文摘
自噬机制的角色防御微生物等白色念珠菌。Lipidated LC3,自噬的标记蛋白,参与消除白念珠菌通过形成一个single-membrane吞噬体;这个过程称为LC3-associated吞噬作用(圈)。然而,的影响白念珠菌在自噬流量还不清楚。在这项研究中,我们发现白念珠菌在巨噬细胞抑制LC3营业额。吞噬作用后白念珠菌在巨噬细胞中,我们观察到更少的吖啶orange-positive液泡和RFP-GFP-LC3 puncta没有colocalization吞噬白念珠菌。然而,吞噬作用白念珠菌导致LC3招聘,但p62和ATG9A没有colocalize LC3或白念珠菌。这些效应是由于一个MTOR-independent通路。然而,我们发现白念珠菌模式分子模式β葡聚糖LC3营业额增加。此外,吞噬作用白念珠菌BrdU公司减少造成的。阻断自噬通量加剧了这一效应。我们的研究表明,吞噬作用白念珠菌减少自噬流量但在巨噬细胞MTOR-independent地诱发的大腿上。占领LC3的招聘吞没了白念珠菌可能有助于抑制自噬流量。我们的研究强调了协调机械规范自噬和大腿上,可以保护身体免受之间白念珠菌挑战。
1。介绍
虽然白念珠菌是一个正常的人类微生物区系成分在皮肤和口腔、肠道和阴道感染,这种生物会增加发病率和死亡率。这是第四医院血流感染最常见的原因(1,2]。使用免疫抑制剂和留置医疗设备、器官移植和艾滋病毒感染的概率增加白念珠菌感染,可能导致危及生命的疾病(3]。吞噬作用是细胞生理过程,吞噬病原体和降解时间(4]。作为一个主要的免疫细胞来控制人口白念珠菌感染巨噬细胞可以通过吞噬和清除真菌产生促炎细胞因子在认识到其表面的分子模式(PAMP时)表示白念珠菌墙由模式识别受体(PRRs) (5]。
最近,研究人员与自噬的间隙,微生物包括病毒、细菌和真菌生物(6,7]。自噬不仅是一个过程,维持细胞内稳态和新陈代谢,也是反的主要监管机构白念珠菌免疫(8- - - - - -12]。例如,ATG7或ATG5突变体显示敏感性增加白念珠菌系统后,增加死亡率白念珠菌感染(8,13]。值得一提的是,microtubule-associated蛋白质1轻链3 (LC3)的标记蛋白macroautophagy(称为自噬),参与消除白念珠菌通过形成一个single-membrane吞噬体。这个过程称为LC3-associated吞噬作用(一圈)14),它的机械是有别于规范化自噬的过程。发现Dectin-1, c型凝集素受体,诱发LC3的招聘时间;麦克米兰和活性氧(ROS)的生产需要酿酒酵母- - -β葡聚糖粒子诱导的大腿上酿酒酵母可以增加骨骨髓来源树突状细胞在Syk-dependent方式(9,15]。此外,研究发现,诱导自噬的吞噬作用降低酿酒酵母在小鼠巨噬细胞16]。然而,的影响白念珠菌规范自噬过程不清楚,自噬和圈之间的关系是不确定的。
一般来说,机械的雷帕霉素靶(MTOR)是一个蛋白激酶调节规范自噬中起着至关重要的作用[17]。MTOR参与MTOR的形成复杂1 (MTORC1)和MTOR复杂2 (MTORC2) [18,19]。这两个配合物利用不同基质和唤起不同的下游信号调节细胞功能。MTORC1激活unc-51-like磷酸化的激酶1 (ULK1)蛋白质和负调节自噬。MTORC2的功能并不完全理解,但它被认为控制MTORC1信号通路,促进自噬(20.,21]。自噬可以发生在MTOR-independent方式。经典的自噬监管机构如beclin-1和第三类PI3K-associated蛋白质卢比孔河被发现参与白念珠菌全身的大腿上(22,23]。然而,至关重要的自噬调制器MTOR的作用和如何调节自噬或搭在上下文中的巨噬细胞白念珠菌刺激仍不清楚。
