文摘

胰岛素抵抗和2型糖尿病(T2DM)病人体内高度流行全世界。游离脂肪酸浓度升高(远期运费协议)与胰岛素抵抗和2型糖尿病密切相关。P2X₇通过ATP受体离子通道封闭,这是涉及各种场景包括免疫反应、疼痛和炎症。在这项研究中,我们探讨是否P2X₇受体参与病理变化在人类脐静脉内皮细胞(HUVECs)引起的高FFA治疗,和evodiamine的潜在好处。Evodiamine能有效地抑制P2X的增强表现₇受体引起的高远期运费协议mRNA和蛋白水平。此外,FFA-induced细胞毒性高,调节释放ATP,和生产活性氧(ROS)可以改善evodiamine HUVECs。Evodiamine也可以扭转下降没有形成和增加免疫细胞在高远期运费协议的胶粘剂的事件。此外,evodiamine抑制P2X₇端依赖肿瘤坏死因子-α由于高远期运费协议表达和ERK 1/2磷酸化。这些结果表明,evodiamine能正确调节P2X的表情₇在HUVECs受体诱导高FFA条件下,因此抑制氧化应激和炎症反应。

1。介绍

炎症被认为是一个风险因素发展的胰岛素抵抗和2型糖尿病(T2DM)病人体内1,2]。胰岛素抵抗和2型糖尿病通常伴随着增加血浆游离脂肪酸水平(远期运费协议)、高胰岛素血症、高血糖症和动脉粥样硬化3]。血管内皮细胞血管调节中发挥重要作用,维护心血管内分泌功能,体内平衡(4,5]。内皮损伤是一个基本事件对动脉粥样硬化的发展。此外,血管疾病的风险是增强在高胰岛素血的背景下,也发生在糖尿病患者血糖控制不佳(6]。内皮细胞的正常功能是至关重要的,以防止胰岛素抵抗或diabetes-induced大血管动脉粥样硬化,微血管损伤。

三磷酸腺苷(ATP)可以参与细胞信号转导的绑定类P2X受体,这是ligand-gated阳离子通道(7- - - - - -10]。P2X₇P2X受体的亚型,在炎症和免疫反应中起着重要的作用。不受控制的Ca^{2 +}涌入可能被诱导由于P2X的过度刺激₇由细胞外ATP受体(11,12]。ATP在细胞外空间后可以增加内皮细胞受损后炎症(13]。此外,高远期运费协议可以增强血管胰岛素抵抗通过抑制胰岛素信号(14,15]。许多研究发现,P2X₇受体介导神经元之间的通信和小胶质细胞在炎症条件下(16]。然而,很少有人知道P2X的影响₇在人类脐静脉内皮细胞的受体(HUVECs)病理条件下高远期运费协议。

Evodiamine (EVO)是一种天然的生物碱,发现在水果的吴茱萸药用植物,被用于中药实践(17]。antinociceptive, EVO已被证明具有抗炎和抗癌活动(18- - - - - -20.]。然而,在改善炎症的准确机制EVO仍然知之甚少。因此,本研究调查是否P2X₇受体参与高FFA-induced内皮功能障碍和EVO具有潜在高远期运费协议下对血管内皮损伤的保护作用。

2。材料和方法

2.1。材料

RPMI 1640培养基从Hyclone购买(美国);胎牛血清(的边后卫),从生物产业(以色列);EVO,从南京Zelang医疗技术,中国;(3)- 4 5-dimethylthiazol-2-yl 5 - (3-carboxymethoxyphenyl) 2 - (4-sulfophenyl) 2 h-tetrazolium (MTS)试验设备,恢复援助第一链cDNA合成装备,和SYBR绿色主结构,从Promega,美国。一氧化氮(NO)试验设备(硝酸还原酶方法)和DCFH-DA来自南京建成生物工程研究所、中国。BCECF-AM是中国从Beyotime生物技术、购买。从Tiangen试剂盒试剂购买,中国。聚乙烯二氟化物(PVDF)膜从微孔购买(贝德福德,妈,美国)。HUVECs买来CTCC生物科学(上海,中国)。THP-1细胞获得上海细胞生物学研究所中国科学院。

2.2。HUVEC文化

HUVECs培养在RPMI 1640中含有10%的边后卫,100 U /毫升青霉素和100毫克/毫升硫酸链霉素在含有5%孵化器有限公司₂在37°C (5]。细胞分为控制(1% BSA),高远期运费协议(1毫米),控制+ 0.25μ远期运费协议+ 0.25 M EVO,高μM EVO。细胞被播种到six-well板后24 h,媒体取代和添加到1毫米远期运费协议和0.25μ同时M EVO。然后,HUVECs培养3天。远期运费协议是棕榈酸和油酸酯的混合物,1:2 (/)[21]。在治疗期间,的浓度的边后卫在中降至2%,使细胞处于静止状态。

