抗氧化活动和修复受损HK-2影响氧化细胞的茶多糖分子量不同

文摘

本研究旨在调查绿茶多糖的抗氧化活性和修复效果(TPS)与不同分子量(Mw)人类肾脏近端小管上皮细胞受损(HK-2)。氢氧自由基清除活动(^⋅哦)和abt激进和还原能力的四种TPS 10.88兆瓦(TPS0), 8.16 (TPS1), 4.82 (TPS2)和2.31 kDa (TPS3)被发现。受损的细胞模型建立了使用2.6更易与草酸/ L伤害HK-2细胞。然后,不同浓度的支持被用来修复受损细胞。指数变化的亚细胞细胞器HK-2细胞被发现之前和之后的修复。四种TPSs具有自由基清除活性和还原能力,其中TPS2中等Mw最强的抗氧化活性。修复后,细胞形态学HK-2受损细胞逐渐恢复到正常状况。活性氧产量减少,线粒体膜电位(Δψ米)修复细胞的增加。细胞G1期逮捕被抑制,S期细胞比例增加。溶酶体完整性改善和修复组细胞凋亡率显著降低。显示的四种TPSs不同Mw对线粒体的抗氧化活性和修复作用,溶酶体和细胞内DNA。TPS2温和兆瓦,显示最强的抗氧化活性和修复效果;它可能成为一个潜在的药物预防和治疗肾结石。

1。介绍

茶起源于中国具有4000多年的悠久历史;也是亚洲最受欢迎的非酒精性饮料和普通食物成分(1]。茶多糖(TPS)是一种酸从茶叶中提取的多糖(2]。TPS显示抗氧化剂,降糖,降血脂,降压,免疫、抗肿瘤、抗凝、防护效果(3]。陈等人。4)已经证实,TPS隔绝绿茶体现超氧化物自由基的清除活性,羟基自由基(^⋅哦),体外脂质自由基。TPS发挥保护作用对抗氧化应激引起的细胞损伤。

许多研究表明,茶多酚抑制影响草酸钙尿石病由于其抗氧化作用[5,6]。茶多酚减少骨桥蛋白表达和细胞凋亡,增加大鼠肾组织超氧化物歧化酶活性,从而抑制草酸钙结石的形成(5]。通过酚羟基多酚主要作为抗氧化剂。相比之下,不仅TPSs含有羟基,羧基团体也更多。绑定羧基组钙离子的能力明显高于羟基(7),所以它有一个更好的潜在抑制结石的形成。同时,植物多糖的结构类似于粘多糖(呕吐),这是很强的草酸钙晶体的生长和聚合抑制剂体外(8]。研究表明,半合成多糖更有效预防晶胞的相互作用比笑话(9]。

TPS的分子量(Mw)和结构与茶相关物种和净化10,11]。陈等人。12透露,从绿茶中提取的TPS,兆瓦的120 kDa,由阿拉伯糖、核糖、木糖、葡萄糖、半乳糖,糖醛酸,摩尔比为1.00:0.77:2.65:0.88:0.42:2.13。王等人。13]从绿茶中提取的水溶性多糖(7佤邦),平均7.1×10 Mw⁴哒。7佤邦主要含有阿拉伯糖和半乳糖在摩尔比为1.0:0.96,拥有骨干组成的1、3 - 1,6-linked galactopyranosyl残留物,用树枝连着O-3 1, 6-linked半乳糖残基O-4 O-6 1, 3-linked半乳糖残基。王等人。14)取得了多糖组件(盒子氧)从绿茶8000兆瓦的Da热水提取和乙醇沉淀。盒子氧由甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、木糖、半乳糖、阿拉伯糖、岩藻糖、摩尔百分比为4.3%,1.4%,4.1%,2.6%,3.0%,31.4%,4.6%,21.8%,23.5%,和3.3%,分别。

多糖生物活性与分子结构密切相关,包括兆瓦,活性基团含量、主链和支链结构,单糖组成及序列,糖苷键类型和位置,构象和溶解度15- - - - - -17]。对于同样的多糖,兆瓦是生物活性的最重要的指标18- - - - - -21]。Lei et al。19表明三硫酸葡聚糖酿酒酵母,12.9兆瓦(sGSC1), 16.5 (sGSC2)和19.2 kDa (sGSC3),显示体外抗氧化和免疫活动。结果表明sGSC1、sGSC2 sGSC3可以清除1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH),过氧化物,和羟基自由基,自由基清除的影响强度sGSCs之后订单sGSC1 > sGSC2 > sGSC3。太阳et al。20.)进行降解紫球藻属cruentum(EPS-0) Mw 2918.7 kDa获得三种多糖分数较低的256.2兆瓦(EPS-1), 60.66 (EPS-2)和6.55 kDa (EPS-3)。EPS-0没有表现出显著的抗氧化活性,但多糖降解后分数产生溶血抑制影响损伤引起的铁^{2 +}/ Vc在小鼠肝脏通过姬氏;最大抑制浓度(IC的一半₅₀)的价值EPS-1 EPS-2, EPS-3测量1.09,0.91,和0.81毫克/毫升。最低的结果表明,EPS-3 Mw,显示氧化损伤的保护作用最强的肝脏通过姬氏老鼠。应等。21柳堡]提取并获得三个TPS部分兆瓦的7.1 kDa (LTPS-30), 6.9 kDa (LTPS-50)和6.6 kDa (ltp - 70)。ltp - 70,最小的兆瓦,表现出最强的抗氧化活性和修复受损影响人类脐带血管内皮细胞在-400 - 12.5的浓度范围μ克/毫升。