澄清规范化自噬调节巨噬细胞的吞噬作用白念珠菌,我们确定LC3营业额,RFP-GFP-LC3 puncta和吖啶橙(AO)积极THP-1-derived巨噬细胞中液泡的形成挑战白念珠菌孢子。此外,我们发现LC3 colocalization和自噬p62等监管机构,ATG9A,卢比孔河经过吞噬作用的白念珠菌在巨噬细胞。此外,我们化验MTOR信号调节自噬是否THP-1-derived巨噬细胞吞噬白念珠菌。最后,我们探讨了潜在的自噬的作用白念珠菌刺激。
2。材料和方法
2.1。白念珠菌菌株
白念珠菌(从中国医学真菌菌种保藏中心)在SDA培养基培养(2%葡萄糖、蛋白胨1%和1.5%琼脂)一夜之间在28°C获得酵母细胞。这些细胞被洗两次磷酸盐(PBS)和heat-killed 30分钟56°C。在所有实验中(除非另有说明),死亡的微生物被用来避免酵母之间的差异率的变化和巨噬细胞增长的条件。Calcofluor白色(CFW)定位的分析是一个有用的工具白念珠菌(24]。我们使用CFW,展品荧光当暴露于紫外线,污渍白念珠菌。
2.2。细胞
人类单核细胞细胞系THP-1(写明ATCC矿- 202,马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)是生长在rpmi - 1640生长培养基(美国纽约Gibco,大岛)补充10%胎牛血清的边后卫(Gibco), 100国际单位/毫升青霉素和100年μg / mL链霉素溶液调湿大气的5%股份2在孵化器37°C。THP-1-derived巨噬细胞是macrophage-like细胞所产生的治疗phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)48小时。然后,这些细胞被放置在一个没有PMA的媒介。
小鼠macrophage-cell线生264.7(写明ATCC矿- 71,马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)在DMEM培养(Gibco)补充10%的边后卫,100国际单位/毫升青霉素和链霉素100μg /毫升溶液调湿孵化器在37°C和5%的公司2。每3天刷新生长介质。当细胞达到70% -80%融合,他们对待不同的刺激。
2.3。老鼠和BMDM文化
C57BL / 6野生型小鼠(WT)维持在特定无菌设施系统研究所的医学(苏州、中国)。所有动物研究小组委员会批准的协议下进行动物系统研究所的医学中心。
2.4。骨骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)隔离和文化
骨髓细胞从6至收获9-week-old C57BL / 6小鼠通过冲洗股骨和胫骨与PBS和被培养在分化培养基(包含10%的边后卫,DMEM 50 ng / mL鼠标- csf (Meltenyi, Bergisch格拉德巴赫,德国)、青霉素100单位/毫升和100年μg / mL链霉素溶液)7天。分化中每3天了。BMDMs 12-well组织培养板(5×105细胞/)治疗与生活白念珠菌巨噬细胞孢子(10:1、真菌)。
2.5。试剂和抗体
在这项研究中使用的化合物包括e - 64 d (E8640),抑肽素(P5318),雷帕霉素(V900930),氯喹(C6628)、二甲亚砜(D2650)和吖啶橙(AO A8097)(都来自Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。其他化合物包括pp242(美国Abcam、剑桥、马)和torin1 (Tocris,英国布里斯托尔)。