文摘
心脏干细胞(二者)已成为一个最有前途的干细胞的心脏保护。最近,液从骨骨髓来源间充质干细胞(bmsc)已发现促进细胞增殖和生存通过运输各种生物活性分子,包括小分子核糖核酸(大鹏)。在这项研究中,我们发现BMSC-derived液(BMSC-exos)显著降低细胞凋亡率和活性氧(ROS)在二者生产氧化应激损伤。此外,一个更强大的影响诱导bmsc的液收集在缺氧条件下培养(Hypoxic-exos)比来自bmsc培养在正常情况下(Nor-exos)。我们还观察到更大的mir - 214浓缩比Nor-exos Hypoxic-exos。此外,mir - 214抑制剂或模仿添加到调节BMSC-exos透露,mir - 214水平液从mir - 214 -耗尽bmsc部分扭转了二者的低氧诱导液对氧化损伤的影响。这些数据进一步证实,mir - 214的主要效应分子BMSC-exos保护二者免受氧化损伤。mir - 214模拟和抑制剂转染化验证实CaMKII的目标基因在二者mir - 214,与exosome-pretreated二者表现出增加mir - 214年的水平,但减少CaMKII的水平。因此,mir - 214 / CaMKII轴调节氧化应激相关损伤在二者,如细胞凋亡、钙稳态失衡,和过多的活性氧积累。总的来说,这些发现表明,bmsc释放mir - 214含液抑制氧化应激损伤在二者CaMKII沉默。
1。介绍
内源性心肌修复受伤被报道参与反应的激活和分化居民心脏干细胞(二者)[1- - - - - -3),和临床前和临床研究提供了丰富的证据的能力二者改善心脏功能(4- - - - - -8]。尽管二者这种令人印象深刻的心脏修复能力,穷人生存和保持低二者阻碍功能改进和心脏的结果(7,9,10]。可怜的供体细胞生存的因素是复杂的,包括炎症、活性氧(ROS)释放,Ca2 +体内平衡破坏,激活线粒体凋亡和坏死8,11- - - - - -13]。因此,探索强大的策略,促进CSC-based治疗缺血性心肌是至关重要的。
在过去的几年里,一些实验研究已经证明,骨骨髓来源间充质干细胞(bmsc)发布专门的纳米膜小泡,称为液,改善心脏功能受损的心脏(14]。这些膜结合囊泡30 - 100 nm直径释放许多细胞类型和交付许多生物活性分子,包括小分子核糖核酸(大鹏)和长非编码rna (lncRNAs)以及营养元素。作为细胞内信使,液发挥重要作用在细胞间的沟通,确保信息从供者细胞转移到受体细胞,使细胞对环境变化做出反应(15]。最近,越来越多的研究表明,旁分泌分泌的主要作用是从bmsc释放液(称为BMSC-exos),可以改善心脏功能心肌梗塞(MI)后15,16]。此外,液可以刺激增殖,迁移,和血管生成能力二者在体外和体内,和大鹏穿梭液可能发挥重要作用在这些过程17]。
大鹏是内生,单链,由-核苷酸和编码rna基因抑制翻译中的关键角色或促进靶基因的信使rna降解18,19]。越来越多的研究表明,液可以作为车辆米尔传输和调节细胞间的沟通20.]。然而,exosomal大鹏相差很大在不同的细胞类型和病理条件下由于预处理或遗传操纵父母bmsc [21,22液),这些变化可能会完全改变靶细胞的命运。液源自干细胞培养在缺氧条件下从正常细胞修复能力大于液,微阵列和主成分分析液分泌的低氧介质强烈建议exosomal大鹏负责改变生理效应(23]。然而,很少有研究关注BMSC-exos与缺氧预处理的监管能力抵御氧化损伤条件下二者的氧化应激。此外,exosomal大鹏展翅的系统性监管和功能在保护二者在H2O2全身的氧化应激是知之甚少。
许多研究表明,mir - 214是敏感心脏压力和调节心脏损伤,这upregulation mir - 214据报道保护心肌细胞H2O2全身的伤害(24]。重要的是,内皮细胞分泌液促进内皮细胞迁移和血管生成在体外和体内通过mir - 214转移抑制突变共济失调毛细血管扩张(AT)表达在受体细胞(25]。此外,一项研究证实,mir - 214抑制NCX1和proapoptotic效应器的Ca2 +信号通路如钙/ calmodulin-dependent蛋白激酶2 (CaMKII),还有D (CypD)和荡妇11]。在这些因素中,CaMKII已成为MI, ROS-activated信号分子,调节凋亡基因表达后MI (26,27]。此外,通过CaMKII激活凋亡通路参与活性氧的生产过剩是最近发现的28,29日]。
考虑的潜在作用BMSC-exos心脏保护和mir - 214的影响调节氧化stress-mediated伤害转化水平在许多细胞类型,我们集中在调查是否mir - 214表达BMSC-exos缺氧敏感刺激和mir - 214纯度液是否起到保护作用对H2O2全身的CSC细胞凋亡和活性氧的生产和参与2 +针对CaMKII体内平衡。这些发现提供了新的见解的分子基础细胞治疗在缺血性心肌病(图1)。
(总之,骨骨髓来源间充质干细胞breakefield包含mir - 214的目标CaMKII mRNA 3UTR表达下调基因表达在接受心脏干细胞,最终导致抑制氧化应激和细胞凋亡)。
2。材料和方法
2.1。动物
Sprague-Dawley老鼠(男性和女性,大约3周大,45 - 60 g)购买和美联储在遵义医学院(遵义,中国)。根据“所有实验过程进行指导的护理和使用实验动物”在中国和被批准的当地实验动物保健和使用委员会。
2.2。材料