氧化损伤是导致各种疾病的主要因素之一。肾结石的形成与肾脏上皮细胞的氧化损伤22- - - - - -24]。TPS呈现良好的抗氧化活性,可以降低氧化损伤和修复细胞(25]。因此,TPS可用于减少发病率,预防肾结石的形成。我们提取四种绿色TPSs兆瓦的10.88,8.16,4.82,和2.31 kDa,比较研究其抗氧化活性和修复受损的肾脏上皮细胞影响肾结石的预防和治疗提供依据。

2。材料和方法

2.1。试剂和仪器

绿茶多糖(TPS)从陕西Ciyuan购买生物有限公司,有限公司;D₂O(99.9%,σ),其它常规试剂从广州化学试剂公司购买(广州)。

人类肾脏近端小管上皮细胞(HK-2)是购自上海细胞库、中国科学院(中国上海)。胎牛血清和细胞培养基(DMEM)从HyClone购买生化制品有限公司有限公司(中国,北京)。细胞培养板的6 - 12 - 96 -(巢,中国)。细胞增殖试验设备(细胞计数Kit-8, CCK-8)从Dojindo购买实验室(熊本、日本)。吖啶橙(AO)从Siama购买(美国)。苏木精和伊红染色设备,(他)活性氧测定工具包(DCFH-DA)和线粒体膜电位测定设备(JC-1)从上海购买Beyotime生物科技有限公司(上海,中国)。羰基氰化物3-chlorophenylhydrazone (CCCP)和细胞凋亡和坏死试验设备购买来自4 a生物技术有限公司有限公司(中国,北京)。

装置包括紫外-可见分光光度计(美国瓦里安公司卡里500),倒置荧光显微镜(日本奥林巴斯公司)、流式细胞术(美国贝克曼,不负责任的人),酶标记工具(safireZ、Tecan、瑞士),核磁共振波谱仪(瓦里安力量- 300 MHz,德国)和傅里叶变换红外光谱(IR) (EQUINOX55、力量、德国)。

2.2。茶多糖的降解

约1.2克的粗茶多糖(TPS0)加权准确、溶解在20毫升蒸馏水。与过氧化氢反应系统很快就被添加(H₂O₂),并允许继续在90°C 2 h;此时,溶液的PH值调整到7.0 mol / L氢氧化钠溶液通过添加2。退化的解决方案集中到三分之一的原始卷60°C。产品被三次加入无水乙醇沉淀。存储的解决方案是在一夜之间和过滤。滤液在真空干燥得到降解多糖。退化的茶多糖具有不同分子量可以获得通过改变氢的浓度₂O₂分别为4%,8%,14%。

2.3。茶多糖的分子量测定

根据文献[26),乌氏粘度测定茶多糖的分子量。固有粘度(η)和分子量M Mark-Houwink经验方程所描述的可能 。茶多糖,κ和α分别是0.0416和0.49。

2.4。羧基含量的茶多糖的分析

TPS的羧基组(羧基)内容是用电导滴定法(27]。最终值的平均值三个平行实验。

2.5。傅里叶变换红外光谱(ir)分析茶多糖

干多糖样品(2.0毫克)和200毫克的钾溴化(KBr)和压缩扫描光谱在该地区的4000厘米⁻¹到400厘米⁻¹4厘米的一项决议⁻¹。

2.6。¹H NMR和¹³C NMR谱的茶多糖

根据文献[28),大约40毫克的茶多糖溶解在0.5毫升氧化氘(D₂O, 99.9%)在核磁共振管。在多糖溶解完全,¹H和¹³C NMR谱都使用了瓦里安的力量- 600 MHz分光光度计。

2.7。氢氧自由基(^⋅TPS的哦)清除活动有不同的分子量

的^⋅哦在体外检测多糖体外清除能力H₂O₂/铁系统方法(19,29日]。38 EP管(10毫升)准备,和EP管反应混合物中含有不同浓度的多糖(0.15,0.5,0.8,1.0,2.0,和3.0 g / L)与FeSO孵化₄(2.5更易/ L, 1毫升)和邻二氮杂菲(2.5更易与L, 1毫升)在磷酸缓冲(20更易/ L, 1毫升,pH值6.6)为90分钟37°C。吸光度测量在580 nm多次取平均值。抗坏血酸(Vc)作为阳性对照组。清除羟基自由基的能力计算使用以下方程: 在哪里空白组;对照组与H₂O₂;和是实验与多糖组。

2.8。abt TPS的自由基清除活性有不同的分子量

abt自由基清除活性多糖进行根据(30.)与轻微的修改。7更易与L abt的解决方案是混合2.45 L更易与过硫酸钾水溶液,然后,混合物在室温下在黑暗中孕育了14 h。然后,3.0毫升各种多糖的混合物溶液加入1毫升的解决方案在试管中。在室温下反应6分钟后,吸光度测量在734海里。 在哪里对照组没有多糖;实验小组;和是没有试剂空白组。