主要包括抗体anti-LC3A / B(编号为12741),反β肌动蛋白(编号为8457),anti-MTOR(编号为2983),anti-phospho-MTOR Ser2448(编号为5536),anti-phospho-MTOR Ser2481(编号为2974),anti-Rictor(编号为2114),anti-phospho-Rictor Thr1135(编号为3806),anti-Raptor(编号为2280),anti-phospho-Raptor Ser792(编号为2083),anti-4E-BP1(编号为9644),anti-phospho-4E-BP1 Thr37/46(编号为2855),anti-PKCα(编号为2056),anti-phospho-PKCαThr638(编号为9375),anti-phospho-ULK1 Ser555(编号为5869),anti-phospho-ULK1 Ser757(编号为6888),anti-ULK1(编号为4773),anti-phospho-p70 S6激酶Thr389(编号为9234),anti-p70 S6激酶(编号为2708),anti-phospho-S6核糖体蛋白Ser240/244(编号为5364),anti-phospho-S6核糖体蛋白Ser235/236(编号为4858),anti-caspase-3(编号为9665),和anti-rabbit免疫球蛋白(HRP-linked)(7074)(所有从细胞信号技术,丹弗斯,妈,美国)。647卢比孔河抗体(ab156052) ATG9A-Alexa萤石(ab206253),从Abcam购买。Alexa萤石647山羊anti-rabbit (A21245)和Alexa萤石568山羊anti-mouse (A11031)购买从热费希尔科学(美国沃尔瑟姆,MA)。
2.6。西方墨点法
细胞细胞溶解在里帕裂解缓冲含有蛋白酶抑制剂的鸡尾酒和磷酸酶抑制剂PhosSTOP(来自罗氏应用科学、巴塞尔、瑞士)。蛋白质浓度测定采用BCA分析工具包(Beyotime生物技术、海门、江苏、中国)。等量的蛋白质来自不同样本煮和装上4 - 15% SDS-polyacrylamide凝胶(Bio-Rad实验室、大力神、钙、美国)。蛋白质被转移到PVDF膜(美国默克密理博,Billerica的),阻止了5%的牛血清白蛋白(BSA)(美国AMRESCO,梭伦,哦)在室温下,和彩色显示抗体。使用化学发光蛋白质乐队是可视化。乐队强度量化的使用数量。β肌动蛋白作为加载控制。
2.7。AO染色试验
AO染色试验用于标签酸性泡状细胞器(AVO)。酸性隔间将发出红色,而DNA结合AO和发出绿色的。的意思是红/绿荧光比率是用来检测自噬水平。具体的治疗后,细胞与PBS洗两次,孵化与AO (5μ克/毫升10分钟)在室温下。图像采集与奥林巴斯FV1000激光扫描共焦显微镜(格林:λ前女友= 488海里,λ新兴市场= 515海里;红色:λ前女友= 546海里,λ新兴市场= 620海里)。红色和绿色荧光细胞的强度取决于数量。
2.8。免疫荧光分析
RFP-GFP-LC3B, GFP-LC3B RFP-p62转基因使用普莱默电子被转染到细胞自噬传感器BacMam 2.0系统RFP-GFP-LC3B工具包(P36239,英杰公司集团,卡尔斯巴德、钙、美国),LC3B-GFP (P36235,英杰公司公司)和p62-RFP (P36241,英杰公司公司)根据制造商的指示。RFP-GFP-LC3B可以区分自噬体和自吞噬泡,因为acid-sensitive GFP荧光损失后自噬体与溶酶体融合和pH值下降,而RFP酸不敏感和维护积极的自噬体和自吞噬泡。LC3B-GFP用于观察LC3B的一般位置。氯喹(CQ)是用来评估的灵敏度THP-1-derived巨噬细胞系统。在检测之前,细胞转染至少24小时。GFP扫描,λ前女友= 488海里,λ新兴市场= 508海里;招标书扫描,λ前女友= 555海里,λ新兴市场= 584海里。LysoTracker探针(热费希尔科学、L12492)被添加到培养基在50 nM,和细胞孵化30分钟37°C (λ前女友= 647海里,λ新兴市场= 668海里)。细胞成像使用奥林巴斯FV1000激光扫描共焦显微镜。