胶原酶II型是σ(美国)。胰蛋白酶是Gibco(美国)。从Solarbio青霉素和链霉素(中国)。火腿的/ F-12介质和胎牛血清(的边后卫)从HyClone购买(美国)。低糖杜尔贝科修改鹰的介质(L-DMEM)从Gibco(美国)。纤维母细胞生长因子是来自PeproTech(美国)。白细胞抑制因子是由Gibco(美国)。兔子anti-rat c - kit+主要抗体是由Biorbyt(英国)。m - 280珠子共轭羊anti-rabbit二级抗体来自Dynal生物技术(挪威)。PE-conjugated anti-CD34 anti-CD45, anti-CD63、anti-CD9 anti-Alix抗体买来Abcam(美国)。DiI是英杰公司(美国)。mir - 214模拟、抑制剂和炒控制合成了RiboBio(中国)。Lipofectamine 2000年从英杰公司(美国)。引物,米尔逆转录工具包,存在设备来自Sangon生物科技(中国)。Anti-pro Caspase-3, anti-cleaved Caspase-3、anti-CaMKII anti-Bax, anti-Bcl-2,反β肌动蛋白,anti-GAPDH主要抗体,和其他二次抗体获得博士德(中国)。合成核对抗CaMKII (siRCaMKII), CaMKII和消极控制RNA从GeneCopoeia (MD)。慢病毒空载体被Hanbio合成(中国)。ROS分析工具包是σ(美国),和膜联蛋白V-FITC凋亡检测设备是从Solarbio(中国)。Fluo-8购买从AAT Bioquest(美国)。超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的商业工具来自建成生物工程研究所(中国)。原位细胞死亡检测设备购买从σ(美国),和未上市的试剂均为分析纯。
2.3。隔离和c - kit的文化+二者并建立H2O2氧化应激模型
二者是孤立的17和纯化30.使用我们以前公布的方法)。老鼠深深与七氟烷麻醉和心房附件切片和消化0.1%胶原酶II型(σ,美国)。大约40分钟后(min)的消化在37°C,收集的细胞被沉积在1200 rpm 5分钟。然后,细胞从心房附件在潮湿的孵化室在火腿/ F12培养基中含有10%的边后卫,青霉素和链霉素1%,1%的谷酰胺,20 ng / ml重组人成纤维细胞生长因子,20 ng / ml白细胞抑制因子,和10 ng / ml表皮生长因子(EGF)。当细胞达到> 90%汇合,他们被胰蛋白酶化。然后,二者孵化了一只兔子anti-c-kit抗体(1:250年F12培养基)1小时(h)和排序anti-rabbit二级抗体结合到2.8μ米磁珠(Dynal生物技术、挪威)30分钟根据制造商的协议。纯化的c - kit+二者在F12培养基中培养。流式细胞术(FCM)是用来证实c - kit的表面标记+二者。后的细胞被孵化fluorochrome-conjugated主要抗体和anti-c-kit IgG-APC二级抗体(美国从BioLegend): anti-CD34-PE anti-CD45-PE, anti-c-kit。二者都暴露于100年μM H2O22 h为后续建立氧化应激条件实验。
2.4。BMSC隔离、净化和缺氧预处理
总骨髓细胞从大鼠的股骨和胫骨刷新与培养基(2 - 4);老鼠牺牲通过七氟醚过量(如前所述)(31日]。完成L-DMEM含有15%的边后卫,100 U /毫升青霉素、链霉素和100 U /毫升是用来resuspend bmsc,然后,bmsc在潮湿的孵化室。在48 h,第一媒介改变了去除不依从细胞。当细胞达到90%汇合,他们收获0.25%胰蛋白酶(σ)和通过的比率1:2。FCM BMSC表面标记进行评估。后的细胞被孵化fluorochrome-conjugated主要抗体(美国从BioLegend): anti-CD90-PE anti-CD29-APC, anti-CD45-PE。bmsc从通道(P) 3 - P5被用于后续的实验。
与缺氧细胞被刺激,细胞生存能力检测(32]。大约5×105bmsc悬浮在L-DMEM镀在150毫米直径文化菜肴。然后细胞单独培养条件下低于12,24日,48岁,72年,96年,或者120 h: 10% exosome-free与缺氧(94% N的边后卫2,5%的公司2,1%的人啊2气体混合物)。BMSC与CCK-8化验可行性进行了分析。简而言之,贴壁细胞和0.05%胰蛋白酶消化收集CCK-8试验根据制造商的指示。
2.5。净化和BMSC-Exos的识别
BMSC-exo提取过程是如前所述33]。bmsc培养在L-DMEM补充10%的边后卫,先前离心机在100000年到110000年为8到10 h消除现有bovine-derived液(9]。条件培养基(50 ml)含10% exosome-free的边后卫用于文化bmsc 48 h;的bmsc融合增长到90%,被允许成为静止12 h。镀细胞受到常氧或缺氧条件下48 h。调节后,媒体受到连续离心(最适条件xpn - 100超离心机;贝克曼库尔特SW 41 Ti转子)在10000年35分钟,去除细胞碎片和10000070分钟,其次是2洗磷酸盐(PBS) (10000070分钟)。液resuspended在20μl PBS和存储−80°C。BMSC-exos的数量是被测量的总蛋白质含量用bicinchoninic酸(BCA)蛋白质分析工具包(皮尔斯)。液是直接在透射电子显微镜下观察(TEM、日立H7500、东京、日本)。此外,BMSC-exos被西方墨点法确定与anti-CD63 anti-CD9, anti-Alix抗体(所有从Abcam购买)。