2.9。TPS的还原能力不同的分子量

多糖的还原能力是决定引用文献[31日)做了一些调整。2毫升的四个不同分子量多糖样品在不同浓度(0.15,0.5,0.8,1.0,2.0,和3.0 g / L)和2毫升磷酸盐缓冲剂(PBS、pH = 6.6)和2毫升铁氰化钾(1.0%,w/v)。混合物在50°C孵化20分钟,冷却到室温。2毫升三氯乙酸(10%,w/v)被添加到混合,然后离心10分钟在3000 r / min。上层清液(2毫升)和0.5毫升FeCl混合₃(0.1%,w/v)解决方案和2毫升蒸馏水。混合物充分混合,站了10分钟。吸光度测量700海里。磷酸缓冲作为阴性对照组。抗坏血酸(Vc)作为阳性对照组和比较。

2.10。细胞毒性的测定TPS HK-2细胞

HK-2在DMEM-F12培养基培养细胞含10%胎牛血清,100μg / mL链霉素抗生素青霉素与pH值7.4 - 100 U /毫升5%股份有限公司₂湿润环境37°C。到达一个单层80% - -90%的融合,细胞被轻轻吹胰蛋白酶化形成细胞悬液后后续的细胞实验。

细胞浓度的细胞悬液1×10⁵细胞/毫升每在96孔板接种和培养24小时。随后,培养基被删除了,100μL(0, 20岁,60岁,100μg / mL TPSs各种分子量增加,每个浓度三平行井重复。孵化后24 h, 10μL CCK-8被添加到每个好,孵化为1.5 h。吸光度(A)使用酶标记测量仪器在450 nm根据指令CCK-8工具包。细胞生存能力是决定使用以下方程:

2.11。修复CCK-8 TPS对HK-2受损细胞的影响

100年μL细胞悬液的浓度1×10⁵细胞/毫升每在96孔板接种。这些细胞被分为四组:对照组(1)背景:无细胞培养基组,(2)正常对照组:只有无血清培养基添加,(3)受损组:无血清培养基中添加了2.6 L更易与草酸和孵化为3.5 h,和(4)修复组,包括TPS0 TPS2,和TPS3修复组,不同浓度的TPS0 (10.88 kDa), TPS2 (4.82 kDa),和TPS3 (2.31 kDa),分别添加到组和修复受损的细胞10 h。修复完成后,10μL CCK-8被添加到每个好,孵化为1.5 h。使用酶标记的吸光度值测量仪器在450纳米检测多糖的修复能力。

2.12。细胞形态学观察,Hematoxylin-Eosin(他)染色

根据我们之前的研究32),光学显微镜下观察细胞形态学变化后染色。1毫升的细胞浓度的细胞悬液1×10⁵细胞/毫升每在接种12-well盘子和孵化24 h。细胞被分为三组:(1)正常对照组:只有无血清培养基添加,(2)受损组:无血清培养基中添加了2.6 L更易与草酸和孵化为3.5 h,和(3)修复组,包括TPS0 TPS2,和TPS3修复组织,80年μ克/毫升TPS0 TPS2, TPS3,分别添加到组织和修复受损的细胞10 h。上层清液被删除的愿望和PBS细胞被洗两次。细胞和4%多聚甲醛固定15分钟和苏木精和伊红染色根据制造商的指示。在显微镜下观察细胞的形态变化,细胞质和细胞核染色在紫色和粉红色或红色。

2.13。变化活性氧(ROS)

种子细胞的密度和实验分组的相同部分2.12。积极的试剂(Rosup, 100μmol / L)试剂盒是用作积极控制。修复10 h后,细胞与PBS洗;500年μL DCFH-DA与无血清培养基稀释1:1000添加和孵化为30分钟37°C。然后,细胞与PBS洗3次,去除多余DCFH-DA。ROS荧光显微镜下观察分布;细胞内ROS的荧光强度定量检测到一个微型板块读者。

荧光定量检测的微型板块读者,100μL细胞悬液的浓度1×10⁵细胞/毫升每在96孔板接种。修复10 h后,细胞与PBS洗;然后,100年μL DCFH-DA添加和孵化为30分钟37°C。细胞内ROS的荧光强度定量检测在502海里。

2.14。线粒体膜电位的测量(Δψ米)

种子细胞的密度和实验分组节是一样的2.12。作为一个已知的线粒体膜电位的破坏者,50μmol / L CCCP被用作积极控制。修复完成后,细胞被收集和离心机在1000转/分钟5分钟。之后,上层清液被吸入,并与PBS细胞冲洗两次。Δ的ψ根据JC-1检测设备。然后用200这些细胞被染色μL JC-1染料,充分混合,在黑暗中孵化37°C,持续15分钟。治疗后,细胞被流式细胞分析仪检测。

2.15。溶酶体完整性维修前后的变化

细胞浓度的细胞悬液1×10⁵细胞/毫升每在接种12-well盘子盖玻片和孵化24 h。实验分组的相同部分2.12。PBS的细胞被洗了两次,然后装满5μg / mL AO DMEM 15分钟。正在修理10 h后,细胞与PBS冲洗三次,和AO的分布在荧光显微镜下观察细胞。

