincubated 5μ米2 ,7diclorodihidrofluorescein二乙酸(DCF-DA) 15分钟,然后用PBS以去除多余的贴现。细胞被洗了再用PBS和安装在与甘油的幻灯片。共焦显微镜的氧化DCF检测。

2.5。线粒体活性氧的来源

smc与MitoSOX(5孵化μ米),持续15分钟。MitoSOX积累在线粒体和它发出红色荧光选择性氧化的超氧化物阴离子。然后,细胞与1%多聚甲醛固定在4°C 30分钟。最后,细胞被安装在盖玻片与甘油通过共焦显微镜分析。

2.6。ROS参与SMC增殖

smc被播种在同等条件下在24多井盘子没有和上面描述的hydroxy-TEMPO (tempol)和MitoTEMPO,超氧化物阴离子拾荒者,在胞质和线粒体,分别在diphenyleneiodonium氯的存在(DPI)和apocynin (APO), NADPH氧化酶抑制剂。所有抑制剂在不同浓度进行了测试,从1到10μ72和120 h评估ROS参与细胞增殖和活性氧的来源是导致这一过程。

2.7。收缩表型蛋白标记

蛋白质提取从smc增殖的两个州:在指数增长状态(72 h)和融合性的状态(120 h)。实验结束时在不同的条件下,细胞收获和细胞溶解在缓冲区包含25毫米消息灵通的,0.1 M氯化钠,15毫米咪唑、10%甘油、1% Triton x - 100,蛋白酶抑制剂(115毫米phenylmethylsulfonyl氟化物(PMSF),亮抑酶肽2毫米,1.5毫米抑肽酶、抑肽素和3毫米),和antiphosphatases(0.2毫米原钒酸盐、50 mM氟化钠)。

悬浮培养30分钟在4°C。孵化期结束时,样本离心机在8000 g×10分钟在4°C去除细胞碎片。匀浆蛋白水平量化使用布拉德福德的方法(29日]。每个样本收集的二百毫克的蛋白质,悬浮在25μl(缓冲负载包含125毫米Tris-HCl (pH值6.8),20%甘油、4% SDS, 2-mercaptoethanol 10%,和0.004%溴酚蓝,完成50μl Laemmli解决方案(40毫米三、1% SDS和1%β巯基乙醇)。

每个样本加载八十毫克的蛋白质sds - page凝胶中丙烯酰胺的比例取决于蛋白质的分析。电泳运行3 h在120 V。蛋白质转移到硝化纤维素膜(孔隙大小0.22执行μm, Bio-Rad) 350毫安caldesmon 60分钟,CD147, 45分钟α肌动蛋白,为磷酸化ERK 1/2 GAPDH和35分钟肌球蛋白轻链和CyPA商会半干的转移(Bio-Rad Trans-Blot SD)。非特异性蛋白检测减少了阻塞膜与TBS(25毫米三基地,150毫米氯化钠)含5%脱脂牛奶和0.1%渐变20。然后,膜与单克隆抗体孵化anti-caldesmon (Abcam, 1: 20000), anti-alpha肌动蛋白(Abcam, 1: 300), antiphosphorylated肌球蛋白轻链(p-MLC) (Abcam, 1: 1000), anti-CyPA (Abcam 1: 500), anti-CD147 (Abcam, 1: 2000),反GAPDH (Abcam, 1: 10000), anti-ERK 1/2 (GeneTex, 1: 1000)和anti-beta肌动蛋白负荷控制(Novusbio, 1: 10000)。二次抗体使用过氧化物酶共轭。蛋白质是由化学发光试剂显示(止动剂、微孔),和膜暴露在射线照相板(以下,柯达)5分钟。成像系统的图像扫描GelDoc-It (UVP Inc .)、高地、钙、美国)。乐队由UVP图像分析仪进行了分析和光学密度与VisionWorks LS夺得评估软件(UVP Inc .)、高地、钙、美国)。

2.8。统计分析

统计分析了使用SigmaPlot程序(版本11)。数据提出了均值+ SE(标准误差)。实验不同的数量不同的实验的类型( 8)。单向方差分析是用于比较不同组的数据。组时被认为是显著的区别 。

3所示。结果

3.1。一般特征的动物

治疗24周的老鼠与蔗糖饮食诱导显著增加心率和舒张压和收缩压( )。此外,甘油三酯,FFA、胰岛素和瘦素在血浆和腹腔脂肪组织被发现在科幻大鼠( )。另一方面,总胆固醇和血糖和体重的分析显示两组之间没有显著差异。胆固醇与高密度脂蛋白显著降低在旧金山召开的动物( )(表1)。

3.2。平滑肌细胞增殖

图1表明,DNA的数量对应于smc的科幻大鼠显著增加在时间与控制细胞生长的细胞,在任何时候( )。后24、48、72、96和120 h的细胞播种、DNA量对应smc科幻动物增加了18%,55%,40%,89%,和95%,分别比smc从控制动物。DNA随着时间的增加反映了一个更大的smc增殖孤立从科幻模型相比,从控制动物。