2.6。纳米粒子跟踪分析
绝对的外来体粒度分布进行了分析使用NanoSight NS300(英国莫尔文)。与纳米粒子跟踪分析(NTA),自动跟踪和粒子大小的基于布朗运动和扩散系数(34]。隔离后,液在1毫升的过滤PBS稀释。控制介质和过滤PBS被用作控制。NTA测量条件如下:温度为23.75±0.5°C,每秒25帧,60年代的测量时间。在所有样品检测阈值相似。为每个样本三个录音进行。
2.7。二者的内化DiI-Labeled液
二者都是收获,播种在fibronectin-coated盘子,一夜之间,维持在37°C。短暂,BMSC-exos标有1μg / ml DiI(美国英杰公司)如前所述15]。然后,BMSC-exos洗在PBS和离心100000×g 2 h去除游离DiI。DiI-labeled BMSC-exos (400μg / ml)被添加到CSC培养基24 h。二者被洗在PBS,固定在4%多聚甲醛,沾染了1毫克/毫升40,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)(美国表达载体)10分钟。最后,用荧光显微镜观察细胞荧光(奥林巴斯)。
2.8。转染的大鹏为二者和综合
mir - 214模拟、抑制剂和负控制rna (RiboBio,中国)转染Lipofectamine 2000(生命技术)根据既定的协议。击倒mir - 214表达,mir - 214抑制剂添加到培养基的最终浓度100海里。上调mir - 214表达,mir - 214模拟被直接添加到50纳米复合物的最终浓度。6 h posttransfection转染介质取代常规培养基。培养48 h后,细胞总RNA和蛋白质提取的收获。模仿的转染效率或抑制剂被RT-qPCR证实,和mir - 214负控制模拟和抑制剂也使用。
2.9。建设和感染CaMKII siRCaMKII慢病毒载体
CaMKII /没有3翻译区(3UTR) (Lv-CaMKII-EGFP)和siRCaMKII构造,分别插入CaMKII和siRCaMKII编码序列(马里兰州GeneCopoeia)慢病毒EGFP向量使用BamHI (FD0054)和EcoRI (N41890)限制性位点,所有获得表达载体(热费希尔科学Inc .)。慢病毒颗粒是准备使用磷酸钙方法如前所述[31日,35]。二者都与Lv-CaMKII-EGFP转染、Lv-siRCaMKII-EGFP或Lv-EGFP在2μg / ml聚凝胺(Sigma-Aldrich)感染复数(MOI) 20 48 h。48小时后,EGFP表达> 90%的感染细胞由荧光显微镜(奥林巴斯)。
2.10。逆转录和实时PCR mir - 214和CaMKII
mir - 214和CaMKII mRNA水平取决于使用定量rt - pcr作为之前报道(36,37]。短暂,总RNA提取液,SeraMir(系统生物科学)制造商的指示后,和细胞RNA提取的RNAprep纯细胞/细菌工具包(Tiangen,北京)。miR - 214含量与茎环结构量化实时PCR米尔工具包(RiboBio,中国)。米尔底漆也从RiboBio购买(中国)。孤立的RNA的纯度是由OD260/280比使用Nanodrop nd - 1000分光光度计(热科学)。孤立的rna是使用PrimeScript RT反转录试剂盒(豆类,Kusatsu、志贺、日本)。互补脱氧核糖核酸是用于定量PCR Bio-Rad实时PCR系统(美国Bio-Rad大力神,CA)使用SYBR工具包(美国Bio-Rad)。放大了5分钟的95°C,紧随其后的是40 95°C的周期10年代,30年代和55.7°C。治疗之间的表达水平的差异是计算使用以下方程: 。U6,β肌动蛋白是用作miR-21内部控制和CaMKII信使rna定量,分别。
2.11。细胞凋亡分析二者的FCM
二者preincubated有不同的治疗方法(2×109粒子/毫升)。CSC细胞凋亡水平取决于FCM使用膜联蛋白V-FITC / propidium碘(π)染色检测,其他地方报道(38]。磷脂酰丝氨酸在CSC表面水平估计与膜联蛋白从Solarbio V-FITC、π凋亡检测试剂盒(中国)根据制造商的指示。通过FACSCalibur CSC凋亡分析流式细胞分析仪(美国BD生物科学)。结果表示为凋亡细胞的比例在所有的细胞。FCM进行两次使用二者从三个独立的实验。
2.12。活性氧测定FCM的二者
细胞内的活性氧产量取决于dihydroethidium(她)(σ)染色,其次是FCM (12,39根据制造商的指示。短暂,细胞被孵化MitoSOX试剂(2.5更易/ l,英杰公司)为30分钟37°C,与PBS洗两次,使胰蛋白酶化和离心机。FCM的细胞荧光强度进行了分析。FCM进行两次使用二者从三个独立的实验。
2.13。评估在体外细胞内SOD和MDA水平