标仪荧光定量检测,细胞(1×10⁵细胞/毫升)在96孔培养板(100μ信用证),并与AO染色。酶标记下的红色和绿色荧光检测仪器与激发在485 nm,排放在530 nm(绿色细胞质AO)和620海里(红色溶酶体AO)。正常的溶酶体完整性=(总红色荧光强度正常的溶酶体)/(总绿色荧光强度正常的溶酶体)。溶酶体完整性=(总红色荧光强度)/((总绿色荧光强度)×(正常的溶酶体完整性)]。

2.16。细胞周期分析

根据我们之前的研究32),细胞周期进程的变化被流式细胞术分析。2毫升的细胞浓度的细胞悬液1×10⁵细胞/毫升每在接种6-well盘子和孵化24 h。细胞汇合的后,介质改为无血清培养基,然后孵化12 h达到同步。实验分组的相同部分2.12。正在修理10 h后,用胰蛋白酶消化收集细胞。收集到的细胞被洗两次与PBS和离心机(1000 rpm) 5分钟,然后用70%乙醇固定在4°C 12小时。乙醇是由离心去除(2000 rpm, 5分钟),并与PBS细胞被洗两次。细胞被resuspended在200年μL propidium碘和保持在37°C的15分钟。细胞周期分析了流式细胞仪测量PI-labeled DNA固定细胞的数量。

2.17。修复前后细胞凋亡率的变化

根据我们之前的研究33HK-2细胞,细胞凋亡和坏死修复前后流式细胞分析仪测定的膜联蛋白V-FITC / PI双染色试验。种子细胞的密度和实验分组节是一样的2.12。细胞凋亡诱导物(CCCP 50μmol / L)是作为一个积极的控制。修复完成后,细胞被收获,然后使用膜联蛋白染色V-FITC /π细胞死亡分析工具根据制造商的指示。这些细胞被resuspended在200年μL具有约束力的缓冲区。然后,5μL的膜联蛋白V-FITC补充说,其次是潜伏在黑暗中在室温下10分钟。这些细胞被resuspended在200年μL(绑定缓冲和沾染了5μL(π。准备细胞用流式细胞分析仪进行分析。

2.18。统计分析

实验数据被平均值±标准偏差表示(±SD)。实验结果用SPSS 13.0软件进行统计学上的分析。多个组使用单向方差分析进行比较,其次是图基事后测试。如果 ,有显著差异;如果 ,差异非常显著;如果 ,没有显著差异。

3所示。结果

3.1。TPS的退化

三个退化TPS分数,即TPS1 TPS2, TPS3,得到从原油TPS (TPS0)为4%,8%,和14%的浓度,分别的H₂O₂。意味着TPS0兆瓦,TPS1 TPS2, TPS3达到10.88,8.16,4.82,和2.31 kDa分别(表1)。TPSs富含多糖。

降解反应的氢₂O₂是温和的,退化的程度可以控制在不改变多糖的主链的结构34- - - - - -37]。例如,溪镇et al。36)进行降解天然大豆多糖通过控制氢的浓度₂O₂获得四个多糖分数550 Mw, 347年,285年,21 kDa。所有降解多糖分数官能团的结构基本相似。侯et al。37)进行降解昆布属植物粳稻摘要研究通过改变H₂O₂浓度、反应温度和pH值和获得七个分数1.0兆瓦的退化,3.8,8.3,13.2,35.5,64.3,和144.5 kDa。没有显著变化观察到所有的主要骨干结构和硫酸组内容多糖分数。

没有观察到显著变化羧基TPS降解前后的内容。当H浓度₂O₂为4%和8%,羧基退化TPS1的内容和TPS2产品达到12.3%和12.7%,略高于TPS0退化之前(11.2%)。上述结果归因于增加降解多糖的溶解度(表1);溶解度的增加暴露大量羧基组(38]。当H₂O₂浓度增加到14%,羧基含量TPS3测量11.0%,略低于TPS0。这个结果可以解释为氧化脱羧多糖诱导的免费氧原子来自高浓度的H₂O₂在高温(39]。

3.2。TPS的傅里叶变换红外(ir)光谱

图1显示了四个TPS分数傅立叶变换红外光谱。前后多糖分数呈现相似的光谱退化。没有新的峰出现,说明类似结构的四个多糖分数。多糖样品显示强烈的吸收峰在3401 - 3423厘米⁻¹相应的,羟基的伸缩振动。分子间和分子内氢键也观察到。吸收峰在3000 - 2800厘米⁻¹与碳氢键的伸缩振动。信号在1608厘米左右⁻¹有关C = O伸缩振动的羧基,在1105厘米和信号吗⁻¹建议α葡萄糖吡喃糖环(40]。

每个多糖样品表现出相同数量(2.0毫克)。因此,吸收峰强度可以反映特征官能团的内容(41]。与未经碰撞的TPS0分数,吸收峰-哦(3412和3417厘米⁻¹)和羧基(1602.1和1610.5厘米⁻¹)在退化TPS1 TPS2分数明显更强,分别表明TPS1 TPS2暴露很多-哦和羧基组(38]。羧基的吸收峰TPS3削弱和显示一致性略降低羧基含量(表2)。

3.3。¹H核磁共振(NMR)和¹³TPS的C NMR光谱分析

如傅立叶变换红外光谱所示,在H TPS仍未受损的基本结构₂O₂退化。因此,作为TPS0代表,¹H和¹³多糖的C NMR光谱特征,光谱图所示S1。的¹³C NMR和¹H NMR信号TPS0分配表所示S1。