2.9。ROS化验
ROS生产确认使用ROS检测设备(Beyotime生物技术)。细胞培养在37°C和5% 12-well板有限公司2。治疗后,10μM DCFH-DA(在无血清培养基稀释)添加到细胞,这是孵化20分钟37°C。细胞被胰蛋白酶化收获和PBS洗两次。样本化验流式细胞分析仪使用488 nm激光激发和探测到525海里。Rosup (50μg / mL)作为阳性对照。
2.10。膜联蛋白V-FITC和Propidium碘(PI)染色流式细胞术
THP-1-derived巨噬细胞的凋亡被发现使用一个膜联蛋白V-FITC凋亡检测设备通过流式细胞术(Beyotime生物技术)。治疗后,这些细胞被洗冷PBS。细胞是在绑定缓冲resuspended 1×10的浓度6细胞/毫升。5μ和10 L的膜联蛋白V-FITC染色的解决方案μL (PI染色溶液添加,然后轻轻地涡旋状的混合,孵化20分钟在黑暗中在室温下。400年μL(绑定缓冲被添加到每个管,并立即分析了细胞通过流式细胞术BD FACSVerse™。结果分析软件FlowJo土壤质素。早期凋亡细胞的膜沾膜联蛋白V-FITC。细胞凋亡或死亡是沾染了π和年末膜联蛋白V-FITC。早期凋亡细胞的比例计算从三个独立的实验。
2.11。BrdU公司化验
使用BrdU BrdU标记做了化验设备(罗氏、巴塞尔、瑞士)。治疗后8小时,细胞与10孵化μM BrdU标签解决方案(在培养基稀释)4小时37°C。我们把标签解决方案和协议后根据指令。我们读492 nm和370 nm的吸光度。
2.12。数据分析
在不同的时间进行独立的实验。从至少三个独立的实验也获得了类似的调查结果进行统计分析。数据分析使用单变量方差分析或学生的t以及。统计学意义是 。
3所示。结果
3.1。白念珠菌264.7治疗抑制自噬流量THP-1-Derived巨噬细胞和原始细胞
LC3的胞质形式(LC3-I)转化为phosphatidylethanolamine-conjugated形式(LC3-II)在自噬25]。因此,LC3通常是作为分子标记监测自噬水平。新LC3-II蛋白质聚集在自噬体膜的自噬体与溶酶体融合后的退化。监控自噬流量,我们测量LC3-II积累治疗后白念珠菌存在与否的几个溶酶体抑制剂,包括e - 64 d +抑肽素,CQ, NH4Cl和baflomycin-A1 (BAF-A1),阻断自噬流量在最后一步。选择优化的治疗时间是很重要的条件。因为吞噬作用白念珠菌预计将达到峰值,1 - 3 h和完成在6 - 8 h后刺激白念珠菌在巨噬细胞26),所以我们检测时间点设置为2 h和8 h后特定的刺激。我们发现LC3-II积累的水平(LC3-II /加载控制β肌动蛋白)增加与溶酶体抑制剂CQ THP-1-derived巨噬细胞治疗后,e - 64 d +抑肽素,NH4Cl或BAF-A1 2小时或8小时,表明基底自噬水平。有趣的是,LC3-II积累与heat-killed THP-1-derived巨噬细胞显著减少的挑战白念珠菌在CQ面前,e - 64 d +抑肽素,NH4Cl或BAF-A1 8小时而独自与这些溶酶体抑制剂细胞孵化。这一发现表明,白念珠菌在自噬流量减少LC3-II营业额(数字1(一)- - - - - -1 (d))。此外,我们发现白念珠菌刺激减少LC3-II积累原始264.7细胞(鼠标macrophage-like细胞株)在NH的存在4Cl或BAF-A1,而与NH细胞治疗4Cl或独自BAF-A1(数字1 (e)- - - - - -1 (f))。这些数据验证结果在人类细胞系。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