治疗后二者不同的条件,分别时,细胞内超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)水平进行评估的分析工具基于比色方法(南京建成生物工程研究所、中国)。治疗后,二者被离心收获和上层的移除。剩余的细胞被洗两次与PBS和细胞溶解在裂解缓冲30分钟在4°C。离心后,上清液用于检测SOD和MDA的水平的活动通过使用不同的分析工具如前所述的协议。BCA测试是用于量化蛋白质。
2.14。末端转移酶的dUTP尼克结束标记(TUNEL)和c - kit染色CSC的检测细胞凋亡率
一种原位细胞死亡检测工具(美国σ)是用于检测凋亡细胞的比例后,制造商的协议。细胞被固定为4%多聚甲醛和permeabilized孵化Triton x - 100的1%。50的细胞被孵化μl TUNEL每张幻灯片反应混合物(瓶1:瓶2 = 1:9)在37°C在黑暗中60分钟在湿润的气氛中然后用10%阻塞山羊血清anti-C-kit抗体孵育。细胞随后被孵化与DyLight 594 -共轭二次抗体。洗后,核与DAPI复染色。免疫荧光图像用荧光显微镜(日本奥林巴斯)。TUNEL-positive细胞的百分比确定随机领域通过荧光显微镜;每个实验进行了一式三份(40 x放大,至少6字段/样本)。
2.15。钙的测定2 +体内平衡二者的共焦激光扫描显微镜
细胞内钙2 +变化反映Ca处理。检测这些变化,我们执行Ca2 +成像实验。细胞内钙检测使用dual-excitation荧光光电倍增管系统(美国IonOptix,弥尔顿,MA)如前所述[40]。简单地说,二者都装满Fluo-8 / (0.5μ10分钟的M)解决方案,使用一个IonOptix荧光和荧光信号检测系统(美国马IonOptix,弥尔顿)。减去背景荧光后,340/380 nm比率分析了离线使用SoftEdge MyoCam®系统(美国马IonOptix,弥尔顿)。荧光发射检测从480年到520海里,和量变Fluo-8荧光强度(FFI)从FFI获得比2波长。对于基线FFI,ΔFFI(340/380)反映了细胞内钙休息2 +细胞内钙水平,增加电刺激2 +细胞内钙水平,瞬态衰减率2 +。提出了一个指数τ值作为细胞内的指标2 +间隙。
2.16。西方墨点法
免疫印迹分析二者的总蛋白进行如前所述[41]。蛋白质提取分离SDS-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和转移到PVDF膜。阻塞在一夜之间在脱脂牛奶溶液后,探讨了膜与主要抗体CaMKII, bcl - 2、Bax, procaspase-3, caspase-3裂解,β肌动蛋白,或者GAPDH。PVDF膜的孵化与辣根peroxidase-conjugated二级抗体1 h,其次是孵化与增强化学发光试剂(美国Amersham生物科学)。免疫反应性被ChemiDoc议员可视化系统(美国Bio-Rad)和蛋白质水平的规范化β肌动蛋白或GAPDH。
2.17。统计分析
学生的所有数据进行了分析t测试或单向方差分析,其次是至少显著差异(LSD)或Dunnett T3事后考验的多重比较。一个值低于0.05被认为是具有统计学意义。数据分析使用SPSS(美国IBM v.19.0)。数据均值±SD。
3所示。结果
3.1。通过二者的内化DiI-Labeled液
二者净化利用anti-rabbit二级antibody-conjugated磁珠(5,30.)与DAPI染色anti-C-kit抗体和复染色可视化细胞核。免疫荧光染色和c - kit双染色+和DAPI被发现(图2(一个))。FCM分析还显示,90.01%的细胞为c - kit是积极的,0.09%是CD45阳性,0.01%是CD34阳性(图2 (b))。超高速离心被用来获得BMSC-exos。然后,孤立的粒子的形态和表型特征根据先前描述液的特征。液是一轮cup-like形状和直径约30 - 100海里,是直接由TEM观察(图2 (c))。NTA透露,颗粒平均直径111纳米(图2 (d)在这种分析),典型的液。外来体表面标记CD63、CD9和阿历克斯被免疫印迹检测BMSC-exos(图2 (e))。这些数据表明,BMSC-exos成功纯化。
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外来体靶细胞内化的后续RNA转移的先决条件。确定BMSC-exos受到二者的内化,我们标记DiI的液。后标记BMSC-exos (400μg / ml)与二者孵化24 h与DAPI核形象化和复染色,荧光显微镜分析发现一个强大的红色荧光蓝色CSC细胞质和细胞核(图2 (f)),这表明DiI-labeled液已经成功地内化并转移到细胞核周围的CSC隔间。
3.2。缺氧预处理增强BMSC-Exos保护二者免受氧化损伤的能力