为了阐明ROS生成参与SMC增殖,几种抑制剂的细胞内活性氧的来源。Apocynin (APO)和DPI被用作抑制剂或NADPH氧化酶(图2),而tempol被用作超氧化物阴离子清道夫。此外,MitoTEMPO超氧化物自由基清除剂在线粒体层面,被用来阐明线粒体参与ROS-induced细胞增殖(图3)。

DPI在5μ观察M, proliferation-blocking效果32% 72年科幻细胞h(图2(一个))。在120 h, 5和10μM, DPI减少细胞内DNA从科幻控制动物(分别为70%和40%)。对于apocynin,图2 (b)显示从科幻主动脉smc的扩散被45%至120 h。smc与tempol孵化时,显著抑制细胞生长( )观察到72和120小时70%控制smc和65%科幻细胞(图3(a))。当smc线粒体与MitoTEMPO孵化,选择性地目标,观察更大的抑制作用从科幻主动脉smc增殖的孤立和70%的控制smc 30%(图3(b))。smc从科幻老鼠更敏感proliferation-inhibiting MitoTEMPO效果比控制细胞在72年和120 h的文化。

3.3。平滑肌细胞ROS生成

MitoSOX和DCF ROS探针,用于监视在线粒体ROS生成,细胞壁的水平,分别。图4显示显著增加( )科幻的DCF荧光细胞46%相比,控制细胞。从smc在线粒体水平评估ROS生成,MitoSOX, fluorogenic染料专门针对线粒体,使用。由过氧化物氧化时发出红色荧光。在显微镜的图像(图5),控制和科幻小说主要培养smc没有MitoSOX内在发出荧光。细胞与MitoSOX孵化时,荧光强度是48%更强烈的细胞从科幻模型相比,从控制动物( )。

3.4。分析,还有,还有受体(CD147)和ERK-1/2

图6还有节目的表达的内容在科幻nonconfluent条件下高28%细胞相比,控制细胞。当细胞达到融合,这种蛋白质的内容在科幻和控制细胞增加了32%和40%,分别比nonconfluent控制和科幻的细胞。然而,两种细胞类型之间的区别是迷失在汇合的状态。

关于CD147在nonconfluent条件下,显著增加( )在科幻细胞观察控制细胞相比,但在融合性的状态,这种蛋白质的含量是提高细胞类型和科幻之间没有区别和控制细胞(图6)。

对ERK 1/2,内容是一样的科幻和控制细胞(图nonconfluent条件和融合性的条件6)。

3.5。收缩表型蛋白

smc都表现为几个收缩表型的表达蛋白质,如caldesmon、α肌动蛋白和肌球蛋白轻链磷酸化(p-MLC)。他们的丰度可能依赖于细胞生长状态。因此,nonconfluent (72 h)和支流(120 h)生长条件进行测试来评估这些蛋白的表达。图7显示的内容caldesmon较低的条件下nonconfluence相比,融合性的状态,在这两种细胞类型。介绍过o。d。邓肯此外,对应caldesmon乐队在72 h水平显著降低控制相比,从科幻主动脉smc细胞( )。失去了科幻和控制细胞间的这种差异在120 h。关于α介绍过o。d。邓肯肌动蛋白含量,分析显示显著增加其内容在细胞融合与日益增长的国家(72 h)和科幻之间没有差异观察和C细胞(图7)。的内容p-MLC nonconfluent状态显著低于smc从科幻小说相比,控制大鼠( )。在汇合的状态,p-MLC是反向的分布和p-MLC显示增强smc的科幻动物相比,控制细胞(图7)。GAPDH倾向于更低的控制和科幻nonconfluent细胞状态与融合性的细胞。此外,GAPDH内容增加在科幻的孤立的smc模型(图融合性的条件7)。

4所示。讨论

本研究探讨内源性活性氧的作用进行收缩和增生性的smc表型隔绝科幻模型,因为据报道,高蔗糖的饮食增加活性氧的生成在不同的组织包括维管组织24,30.]。smc的增殖和迁移是病理生理过程反应条件如代谢综合征与高血糖和高脂血症,高血压,糖尿病31日]。所有这些病理改变特点是氧化应激由于稳态ROS浓度提高。当基底的ROS浓度增加和超过抗氧化防御,它还可以诱导细胞内氧化还原状态的改变修改谷胱甘肽(GSSG和NAD (P) / NAD (P) H参与信号蛋白之间的相互作用(对接)和激活或抑郁的几种蛋白参与细胞增殖和细胞死亡13,32]。蔗糖喂养引起的代谢变化的结果,如高脂肪组织,高甘油三酯血症,hyperleptinemia,和高胰岛素血与舒张压和收缩压和心率增加,可能导致活性氧的生成(33]。ROS参与细胞增殖是孵化描写就是细胞不同的食腐动物和抑制剂活性氧的来源。NADPH氧化酶的抑制剂,DPI行为差异从APO和减少DNA的数量在科幻小说和控制细胞在72和120 h,对科幻细胞产生更大影响,表明细胞溶解的效果。除了广泛使用作为NADPH氧化酶的抑制剂,DPI报道抑制其他重要的酶如NADPH泛醌氧化还原酶、一氧化氮合酶、黄嘌呤氧化酶、NADPH细胞色素P450氧化还原酶、胆碱酯酶可能参与细胞生存(34]。Apocynin不过是特定的NADPH氧化酶抑制剂35]。它更具体通过抑制的p67phox p47phox协会和gp91phox NADPH氧化酶亚基,而不影响其他蛋白质细胞生存(这可能是至关重要的36,37]。在我们的工作,它大大块细胞生长没有导致科幻DNA浓度下降表明没有细胞溶解的效果和NADPH氧化酶参与从科幻主动脉smc的扩散。关于使用tempol超氧化物阴离子的选择性清除剂和渗透生物膜(38),结果显示生成的超氧化物阴离子参与各级如NADPH氧化酶和线粒体。