AO可以染色酸性液泡,包括溶酶体和autophagolysosomes。它用于自噬检测作为补充方法监测自噬(27]。我们发现e - 64 d和抑肽素治疗8个小时增加了红/绿荧光比例THP-1-derived巨噬细胞。有趣的是,红/绿荧光比率下降THP-1-derived巨噬细胞与挑战白念珠菌在e - 64 d和抑肽素相比,细胞处理e - 64 d和抑肽素。这些数据表明白念珠菌减少autophagolysosomes的形成(图2(一个))。
(一)
(b)
串联RFP-GFP-LC3B试验是用于分析自噬流量和可视化货物使用荧光显微镜结构。GFP荧光猝灭是低pH值,和RFP更加稳定,所以GFP和RFP荧光表明自噬小体的存在,没有与溶酶体融合(28]。我们发现CQ治疗8小时的数量增加RFP puncta, GFP puncta和合并RFP-GFP puncta THP-1-derived巨噬细胞相比,控制细胞,这表明自噬流量CQ阻塞。我们观察到显著的吞噬作用白念珠菌在THP-1-derived巨噬细胞染色calcofluor白色(CFW)。重要的是,RFP-GFP puncta吞噬周围在场白念珠菌THP-1-derived巨噬细胞,RFP-GFP puncta独立的白念珠菌是罕见的。虽然我们仍然观察到RFP-GFP puncta THP-1-derived巨噬细胞被质疑白念珠菌CQ的存在,RFP-GFP puncta独立的白念珠菌是比仅在细胞治疗与CQ罕见。上述结果表明,蛋白LC3招募为绑定吞噬白念珠菌(图2 (b))。
3.2。白念珠菌在THP-1-Derived巨噬细胞治疗诱发的大腿上
我们的数据表明,白念珠菌刺激导致LC3-II积累减少,而LC3吞噬周围明显招募白念珠菌。一般来说,LC3聚合表明自噬。我们推测,感应LC3-associated吞噬作用导致了矛盾的数据。因此,我们发现LC3的colocalization autophagy-associated蛋白质确定LC3的招聘白念珠菌参与了一圈或规范自噬调控。当前知识是LC3、beclin-1 PtdIns3KC3,和Atg12-Atg5-Atg16L所需的腿上,虽然p62, ATG9, ULK1不需要圈(23,29日]。p62 LC3和自噬基质之间的联系,发送完成自噬体与溶酶体融合(30.]。ATG9是一个重要的ATG (autophagy-related基因)蛋白参与自噬体形成和显示偏colocalization LC3 [31日]。我们发现CQ治疗导致的重大colocalization GFP-LC3 RFP-p62。在THP-1-derived巨噬细胞与挑战白念珠菌的招聘,我们观察到LC3在吞噬白念珠菌没有p62或ATG9参与(数字3(一个)和3 (b))。
(一)
(b)
(c)
(d)
我们验证白念珠菌可以在野生型骨诱导圈来源于C57BL / 6小鼠的巨噬细胞(BMDMs)。在这个试验,溶酶体与溶酶体追踪标记,和LC3使用免疫荧光和卢比孔河可视化。我们观察到增加colocalization LC3和溶酶体吞噬白念珠菌在BMDMs(图3 (c)),这表明LC3-associated运输到溶酶体。此外,卢比孔河和溶酶体吞噬白念珠菌是与(图3 (d))。考虑到关键作用的卢比孔河圈过程中,我们的研究结果表明的吞噬作用白念珠菌在巨噬细胞激活的大腿上。
这些数据表明,吞噬作用白念珠菌感应圈,导致重要的招聘LC3在吞噬白念珠菌中p62 ATG9-independent方式,但这吞噬活动抑制规范化自噬过程和减少LC3的聚集和p62。
3.3。白念珠菌挑战可以抑制自噬流量通过MTOR-Independent机制