探讨监管液对二者的影响,我们从bmsc准备液在正常培养基培养(Nor-exos)或在缺氧条件下介质(Hypoxic-exos)。Exosome-free介质(Free-exos)由超高速离心消除液从正常媒介培养bmsc被用作控制。二者(> 1×109)与BMSC-exos培养(400μg / ml) 24 h,然后暴露于h2O2(100μ米2 h诱导氧化应激。FCM结果显示细胞凋亡率明显高于H和活性氧的生产水平2O2治疗组比正常组。二者使用的液表现出显著减少凋亡细胞的比例和ROS生产。此外,Hypoxic-exos诱导更多的监管效果比Nor-exos或Free-exos(数字3(一个)- - - - - -3 (d))。细胞的水平apoptosis-related基因,如procaspase-3 caspase-3裂解,伯灵顿,bcl - 2也被西方墨点法。不足为奇的是,相比之下,H2O2处理细胞,细胞治疗BMSC-exos显示大幅降低水平的裂解caspase-3和伯灵顿bcl - 2水平的提高(数字4 (e)和4 (f))。细胞内丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平,反映氧化水平,也被化验设备。在(数字4 (g)和4 (h)),与之相比,H2O2集团Hypoxic-exos抑制MDA含量,增加SOD生产。接下来,我们检查是否液保护二者对H2O2全身的DNA碎片。如(图所示4(我)和4 (j)),TUNEL-positive细胞的百分比显著增加在H2O2治疗组与正常组相比。此外,与H2O2——或者Nor-exo-treated集团TUNEL-positive细胞的百分比在Hypoxic-exo-treated组显著降低。总的来说,这些结果表明,Hypoxic-exos可能施加强大的保护作用对H2O2在二者全身的氧化损伤。
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3.3。mir - 214表达增加BMSC-Exos缺氧预处理后,从细胞凋亡可能参与保护二者
调查的内容是很重要的大鹏与潜在的生物功能在某些病理条件下液分泌。缺氧预处理的效果,mir - 214水平BMSC-exos使用RT-qPCR评估。相比,在Nor-exos, mir - 214表达显著调节与Hypoxic-exos(图3(一个))。这个结果提供了一个潜在exosomal米尔在二者目标可能会影响氧化应激损伤条件下的氧化应激。此外,mir - 214水平进行H2O2对待二者。事实上,mir - 214水平大幅下调在二者治疗H2O2(图3 (b)),这表明可能存在的消极mir - 214和H之间的联系2O2在二者全身的氧化损伤。
验证mir - 214对二者的影响,进一步确定BMSC-exos对二者的影响是mir - 214依赖,我们对待二者mir - 214抑制剂或模拟调节mir - 214的水平。Hypoxic-exos mir - 214水平也降低了转染后的bmsc mir - 214抑制剂,以及由此产生的液被称为inhibitor-exosomes (inhibitor-exos)。RT-qPCR mir - 214表达的分析表明,二者用Hypoxic-exos预处理或转染和mir - 214模拟明显获救mir - 214年的水平,而mir - 214 inhibitor-pretreated二者显示在mir - 214表达明显降低氧化应激。有趣的是,二者使用inhibitor-exos明显减少mir - 214水平(图3 (b)),这表明,mir - 214抑制剂可以中和mir - 214 upregulation Hypoxic-exos。接下来,antiapoptosis检测和调节氧化应激的影响。结果显示,Hypoxic-exos或mir - 214模拟大幅下调CSC细胞凋亡和氧化状态(包括ROS、SOD和MDA),而mir - 214抑制剂调节CSC细胞凋亡和氧化状态下的氧化应激,当然在Hypoxia-exos转染mir - 214抑制剂(inhibitor-exos)显示mir - 214抑制剂预处理可以部分中和Hypoxic-exos(人物的保护作用3 (c)- - - - - -3 (j))。此外,procaspase-3裂解caspase-3、伯灵顿和bcl - 2水平被免疫印迹检测。量化表明裂解caspase-3和伯灵顿表达水平大幅减少而细胞治疗H2O2相比之下,bcl - 2表达显著增加细胞治疗Hypoxic-exos或mir - 214模拟。mir - 214抑制剂或inhibitor-exos明显增加裂解caspase-3和伯灵顿表达,但在二者大幅减少bcl - 2表达。然而,inhibitor-exos也部分保护二者从氧化应激细胞凋亡(数字3 (k)和3(左))。这些数据证实了mir - 214的抗氧化应激作用,建议拯救下调mir - 214表达二者Hypoxic-exos是一个潜在的战略保护二者从氧化应激损伤。
3.4。mir - 214来自BMSC-Exos CaMKII蛋白表达减少
因为大鹏主要目标mRNA 3UTR调节基因的表达,我们过表达CaMKII的互补或没有3UTR证明CaMKII的目标基因在二者mir - 214。西方墨点法和RT-qPCR用来验证mir - 214模拟的效果在二者CaMKII表达式。结果表明,mir - 214模拟可以显著下调3 CaMKII的表达UTR (CaMKII3)mRNA和蛋白水平。然而,mir - 214模拟信使核糖核酸或蛋白质含量没有影响CaMKII没有3UTR(图5(一个)- - - - - -5 (c))。