2.3。THP-1细胞培养

THP-1细胞,人类单核细胞的白血病细胞株,维护文化RPMI 1640包含10%的边后卫和补充与100 U /毫升青霉素和100毫克/毫升硫酸链霉素在37°C包含5%的湿润环境有限公司₂。媒介是每两天更换一次。

2.4。细胞生存能力评估(MTS试验)

EVO和细胞毒性的保护作用不同浓度的远期运费协议(0.25,0.5,和1.5毫米)在HUVECs被MTS化验检查。HUVECs被播种在96 - 4500细胞/ 200孔板μl体积。各种治疗方法的HUVECs 72 h后,介质被90人μ无血清培养基和10μ每对2.5 h l MTS试剂添加孵化在37°C。的吸光度形成甲瓒被标以490海里(日出,Tecan、Mannedorf、瑞士)。

2.5。总没有合成的测量

HUVECs不同浓度处理后的远期运费协议或EVO 72 h,媒介收集总浓度的确定没有使用硝酸还原酶方法根据制造商的手册(南京建成生物工程研究所、中国)。在这种方法中,硝酸还原酶将硝酸NO-derived变成亚硝酸盐,因此,亚硝酸盐浓度的培养基分别通过测量吸光度的亚硝酸盐使用标550海里。没有浓度的计算公式如下:没有浓度(μ米)=(((吸光度对井−空白的吸光度威尔斯)/(吸光度的标准井−空白wells)的吸光度)×标准浓度(100μ米)]×测量前稀释样品折叠。

2.6。测定细胞内ROS

细胞内ROS DCFH-DA生产检查的方法(22]。HUVECs培养与控制(1% BSA)或不同浓度的远期运费协议没有24-well盘子上的EVO 3 d。洗后的细胞与磷酸盐(PBS)三次,无血清培养系统中取代包含10μ在37°C M DCFH-DA 20分钟孵化加载荧光染料。然后,细胞用PBS三次把荧光探针不进入细胞。荧光是由荧光板读者(Tecan无限M200)激发和发射波长的485和535海里,分别。

2.7。测量细胞外ATP释放

ATP浓度HUVEC上层的评估使用ATPlite 1步工具包(PerkinElmer公司)根据制造商的协议。分别简要,HUVEC上层清液收集。纯ATP股票稀释构建ATP浓度的标准曲线:7.81,15.63,31.25,62.5,125年、250年和500年。荧光素酶酶底物的解决方案(25μl)被添加到每个的孵化的enzyme-coated板5分钟。随后,细胞上清液(25μl)被添加到每个10分钟。收集的结果测量所产生的发光强度ATP-dependent luciferin-luciferase。释放的细胞外ATP水平相对于控制。

2.8。细胞粘附的分析

THP-1细胞含有10μM BCECF-AM荧光探针在黑暗中30分钟(23]。标签THP-1离心收集的细胞,用PBS洗了三次。THP-1细胞悬液(0.2毫升)被添加到包含附加HUVECs six-well盘子后不同治疗3 d。后两种类型的细胞在37°C cocultured 1 h,盘子轻轻清洗三次删除不依从细胞。坚持荧光THP-1细胞被发现使用荧光显微镜。

2.9。实时rt - pcr

各种治疗后,总RNA在细胞被试剂盒提取总RNA试剂。2μg是相对地转录成RNA cDNA使用合成第一链cDNA工具包恢复援助。放大反应化验包含SYBR绿色主混合和引物。GAPDH是用作正常化,参考基因和cDNA丰度量化了∆∆CT阈值周期的方法。引物序列如下:GAPDH, 5TGACGTGGACATCCGCAAAG3和反向5CTGGAAGGTGGACAGCGAGG3 ,和P2X₇5、前进-GAGTCCGAGGCAATCTAATG 3和反向5-CTGTGATCCCAACAAAGGTC-3 。

2.10。西方墨点法

细胞被播种在6-well盘子,紧随其后的是不同的治疗72 h。在裂解缓冲之后,蛋白质提取(里帕:PMSF: PhosSTOP = 100: 1: 1) 15分钟在冰上。上层清液的收集。各种样本的等量的蛋白质分离10%钠deodecyl sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和转移到PVDF膜。细胞膜被封锁在室温下使用脱脂奶粉5%然后孵化主要抗体。与PBS洗了三次后,膜与辣根孵化peroxidase-conjugated二级抗体。然后,化学发光信号进行化学发光成像系统的开发工具包。乐队是由强度图像的量化Pro-Plus软件,和蛋白质的表达水平正常化β肌动蛋白作为集成光密度(IOD)比例。使用的主抗体是兔子anti-P2X₇(1:200年,Alomone实验室),anti-total ERK1/2和anti-phospho-ERK1/2 MAPK(1: 1000年,细胞信号技术)和anti-TNF -α(1:800年,Abcam)。