线粒体与tempol MitoTEMPO选择性目标由于其化学结构有三苯基磷作为一种亲脂性的阳离子基团(39];它对科幻小说的选择性抑制作用细胞增殖表明超氧化物自由基生成在线粒体水平也起着非常重要的作用在从科幻老鼠smc的扩散。的确,在线粒体ROS生成的实验水平,使用MitoSOX积累在线粒体和超氧化物阴离子反应特别,表明增加超氧化物阴离子生成由smc隔绝科幻老鼠相比,控制细胞。

在先前的研究中,从动物的肝脏线粒体孤立蔗糖饮食生成活性氧可能在高速率由于脂质代谢改变如TG、FFA发现增加在科幻大鼠(24]。从科幻主动脉smc, ROS可能生长因子的调制信号,通过调节转录因子控制与增殖相关基因的表达(8,40]。SMC增殖与活性氧释放被描述与一些蛋白质的分泌SOFX(分泌氧化应激因素),其中CyPA。CyPA分泌涉及许多蛋白质,参与细胞骨架重塑过程和在CyPA分泌囊泡的形成需要41]。CyPA在绑定的CD147受体在从科幻主动脉smc可能刺激杰克/ Akt ERK1/2途径和促进细胞增殖7,42]。

在这部作品中,大量的CyPA发现高从科幻模型分离出细胞生长状态(nonconfluent)表明CyPA可用性的增加被分泌出细胞与CD147还发现增加诱导ERK1/2表达式和活动参与DNA生物合成。ROS在CyPA表达和分泌的直接参与并没有解决。然而,阻止细胞增殖通过抑制ROS生成在线粒体和NADPH氧化酶建议进一步的实验证据表明活性氧参与CyPA CD147和ERK1/2表达活动及其与细胞增殖的关系。事实上,增加CyPA表达和分泌被描述为被抗氧化剂Nox1-transfected细胞(14]。

对SMC收缩表型特征等蛋白质的表达α肌动蛋白、caldesmon和磷酸化肌球蛋白轻链(43- - - - - -45),我们的研究结果表明,smc因此损失了部分收缩表型在生长状态(非支流),当细胞达到融合性的状态,他们完全恢复收缩表型。这些结果表明,该方法使用木瓜蛋白酶酶分散的大鼠主动脉smc保持细胞收缩表型。然而,caldesmon的低含量和p-MLC nonconfluent科幻细胞可能与减少收缩表型的科幻主动脉smc,更高的ROS生成和lipotoxicity在旧金山召开的动物。增加的发现p-MLC汇合的smc孤立的状态从科幻小说可能与增加血管收缩中发现主动脉环和相关特征科幻的高血压大鼠(46,47]。

总之,smc从科幻模型有更高的扩散范围由于更高的一代超氧化物阴离子的NADPH氧化酶和线粒体。此外,ROS可能倾向于表达和分泌的还有可能通过其CD147受体促进科幻SMC增殖,减少收缩表型蛋白。由于活性氧参与细胞增殖的发现表明实施的策略使用ROS生成抑制剂控制SMC增殖在旧金山召开的老鼠。

缩写

7月:	Apocynin
二叔丁基对甲酚:	丁羟甲苯
包:	Caldesmon
C:	控制
CyPA:	还有
DAPI:	4 ,6- - - - - -Diamidino- - - - - -2- - - - - -phenylindole
DCF-DA:	2 ,7 - - - - - -Dichlorodihydrofluorescein二乙酸
DPI:	Diphenyleneiodonium氯
远期运费协议:	游离脂肪酸
的边后卫:	胎牛血清
NADPH:	烟酰胺腺嘌呤二核苷酸2 - - - - - -磷酸减少
女士:	代谢综合征
PMSF:	Phenylmethylsulfonyl氟化
p-MLC:	磷酸化肌球蛋白轻链
ROS:	活性氧
smc:	平滑肌细胞
科幻小说:	Sucrose-fed
Tempol:	4-Hydroxy-2 2 6 6-tetramethylpiperidine 1-oxyl
TG:	甘油三酯。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

本研究支持的CONACYT(没有奖学金。284105年Ocarol洛佩兹Acosta)博士学位大都会自治大学的生物科学和健康,Iztapalapa (UAM-I)。这项工作的部分也支持由CONACYT(批准号185450)和科学和技术研究所的联邦地区,墨西哥城(ICyTDF),墨西哥(批准号picds08 - 67)。