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BMSC-exo-derived mir - 214的影响在二者CaMKII的表情也被评估。与正常组相比,CaMKII信使rna和蛋白质水平显著调节的H2O2集团和Hypoxic-exos集团(数据显著下调5 (d)- - - - - -5 (f)),并在二者inhibitor-exos未能抑制CaMKII表达式。此外,获得和功能丧失化验显示,mir - 214抑制剂增加CaMKII信使核糖核酸或蛋白质水平二者在氧化应激,而mir - 214模拟减少这些水平(数字5 (d)- - - - - -5 (f))。这些数据表明,exosomal mir - 214可能抑制CSC通过抑制细胞凋亡CaMKII表达式。
3.5。mir - 214来自BMSC-Exos阻止二者H2O2针对CaMKII全身的氧化损伤
检查机制负责BMSC-exo-derived mir - 214的抗凋亡作用在二者针对CaMKII,我们在二者过表达或抑制CaMKII表达式,分别通过慢病毒表达CaMKII包含3UTR (CaMKII3)或SiRCaMKII包含3UTR (siRCaMKII3)。CaMKII3转染调节CaMKII信使rna和蛋白质含量在二者接触H2O2,而SiRCaMKII3转染显著下调CaMKII蛋白质和mRNA水平二者(数字6(一)- - - - - -6 (c))。接下来,膜联蛋白V /π化验是用来检测通过CaMKII Hypoxic-exos途径的凋亡效应。凋亡细胞的比例在CaMKII3更高比Hypoxic-exos或SiRCaMKII3集团组。有趣的是,凋亡细胞的比例增加Hypoxic-exos + Lv-CaMKII3组,而这是inhibitor-exos + SiRCaMKII3显著下降(数据6 (d)和6 (e))。此外,TUNEL-positive细胞的百分比在每组的凋亡趋势观察膜联蛋白V / PI分析(数据7(一)和7 (b))。
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(g)
(h)
检测细胞内ROS生产,我们接触细胞与不同的条件和使用FCM H2DCFDA,一种荧光探针能够与几个ROS。正如预期的那样,我们发现在荧光显著增加H2O2组。Hypoxic-exos和SiRCaMKII3组显示显著降低ROS水平。有趣的是,CaMKII3超表达诱导显著增加在CSC ROS荧光水平。此外,ROS荧光在Hypoxic-exos + Lv-CaMKII3调节集团和inhibitor-exos + SiRCaMKII3表达下调集团(数据6 (f)和6 (g))。分析了SOD和MDA在二者作为抗氧化酶活性的指标。如(图所示7 (e)),SOD的H2O2全身二者组明显低于正常,而SOD水平二者对待Hypoxic-exos siRCaMKII3高于H2O2组。此外,SOD水平与CaMKII3细胞转染降低与Hypoxic-exos组。更重要的是,作为展出(图7 (f)),二者的感应H2O2导致海拔MDA,从Hypoxic-exos和siRCaMKII3明显不同组。然而,MDA水平二者与CaMKII3转染与Hypoxic-exos组相比显著增加。
我们也探讨apoptosis-related蛋白质免疫印迹在二者的表达。相比之下,Hypoxic-exos或CaMKII3沉默,CaMKII3超表达显著增加proapoptotic蛋白的表达裂解caspase-3和伯灵顿,然后减少凋亡蛋白bcl - 2的表达。值得注意的是,CaMKII3超表达部分逆转的影响Hypoxic-exos caspase-3,伯灵顿,和bcl - 2表达,证明了caspase-3和伯灵顿表达的增加和减少bcl - 2表达。此外,inhibitor-exos + SiRCaMKII组显示表达下调caspase-3和伯灵顿bcl - 2表达水平和调节水平(数字7 (c)和7 (d))。考虑到监管CaMKII的影响和mir - 214 Ca2 +体内平衡,我们也发现Ca2 +在二者荧光强度。的价格相比H2O2或CaMKII3组织细胞内钙荧光强度2 +显著减少Hypoxic-exos还是siRCaMKII3集团(数据7 (g)和7 (h))。此外,相比之下,inhibitor-exo + SiRCaMKII3对待二者,Hypoxic-exo + CaMKII3对待二者明显增加钙荧光显示。这些数据表明,在氧化应激,Hypoxic-exos保护二者从细胞凋亡,ROS生产过剩,Ca2 +抑制CaMKII体内平衡的破坏。
3.6。液源自mir - 214 -修改bmsc保护二者通过CaMKII从细胞凋亡在氧化应激
进一步确定BMSC-exos对二者的影响依赖于mir - 214,我们用mir - 214模拟转染bmsc,抑制剂,或消极控制RNA。在48 h posttransfection,细胞外液被隔绝bmsc用缺氧预处理和添加到二者在氧化应激2 h。显然,相比之下,在Hypoxic-exos, mir - 214显著调节mir - 214 mimic-modified BMSC-exos (mimic-exos), mir - 214大幅下调的时候在inhibitor-exos(图8(一个))。接下来,CaMKII信使核糖核酸或蛋白质水平检测到RT-qPCR或免疫印迹。与Hypoxic-exos或mimic-exos相比,inhibitor-exos调节CaMKII mRNA和蛋白水平在二者接触到H2O2(数据8 (b)- - - - - -8 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