2.11。统计分析

所有的结果表示为均值±SEM,使用SPSS 21.0进行数据的统计分析。单向方差分析(方差分析),后跟一个事后学生的t测试是用来确定统计学意义。 被认为是显著性差异。

3所示。结果

3.1。保护作用的EVO HUVECs培养高远期运费协议

HUVECs培养在控制(1% BSA)或不同浓度的远期运费协议72 h。结果表明,远期运费协议影响细胞的生存能力在剂量依赖性的方式(图1(一))。显著减少的细胞生存能力发生在治疗0.5,1,1.5毫米远期运费协议。暴露于高远期运费协议(1毫米)减少了75%的细胞存活率与对照组相比(图1 (b))。与此同时,高的细胞毒性效应远期运费协议(1毫米)coculture 0.25后被废除μM EVO。

3.2。EVO逆转高远期运费协议没有形成的影响

没有发布水平HUVECs测量72 h后治疗1% BSA,不同浓度的FFA, 0.25μM EVO。结果表明,1 - 1.5毫米远期运费协议减少生产(图2(一个))。高远期运费协议(1毫米)没有形成下降了17%(图2 (b); )。然而,与EVO coculture可能导致没有内容到正常水平。没有显著改变生产被认为仅靠EVO HUVECs治疗时。

3.3。EVO减少细胞内ROS的高FFA-Induced增加

ROS生产HUVECs测量72 h后治疗1% BSA,不同浓度的FFA, 0.25μM EVO。结果显示,1和1.5毫米远期运费协议可能会增加活性氧的生产(图3(一个))。细胞内ROS生成治疗后显著增加在HUVECs高远期运费协议(1毫米)(图3 (b), )。然而,增强生产高远期运费协议是EVO的存在减轻。

3.4。高远期运费协议和EVO对细胞外ATP释放的影响

细胞外ATP释放测量进一步确定FFA和HUVECs EVO的效果。细胞外ATP在HUVECs显著增加高治疗后的远期运费协议(图3 (c), )。然而,EVO可以减少ATP释放高FFA-treated细胞(图3 (c), )。

3.5。影响高远期运费协议和EVO P2X₇受体的表达

探索潜在的P2X参与₇受体在FFA-induced副作用HUVECs EVO如何保护HUVECs P2X的表达₇受体信使rna和蛋白质含量检测。结果表明,1毫米FFA对P2X有最重要的影响₇信使rna水平(图4(一))。的P2X₇受体HUVECs mRNA水平高远期运费协议处理高出三倍,在控制细胞(图4 (b))。西方墨点法证明高(1毫米)的增感效应P2X远期运费协议₇受体(图4 (c))。此外,高FFA-induced P2X₇表达式被HUVECs cotreated时为2.5μM EVO。

3.6。EVO抑制高FFA-Induced HUVECs THP-1细胞的粘附

THP-1细胞的粘附HUVECs讲究的在高为3天(1毫米)远期运费协议增加约3.6倍相比,对照组(图5),而2.5μ米EVO能够抑制高FFA-induced HUVECs THP-1细胞的粘附。因此,EVO有效改善由于高HUVECs远期运费协议的炎症反应。

3.7。影响高远期运费协议和EVO ERK1/2和TNF -α在HUVECs

ERK1/2和TNF的表达和活性α在HUVECs被西方墨点法评估。pERK1/2比ERK1/2高FFA组高出2.5倍,在控制细胞(数字6(一)和6 (c)),ERK1/2比β肌动蛋白并不是不同的两组之间(数字6(一)和6 (b))。此外,cotreatment EVO能够扭转高FFA-induced激活ERK1/2 HUVECs(数字6(一)和6 (c))。同样,TNF的表达α也增加了FFA组比对照组高,这可能是抑制时细胞与EVO cocultured(数据吗6 (d)和6 (e))。定义如果高的影响远期运费协议p-ERK和TNF -α是P2X₇端依赖,10μM A438079 (P2X的选择性抑制剂₇)使用。结果表明,p-ERK和TNF -α在细胞治疗降低FFA + A438079相比只治疗的远期运费协议(图7)。