在¹H NMR谱,信号的范围δ4.5 - -5.5 ppm被分配到多糖的糖环。H⁻¹质子信号来自α配置糖环检测到超过4.95 ppm,而大多数人β配置质子将出现在小于4.95 ppm。因此,β- - -α同时配置中存在TPS (42]。的信号δ5.0,3.74,3.95,4.25,4.37,和4.37 ppm与h - 6,分别为(1→4)-α-GalpA TPS (43]。的信号δ4.63,3.75,3.56,3.77,3.60,和3.91 ppm是由h - 6 (1→6)βgalp,而信号δ5.24、4.17、4.09、4.11和3.85 ppm的h -被分配到H-5 (1→2、3、5) -Araf,分别为(43]。的信号δ3.08,3.10,3.17,和3.45 ppm被分配到2,H-4, H-5, 6 (1→) -β分别-D-Glcp [43]。的信号δ4.89和3.64 ppm被分配到h - (1→4) - 6α分别-D-Glcp [44]。

在¹³C NMR谱,信号在该地区δ100 - 104 ppm表明单糖的形式存在于吡喃糖环。的信号δ170 - 180 ppm是由多糖的糖醛酸45]。的信号δ98.9,68.2,68.9,77.8,72.7,和173.4 ppm被分配到c - 2(1→4) -其他α分别-GalpA。的信号δ107.1,73.1,74.7,71.5,75.4,和70.5 ppm颈- 1与其他(1→6)βgalp,分别43]。的信号δ109.5,81.3,77.8,85.3,和70.1 ppm被分配到颈- 1的c - 5 (1→2、3、5) -Araf,而δ74.3,76.6,70.3,76.7,和60.8 ppm被分配到其他(1→)——c - 2β分别-D-Glcp [13]。的信号δ99.5和61.2 ppm是由颈- 1和其他(1→4)-α分别-D-Glcp [44]。

3.4。与不同的Mw TPS的抗氧化活性的比较

3.4.1。氢氧自由基(^⋅哦)清除能力

芬顿反应被用来调查^⋅哦,TPS的自由基清除能力。如图2(一个),彻底清除活动随着多糖浓度提高。在同一浓度,与中层TPS2 Mw最强的清除活性。例如,在TPS的3.0毫克/毫升的浓度,^⋅哦扫TPS0, TPS1、TPS2 TPS3达到51%,62%,79.4%,和37%,分别。这些值都低于95.3%的风险。

3.4.2。abt自由基清除能力

如图2 (b),四个支持显示清除能力abt自由基浓度的方式。在同一浓度,TPS2表现出最强的清除能力。TPS的浓度为3.0毫克/毫升、abt TPS0自由基清除,TPS1, TPS2,和TPS3总计88.1%,90.0%,93.3%,和82.2%,分别。

3.4.3。还原能力

四TPSs遵循秩序的还原能力TPS2 > TPS1 > TPS0 > TPS3(图2 (c))。TPS2仍然出现还原能力最强,TPS3观察而最弱,拥有最小的兆瓦。然而,减少权力TPS2和TPS3都低于Vc。还原能力的四个TPSs浓度的方式改变了。不同的多糖,还原能力加强与TPS浓度增加。

3.5。毒性的评估支持人类肾脏近端小管上皮细胞(HK-2)细胞

TPS1的抗氧化活动(8.16 kDa), TPS0 (10.8 kDa)显示最小差异由于其类似兆瓦(图2(一个)- - - - - -2 (c))。的refore, we only selected TPS0, TPS2, and TPS3 for the following cytotoxicity and repair experiments. As shown in Figure3,这些支持可以促进细胞增殖在20 - 100的范围内μg / mL, TPS2表现出最强的促销效果。上述结果表明,这些支持没有造成细胞毒性HK-2细胞,促进细胞生长。

3.6。TPS HK-2受损细胞的修复效果

3.6.1。提高细胞生存能力

草酸浓度的影响和损伤时间的可行性HK-2细胞图所示S2。毒性逐渐草酸浓度和接触时间的增加而增加。我们选择的草酸浓度2.6更易/ L和随后的治疗时间为3.5 h损伤实验。

TPS0修复的影响,TPS2, TPS3 HK-2受损细胞浓度的20相比,40岁,60岁,80年和100年μ克/毫升(图4)。多糖是最好的修复效果观察到80μ克/毫升浓度和浓度高于或低于在80年有所下降μ克/毫升。

在同一浓度,TPS2显示最好的修复效果。例如,细胞生存能力受损HK-2细胞修复之前从59.4%上升到89.4%,92.8%,84.8%,在80年被修理μg / mL TPS0, TPS2 TPS3,分别。上述结果表明,修复能力的支持与Mw和抗氧化活性是一致的。

操作。修复对细胞形态的影响

形态变化HK-2受损细胞修复前后观察苏木精和伊红染色。如图5,正常HK-2细胞之间的连接紧密,细胞丰满。当HK-2细胞暴露在2.6更易与草酸/ L为3.5 h,细胞失去了自然的形状,体积减少,嗜酸性染色增强,和大量凋亡细胞密集染色形成。修复后通过与不同Mw TPS,细胞数量增加,细胞形态逐渐恢复到正常状况。后被TPS2修复受损的细胞,其形态与正常细胞的紧密。相比之下,修复效果TPS3 Mw较低和较高的TPS0 Mw弱于TPS2。