(我)
(j)
(k)
(左)
(m)
(n)
膜联蛋白V /π分析被用来识别mimic-exos的抗氧化损伤作用。相比之下,H2O2集团Hypoxic-exos和mimic-exos组表现出大幅减少细胞凋亡,而inhibitor-exos组升高细胞凋亡(数字显示8 (e)和8 (f))。正如预期的那样,TUNEL-positive细胞的百分比在每组的凋亡趋势观察膜联蛋白V / PI化验(数字8 (g)和8 (h))。ROS的产生和细胞内SOD和MDA水平测量确认进一步BMSCs-exos的抗氧化能力。在H2O2集团生产ROS、MDA的急剧增加与正常组相比,而SOD水平非常减少。相比之下,尽管Hypoxic-exos和mimics-exos预处理明显减弱活性氧的增加,MDA和SOD的降低。此外,ROS、MDA显著增加在inhibitor-exos组相比Hypoxic-exos组。相比之下,Hypoxic-exos和mimics-exos大幅度增加SOD水平。相对地,inhibitor-exos显著抑制SOD在二者(数字8(我),8 (j),8 (m),8 (n))。
西方墨点法Apoptosis-related蛋白被发现。事实上,相比之下,H2O2处理细胞,mimics-exo-treated二者显示大幅减少的表达proapoptotic蛋白质裂解caspase-3伯灵顿和bcl - 2抗凋亡蛋白的表达增加,而inhibitor-exo-treated细胞显示了相反的结果,证明了增加caspase-3和伯灵顿水平,减少bcl - 2水平(数字8 (k)和8(左))。在一起,这些数据显示,体外,CSC的exosome-mediated刺激细胞凋亡和氧化状态依赖mir - 214表达exosome-producing细胞,和mir - 214损耗降低这些受体细胞功能的影响。
4所示。讨论
二者已经被证明能够分化成心肌细胞和分泌多种生物活性分子(2,5),这些细胞是重要的候选心脏再生疗法(4]。积累实验和临床数据表明,CSC移植能有效治疗心肌梗死(8,42]。然而,过继转移后,二者遇到各种不受欢迎的条件(包括氧化应激和炎症反应17,43]。病理刺激引起线粒体功能破坏,从而导致过度ROS生成;ROS反过来恶化线粒体功能障碍和增强线粒体凋亡激活以积极的反馈循环(44),降低细胞生存能力,从而影响治疗活动。bmsc的旁分泌作用一直被视为一个关键的心脏保护机制(14,45]。压力激发了外来体释放的重要因素之一调停bmsc之间的串扰和周围的细胞,这可能是参与维持原位干细胞体内平衡和促进干细胞移植(15,20.,46]。在目前的研究中,我们得到,double-membraned囊泡直径30 - 100 nm从BMSC-conditioned媒介使用超高速离心。这些囊泡决心表达特定外来体蛋白质标记和由二者内化,表明这些液在二者中扮演角色的转移货物。
近年来,许多研究都集中在缺氧BMSC利基。缺氧BMSC预处理可以降低低氧诱导的细胞死亡(47]。一些研究人员还发现,bmsc释放液在低氧的情况下,导致neoangiogenesis体外和体内和增强心脏功能15]。然而,液是否发布的bmsc缺氧预处理后增加了有利影响CSC监管在氧化应激条件下仍然未知。主要在线粒体氧化应激产生的ROS,可以确定病理生理学的重要的心血管疾病的临床表现48]。H2O2导致氧化应激,这可能会导致细胞损伤(49]。在这项研究中,我们发现,H2O2细胞凋亡率增加,二者的活性氧产量。此外,二者使用液表现出大幅减轻反应。此外,Hypoxic-exos比Nor-exos更大的监管效果。这可能是由于在米尔表达谱改变液在体外暴露bmsc病理条件(50];exosomal米尔内容动态监管的其他类型的干细胞后暴露在缺氧,这种差异在生理反应并没有由于外来体大小,总RNA含量,或蛋白质含量,因为这些值相似的外来体中不同群体(23]。
大鹏很小,非编码rna块翻译或诱导信使rna降解,从而控制基因表达模式(18]。我们专注于mir - 214,这是表示在低水平二者在活性氧的生产和抗氧化的作用。有趣的是,我们表明,缺氧不仅增加了液的抗凋亡作用条件BMSC培养基也改变了exosomal mir - 214的水平。我们的研究结果还表明,氧化应激减少二者,mir - 214水平表明mir - 214可能的一个关键因素调节CSC函数在氧化应激和暗示mir - 214浓缩为未来proregenerative研究可能是一个有趣的领域。我们建立了体外mir - 214获得,丧失模型来评估mir - 214细胞凋亡的影响,发现调节mir - 214有效地减少CSC细胞凋亡和活性氧的生产水平。此外,我们发现液源自hypoxia-treated bmsc显示能力强在受体细胞增加mir - 214年的水平。有趣的是,mir - 214 bmsc的消耗会使低氧诱导exosomal mir - 214的水平。然而,inhibitor-exos部分逆转在受体细胞功能影响,可能是因为BMSC-exos包含各种类型的大鹏展翅,包括mir - 214。如果在Hypoxic-exos米尔水平增加,这些大鹏将转移到受体细胞,提升为发挥生物学作用主要通过他们的目标基因23,51,52]。因此,我们的数据显示一个错综复杂的exosome-mediated相声bmsc和二者之间调节氧化损伤,至少部分,通过mir - 214。