4所示。讨论

血管内皮功能障碍发生在胰岛素抵抗、糖尿病和其他代谢疾病(24]。最近的研究发现,等离子体远期运费协议的浓度增加的情况下受损的内皮功能障碍和胰岛素抵抗,这表明高远期运费协议有一些负面影响内皮细胞(25,26]。发表的研究还显示,减少血管没有生物活性,内皮功能障碍发生过氧化物生产时增加糖尿病的实验模型(27]。P2X₇受体表达调节炎症和内皮细胞的凋亡反应处理高葡萄糖体外[28]。然而,P2X之间的关系₇受体和高远期运费协议还不清楚。在这项研究中,慢性接触HUVECs远期运费协议影响细胞的生存能力在剂量依赖性的方式。此外,我们发现P2X₇表达增加高FFA条件下和EVO可以保护HUVECs从高FFA-evoked生存能力降低,表明P2X的潜在作用₇在内皮细胞和EVO FFA行动。

没有起着重要的作用在调节各种生理功能,包括免疫、血管舒张、神经传递、血管渗透性。然而,NO-mediated血管放松在胰岛素抵抗和糖尿病受损,表明内皮功能障碍(29日]。此外,内皮细胞损伤和氧化应激障碍与upregulation相关联。由于过多的活性氧ROS增加体内生产或降低抗氧化能力会导致氧化损伤细胞。这也是众所周知,内皮不可以抑制血管炎症通过抑制免疫细胞内皮的粘附。在我们的研究中,没有形成显著下降而ROS生产增加HUVECs FFA条件下高。此外,ATP释放受损的细胞可以作为炎症介质参与炎症(30.,31日]。我们观察到治疗的远期运费协议导致了从HUVECs增加细胞外ATP的释放。EVO可以对抗这些高远期运费协议的影响没有,ROS,和HUVECs ATP生产,显示其强大的抗氧化应激能力,抗炎、改善内皮功能。胰岛素抵抗和糖尿病往往伴随着轻微的炎症和相关基因表达的变化(32,33]。异常表达P2X₇受体参与炎症和P2X₇受体的调节中起关键作用神经胶质细胞(34]。调节两P2X表达式₇信使rna和蛋白质后在当前的研究中观察到HUVECs暴露在较高的远期运费协议。因此,我们的研究结果建议P2X₇受体可能参与生产的异常变化不,ROS的炎症和血管内皮功能障碍引起的高远期运费协议。EVO可以减少活性氧的生产和保护细胞ATP。

我们评估HUVECs THP-1细胞的粘附,因为增加mononuclear-endothelial关键作用的细胞相互作用在胰岛素抵抗或diabetes-induced炎症反应(35]。我们的研究结果表明,THP-1细胞的粘附HUVECs加强HUVECs后使用高远期运费协议。这种调节粘附明显被EVO,暗示其抑制炎症反应的能力强。炎症可能涉及增加特定的胞内信号通路的表达和活性。增加P2X₇受体可能激活ERK 1/2,导致磷酸化ERK的1/2。肿瘤坏死因子-α是一个潜在的促炎细胞因子与不同病理过程(36]。我们的研究结果表明,激活ERK 1/2增加高FFA-cultured HUVECs,表明ERK1/2可能发挥重要作用的规定高FFA-induced TNF -等炎性细胞因子的表达α和il - 1β。此外,EVO能够抑制高FFA-induced ERK的磷酸化1/2和肿瘤坏死因子表达的增加α在HUVECs P2X₇端依赖的方式。因此,激活ERK信号通路可能参与1/2 P2X的分子机制₇介导的肿瘤坏死因子-α释放和炎症在高FFA-cultured HUVECs。

总之,HUVECs培养高的远期运费协议表现出P2X表达增加₇受体而EVO能够抵消这种效应。此外,HUVECs高曝光的远期运费协议导致细胞生存能力下降,没有内容,增强ROS生产,调节ERK的磷酸化和TNF - 1/2α表达式。相比之下,EVO可能逆转这些有害的结果高远期运费协议可能主要是通过作用于P2X的封锁₇活动。因此,EVO保护内皮细胞功能从高远期运费协议通过抗炎和抗氧化作用。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

云雪和郭Ting同样这项工作。

确认

本研究支持的资助(81360140号,81570735,31560276,81360136,81560219,,81171184)从中国国家自然科学基金资助(20151122040105)从江西省的第二批Gan Po卓越人才“555工程”人才项目资助(没有。20151 bbg70250)从技术基座和江西省社会发展项目,资助(没有。20142 bab205028)江西省自然科学基金的资助(没有。2014 - 47)的主要学科学术和技术领导项目的江西,江西研究生创新专项资金项目(项目编号YC2016-S058和YC2017-S078)。