3.6.3。改变细胞内活性氧(ROS)修复后不同的支持

大量的活性氧在体内会导致氧化损伤生物分子(包括DNA、脂质和蛋白质),因此调解一系列炎症反应的发生,导致细胞功能障碍或死亡(46,47]。TPS的抗氧化能力可以减少细胞不同程度的氧化损伤。

图6说明了细胞内ROS DCFH-DA侦察到的所有细胞群体的变化。与Rosup HK-2细胞治疗后(积极控制)和2.6更易与草酸/ L(损害控制)为3.5 h,明亮的绿色荧光图像观察,表明细胞内ROS的高水平。TPS的受损细胞修复后,荧光强度显示在不同程度的衰减,这最显著的效果是TPS2治疗组(图6 (b))。上述结果表明,支持可以减少细胞内ROS的产生,减轻氧化损伤细胞。

3.6.4。对线粒体膜电位(Δ修复的影响ψ米)

图7Δ显示变化ψm前后HK-2受损细胞的修复。红/绿荧光强度比线粒体的正常对照组达到67.5。当细胞受损2.6更易与草酸/ L,红/绿荧光比率降至3.8,表明Δψm是明显减少。然而,在被TPS0修复受损细胞,TPS2, TPS3Δψ米在不同程度增加。后被TPS2修复受损细胞,线粒体的红/绿荧光比率达到22.9,这高于TPS0治疗组(19.8)和TPS3治疗组(9.3)。因此,TPS2显示最强的对受损的线粒体修复的影响。

3.6.5。溶酶体完整性维修前后的变化

异染性fluoroprobe吖啶橙(AO),是一个lysosomotropic组件,积累在溶酶体由质子捕获。AO积累改变细胞质中的荧光发射从绿色到红色在溶酶体48]。因此,可以用来确定溶酶体完整性AO测量红色和绿色荧光的比率。红色荧光强度较低意味着严重破坏溶酶体。

如图8,溶酶体结构是完整的(100%),和红色和绿色荧光的叠加显示强大的橙红色颜色控制在正常细胞。完整性受损细胞的溶酶体显著降低(51.80%)(图8 (b))。然而,在被TPS0修复受损细胞,TPS2, TPS3,溶酶体完整性增加到81.91%,88.90%,和75.03%,分别。因此,溶酶体的细胞修复TPS2具有强烈的影响。

3.6.6。修复前后细胞周期的变化

细胞周期主要包括DNA合成阶段的早期(G1期),DNA合成阶段(阶段),DNA合成和后期阶段(G2期)。逮捕的细胞周期反映了DNA损伤程度(49]。

如图9由草酸正常HK-2细胞受损时,S期细胞的比例明显(图从59.4%下降到31.1%9 (b)),而在G1期细胞的比例从26.3%上升到52.5%(图9 (c))。结果表明,草酸逮捕了HK-2细胞G1期。后被TPS0修复受损细胞,TPS2, TPS3,逮捕了在S期细胞的比例增加到40.6% - -54.3%,高于31.1%的损伤对照组观察。增加程度与TPS的兆瓦。由TPS2修复后,S期细胞的比例增加了。因此,TPS2表现出最强的修复受损的细胞DNA的影响。

3.6.7。修复前后细胞凋亡的变化

我们执行流仪分析量化凋亡和坏死细胞使用膜联蛋白V / propidium碘(PI)双重染色。膜联蛋白V染色应用于揭示表面的磷脂酰丝氨酸暴露(凋亡)和π揭示质膜完整性的损失(坏死)50,51]。

图10 ()显示的点图观察到细胞凋亡的细胞。象限Q1、Q2、Q3和第四季度表示坏死细胞的比例,晚期凋亡细胞,正常细胞和早期凋亡细胞,而Q2 +第四季度分别表示总细胞凋亡率。草酸正常HK-2细胞受损时,总细胞凋亡率(Q2 + Q4)从2.5%上升到16.7%(图10 (b))。TPS0 HK-2细胞受损后修复,TPS2, TPS3,细胞凋亡率达到8.2%,6.5%,和11.7%,分别。这些价格都低于16.0%的伤害。上述结果表明,TPS可以减少细胞凋亡,与TPS2温和Mw表现出最强的修复效果。

4所示。讨论

4.1。TPS的化学结构分析

从的结果¹H NMR和¹³C NMR谱(图S1),TPS包括葡萄糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、阿拉伯糖。主要包括糖残基(1→4)-α-GalpA (1→4) -α-D-Glcp (1→)β-D-Glcp (1→6)βgalp和(1→2、3、5)-Araf,由王一致结果澄清了et al。52)和Scoparo et al。53]。

红外光谱结果显示,四种多糖在分数上类似的主体结构,但特征吸收峰强度的羧基和多糖不同的-哦。这个结果可以解释为什么产生的羟基自由基H₂O₂降解可以攻击glucosidic联系。氧化分离产生不同的目的地,可以进一步氧化生成羧基酸。分解糖中的碳碳键残留也发生,导致氧化开环和羧基团体的形成(54]。例如,田et al。55)准备的较低的水溶性壳聚糖兆瓦(LWCS) H₂O₂。红外光谱和核磁共振显示没有明显的变化的结构1,4 -βd葡萄糖主链,而变化只发生在LWCS的侧链。