米尔细胞可以激活接受者之间转移细胞产生一系列生物学效应通过抑制米尔目标基因。NCX1, CaMKII CypD,女子受mir - 214在许多细胞类型(11]。调控这些基因是至关重要的细胞增殖,凋亡和Ca2 +体内平衡(53]。mir - 214基因敲除小鼠(KO), CaMKII水平已报告为额外增加心肌细胞损失。mir - 214可能是心血管和目标CaMKII各种应力条件下(11]。有趣的是,一些研究发现,CaMKII可能作为一种新颖的调节蛋白增强心脏祖细胞生存在心脏组织54]。进一步确认是否CaMKII也是一个目标基因在二者mir - 214,我们中cDNA CaMKII有或没有3UTR。同时,我们在这些二者中mir - 214模拟,发现mir - 214模拟可以显著下调3 CaMKII的表达UTR mRNA和蛋白水平。尽管如此,mir - 214对信使核糖核酸或蛋白质含量没有影响CaMKII没有3UTR。结果间接证实,mir - 214主要目标CaMKII mRNA 3UTR调节基因表达。此外,我们获得和执行功能丧失的研究,发现二者,CaMKII信使rna和蛋白质水平调节氧化应激反应,增加和mir - 214抑制剂而mir - 214模拟二者CaMKII信使rna和蛋白质含量下降。重要的是,CaMKII蛋白质含量明显Hypoxic-exos组中表达下调,而inhibitor-exos未能抑制CaMKII二者的表达。基于这些结果,调节mir - 214有效地减少CSC细胞凋亡和氧化应激水平,和CaMKII负受mir - 214表达氧化应激二者。
地址是否CaMKII信号负责exosome-mediated凋亡的影响,我们通过合成中也是CaMKII CaMKII(包含3UTR)慢病毒载体和阻塞CaMKII CaMKII-targeting核(包含3UTR)二者与液预处理细胞后。我们发现,氧化应激和细胞凋亡减少Hypoxic-exo-pretreated或CaMKII-silenced二者。CaMKII超表达部分逆转这些Hypoxic-exo-induced凋亡和氧化应激的影响。显然,抑制CaMKII阻止H2O2全身的伤在二者用inhibitor-exos预处理。CaMKII通路参与抑制细胞凋亡,调节Ca2 +体内平衡和促进细胞增殖53]。mir - 214 -介导的Ca2 +信号处理和基因调控是重要的贡献者各种心脏疾病的病理生理学(11]。考虑到CaMKII对Ca的影响2 +体内平衡调节,我们也发现Ca2 +在二者荧光强度,发现Ca2 +荧光强度增加氧化应激反应在Nor-exos的存在,和Hypoxic-exos siRCaMKII Ca下降2 +荧光强度,符合凋亡的影响。CaMKII超表达部分逆转Hypoxic-exo-induced对Ca的影响2 +体内平衡调节。此外,inhibitor-exos减少Ca2 +荧光强度而阻塞CaMKII的水平。进一步确定这些BMSC-exos对二者的影响mir - 214 -依赖,我们培养二者mimic-exos。相比之下,在H2O2处理细胞,mir - 214在mimic-exo-treated细胞表达明显调节。相比之下,mir - 214 inhibitor-exo-exposed细胞表达显著下调。与Hypoxic-exos或mimic-exos相比,inhibitor-exos调节CaMKII mRNA和蛋白水平在二者接触到H2O2。此外,Hypoxic-exos mimic-exos大大减少凋亡细胞的比例和氧化应激水平二者,而inhibitor-exos导致相反的效果。这些发现强烈建议CaMKII exosomal mir - 214的潜在因素介导细胞的保护。
它已经表明,液调节细胞间的沟通,如基质细胞之间的串扰和乳腺癌细胞(55和间充质干细胞和内皮细胞之间56]。无论如何,我们理解外来体生物起源和内吞作用是不完整的,以及液是否明确承认他们的受体细胞仍然需要深入探讨。在我们的研究中,二者用BMSCs-exos预处理时,液效率高,拍摄和exosomal mir - 214转移到二者,参与细胞信号通路。这种转移成功诱导下游反应和减少CaMKII表达,细胞凋亡,氧化应激和Ca2 +二者的内稳态的破坏。
总之,BMSC-exos用缺氧预处理有效抑制氧化应激下CSC凋亡改变mir - 214 / CaMKII通路。虽然我们的数据表明,BMSC-derived exosomal mir - 214中扮演着一个关键的角色在受体细胞的凋亡调控,在这项研究有一些局限性。我们不能排除其他exosomal货物的贡献。值得注意的是,BMSC-exos包含各种类型的大鹏展翅,包括mir - 214;此外,mir - 214的目标不止一个基因,CaMKII不是唯一的通路的下游mir - 214。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
伦理批准
根据“所有实验过程进行指导的护理和使用实验动物”在中国和被批准的遵义医学院实验动物保健和使用委员会。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突存在关于这篇文章的发表。
作者的贡献
王燕和赵Ranzun同样这项工作。
确认
这项工作是由中国国家自然科学基金的资助(批准号81760042)。