4.2。兆瓦的TPS对体外抗氧化活性的影响

为不同类型的植物多糖,最好的生物活性是由于不同范围的兆瓦。例如,邢et al。56)报道称,阿₂^⋅扫气效果LWCS (9 kDa)是更有效的比高分子量壳聚糖(760 kDa)。然而,马等。57high-Mw)观察到抗肿瘤活性侧耳属eryngii多糖(413 kDa)对HepG-2细胞比low-Mw分数(12 kDa)。

4.2.1。准备导致的低抗氧化活性和细胞修复Low-Mw TPS的能力

多糖的抗氧化活性与Mw密切相关。如图2,^⋅哦,abt扫气率,减少权力low-Mw TPS3 (2.31 kDa)弱于那些温和的Mw TPS2 (4.82 kDa)。这种现象可能造成了重大破坏的链结构TPS3 (Mw)最低的;TPS3特色最松散的分子结构。有效的数量能够螯合金属离子的羟基减少(58,59]。因此,TPS3特色最弱的自由基清除能力。

许多研究也报告了类似的结果。盛和太阳58)进行降解Athyrium multidentatum(娃娃)。Ching多糖和获得四个多糖分数14528兆瓦(CPA-1), 12370 (CPA-2), 11548 (CPA-3),和6403 Da (CPA-4)。浓度为0.2 mg / mL, DPPH-free彻底清除CPA-1, CPA-2, CPA-3, CPA-4总计0.687,0.605,0.429,和0.420,分别。换句话说,多糖与低Mw显示弱的抗氧化活性。赖et al。60)提取两个兆瓦的绿豆多糖通过乙醇沉淀。浓度为0.8 mg / mL, DPPH-free彻底清除率(70.2%)较低的绿豆多糖兆瓦(45 kDa)较弱的绿豆多糖(91.6%)高兆瓦(83 kDa)。

4.2.2。的原因在High-Mw TPS Low-Antioxidant活动和细胞修复能力

多糖可以提供单一的电子或氢原子终止自由基连锁反应,实现自由基清除活性(61年,62年]。与low-Mw多糖相比,high-Mw多糖功能更强的绕组函数,更紧凑的结构,较强的氢键,少接触外部的活性基团,因此拥有较弱的终止自由基连锁反应的能力。

多糖生物活性依赖于主链的螺旋结构和亲水性基团的存在(羟基)位于多糖的外表面螺旋(63年]。High-Mw多糖具有几支链,分子体积大、生物活性和位阻,导致容易瓦解triple-helical聚合结构(58,59,64年,65年]。High-Mw多糖也表现出有限的物理特性,如低水溶性和高粘度,影响其生物活性。在细胞修复效果也会降低由于阻力显著增加大量的多糖分子进入细胞(66年]。

许多研究已经报道的弱抗氧化活性多糖兆瓦(高67年,68年]。例如,咋et al。67年]从米糠中提取,获得三个多糖分数与热水方法;兆瓦范围从1.2×10⁵达6.3×10⁵Da (PW1), 3.5×10⁴达7.4×10⁴Da (PW2)和5.3×10³达2.3×10⁴Da (PW3)。集成电路₅₀值PW1清除abt激进的、PW2 PW3测量0.35,0.2,和0.04毫克/毫升。上述结果表明弱high-Mw多糖的抗氧化活性。太阳et al。68年)执行H₂O₂退化k-carrageenan多糖350000兆瓦的Da和获得四个分数3.25兆瓦,5.82,15.08,和20.9 kDa。集成电路₅₀值清除超氧化物阴离子自由基的四个退化的分数为2.65,3.22,6.66和8.13毫克/毫升。至于氢氧自由基清除,IC₅₀值达到了0.014,0.049,0.062,和0.110毫克/毫升。

4.2.3。最高的原因Moderate-Mw TPS的抗氧化活性和细胞修复能力

当high-Mw多糖降解到一定范围的Mw,他们可以实现最佳的生物活性。多糖与温和Mw不仅可以拥有足够的空间规模形成three-helical聚合结构(58,59,64年)和保持生物活性,而且破坏高度紧凑的分子构象揭露一些积极组织增加亲水性和稳定的结构。位阻的多糖与生物受体反应来说是非常适合的。因此,多糖可以表现出很强的抗氧化活性和理想的细胞修复能力。TPS2与适度的兆瓦可以螯合金属离子(如铁^{2 +}和铜^{2 +}),在生产过程中是必要的^⋅哦,激进分子形成复合物。因此,一代的起始和进展的脂质自由基和连锁反应是抑制69年]。

徐et al。70年]退化的粗多糖山茶花种子饼(COP-C)使用超声波和四种多糖获得分数,也就是说,警员一,警员二,COP-3, COP-4,分子量为7.9,36岁,83年,和225 kDa,分别。2毫克/毫升,浓度的自由基清除能力和还原能力顺序遵循的顺序警员二> COP-3 > COP-4 >警员一。只有多糖与温和兆瓦的36 - 83 kDa表现出最强的抗氧化活性。Trombetta et al。71年)表明,适度兆瓦的多糖仙人掌属植物ficus-indica(l)扁平的叶状茎也好处增强能力,修复受损细胞。Mw的多糖分数高于10⁴Da显示愈合受损皮肤上皮细胞的小鼠的影响。愈合效果更加显著的多糖10兆瓦不等⁴-10年⁶达比10 Mw >⁶哒。

4.3。多糖具有较强的抗氧化活性功能细胞修复能力强

四个研究TPSs展出由草酸修复受损HK-2细胞诱导的影响,和修复能力与抗氧化活性呈正相关。TPS2了最强的抗氧化活性,也表现出最强的细胞修复能力。

在生物体中,小分子可以通过质膜直接或通过载体蛋白或离子通道的帮助(72年),而一些大分子(如蛋白质、分布和脂蛋白颗粒,很难直接穿过细胞膜,双方需要运输细胞膜的内吞作用和流出73年]。太阳et al。74年)证实,马尾松花粉多糖,分子量316 kDa,主要通过receptor-regulated进入RAW264.7巨噬细胞内吞作用而不是吞噬作用。科布等。75年)表明,多糖(ps)脆弱拟杆菌的分子量大于100 kDa的内源性抗原递呈细胞(apc)和定位传统MHCII舱(MIIC)。这个观察也证实在初级小鼠脾细胞,人类THP-1单核细胞,和鼠标B1 B细胞。时间进程研究表明入口和本地化的ps表面可见在30分钟和6 h达到顶峰。因此,TPS多糖(2.31 ~ 10.88 kDa)用于本研究可以访问HK-2细胞。

众多研究表明,体内活性氧的积累可以攻击细胞,导致蛋白质氧化、脂质过氧化、核酸断裂,会影响正常的细胞功能,导致慢性疾病的发生(46,47,76年]。作为抗氧化剂,多糖可以清除自由基,减少氧化损伤的细胞,并表现出保护作用在细胞77年]。例如,枸杞多糖可以保护组织细胞DNA损伤诱导的氧化应激(78年]。猴头菌属erinaceus多糖可以清除DPPH自由基、减少ROS生产,提高细胞活力,抑制线粒体膜电位的降低,并对淀粉样beta-induced展览保护作用在PC12细胞中神经毒性(79年]。鼠尾草brachyantha提取减少H9C2引起的细胞凋亡黄嘌呤氧化酶/黄嘌呤通过防止生成有毒的自由基,增强细胞内的抗氧化防御系统(80年]。金等。81年)透露,Psidium guajava叶多糖可以清除自由基,减轻H₂O₂全身的氧化应激在维洛细胞DNA损伤和抑制脂质过氧化作用。细胞修复后12.5,25岁和50岁μ克/毫升Psidium guajava叶多糖、细胞内ROS损伤组的生产从129.5%下降到118.9%,109.7%,和99.7%,分别。的多糖金银花粳稻花明显降低丙二醛含量,提高超氧化物歧化酶谷胱甘肽过氧化物酶活动,保护了老鼠大脑对缺血/再灌注损伤(82年]。

我们的研究结果的基础上,提出HK-2受损细胞的修复机制TPS如图11。高浓度的尿液中草酸会导致脂质过氧化;这种现象会导致过多的活性氧的生产和损害肾上皮细胞。TPS多糖表现出强大的清除活性氧的能力;因此,TPS引起对HK-2受损细胞修复的影响。HK-2受损细胞修复后通过与不同的分子量,TPS治疗细胞生存能力增加,LDH释放量减少,细胞形态得到改善。当细胞被氧化破坏草酸,线粒体膜的通透性增加,导致Δ下降ψm。TPS可以修复细胞的膜电位,增加Δψm。受损细胞的S期细胞的比例减少,但在G1期增加。治疗后与TPS, TPS提升细胞周期G1期的年代的发展阶段和修复DNA复制。最后,TPS减轻细胞氧化应激诱导细胞凋亡,减少底层形成结石的风险。

5。结论

四个TPS分数(TPS0, TPS1、TPS2 TPS3) 10.88 Mw, 8.16, 4.82,和2.31 kDa,分别。所有TPS分数表现出抗氧化活性。羟基自由基清除,abt自由基清除活性,并减少权力如下:TPS2 > TPS1 > TPS0 > TPS3。四个TPSs还显示修复影响HK-2细胞损伤引起的2.6 L更易与草酸。支持的修复效果和抗氧化活性呈正相关。TPS2,适度的兆瓦,显示最强的抗氧化活性和细胞修复能力。与损伤组相比,细胞形态学修复组接近正常细胞。治疗组也取得了以下结果:细胞生存能力加强,线粒体膜电位和完整性的溶酶体改善,ROS生产减少,G1期细胞被捕,和细胞凋亡率降低。所有这些发现表明这些支持显示修复细胞形态,影响线粒体DNA,和其他在HK-2受损细胞亚细胞的细胞器。我们的结果表明,这些TPS分数,特别是TPS2,可能成为潜在的预防和治疗肾结石药物。

数据可用性

所有的数据支持本文中所示的结果,可以适用于相应的作者。

的利益冲突

作者声明没有竞争的经济利益。

确认

本研究工作获得了由中国自然科学基金会(81670644和81670644号)。

补充材料

的¹³C NMR和¹H NMR归因和光谱TPS0用于表S1和图结构说明了S1。草酸浓度的影响和伤害时间HK-2细胞的生存能力提出了在图S2。(补充材料)

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