雷帕霉素是一种广泛使用的MTOR-dependent自噬诱导物。我们发现雷帕霉素治疗的磷酸化水平降低MTOR Ser2481 1和MTOR复杂基质如p70 Thr389 S6激酶,在Ser 240/244 S6核糖体蛋白,4 e - bp1 Thr37/46。这些数据表明,MTOR通路对雷帕霉素治疗(图很敏感4(一))。此外,雷帕霉素LC3-II水平调节的e - 64 d和抑肽素e - 64 d和抑肽素相比,仅表明雷帕霉素增强THP-1-derived巨噬细胞自噬流量。有趣的是,白念珠菌挑战不增加MTOR的磷酸化或其底物或逆转rapamycin-inhibited MTOR信号。重要的是,LC3-II积累在细胞减少的挑战白念珠菌在雷帕霉素,e - 64 d,并与雷帕霉素治疗的病人相比抑肽素,e - 64 d,抑肽素(图4(一)),这表明白念珠菌禁止rapamycin-enhanced自噬流量MTOR-independent地挑战。因此,我们的数据表明,MTORC1通路没有参与白念珠菌全身的自噬流量下降。此外,我们发现LC3-II水平增加细胞治疗白念珠菌在雷帕霉素,e - 64 d,抑肽素相比对待白念珠菌在e - 64 d和抑肽素的存在,表明雷帕霉素获救略白念珠菌抑制自噬流量。
(一)
(b)
(c)
两个MTOR torin1 pp242,被用来确认是否白念珠菌刺激影响MTORC1和MTORC2的活动(32,33]。我们发现torin1和pp242抑制MTORC1的磷酸化水平(包括ULK1 Ser757, 4 e - bp1 Thr37/46, p70 S6激酶在Thr389和S6 Ser240/244核糖体蛋白)和MTORC2(包括Rictor Thr1135和蛋白激酶C在Thr638)和增加LC3-II积累。这一发现表明,torin1和pp242都可以诱发MTOR-dependent自噬在THP-1-derived巨噬细胞(数字4 (b)和4 (c))。通过这些分析,我们进一步验证白念珠菌没有增加MTORC1的活动。此外,白念珠菌刺激没有增加Rictor Thr1135或的磷酸化蛋白激酶C在Thr638,也没有禁止torin1——或者pp242-induced磷酸化的抑制MTOR复合物1或2(数字4 (b)和4 (c))。此外,LC3-II积累(e - 64 d和抑肽素)在THP-1-derived减少巨噬细胞刺激白念珠菌在torin1或pp242单独细胞接受torin1或pp242相比,表明白念珠菌torin1——或pp242-enhanced自噬流量下降。综上所述,白念珠菌挑战减少THP-1-derived巨噬细胞的自噬MTOR-independent方式。
3.4。β葡聚糖治疗增加THP-1-Derived巨噬细胞自噬流量
Kyrmizi et al。34)报道,β葡聚糖表面接触来自烟曲霉属真菌分生孢子激活的大腿上。的主要组件白念珠菌细胞壁,β葡聚糖被认为是主要的PAMP时(35]。它是最初的刺激巨噬细胞识别和吞噬的时候白念珠菌。证据表明,β葡聚糖是参与白念珠菌全身的大腿上(9]。
有趣的是,我们发现β葡聚糖治疗增加了存在BAF-A1或NH LC3-II水平4Cl与细胞治疗BAF-A1或北半球4独自Cl(图5)。这些数据表明,β葡聚糖LC3-II积累增加,这一发现是完全与我们的结果对于细胞治疗白念珠菌在这项研究中。的发现β葡聚糖可以增加LC3-II级别是按照以前的报告(12]。我们推测的吞噬作用和住所白念珠菌,但不β葡聚糖,触发信号调控和抑制了自噬流量。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.5。引起的膝盖上白念珠菌ROS影响生产,THP-1-Derived巨噬细胞的凋亡和增殖
自噬是维持细胞内稳态的关键机制。几乎所有哺乳动物细胞自噬活动的基础水平。因此,我们测试了生物的影响白念珠菌刺激。首先,我们发现白念珠菌(C1M白念珠菌应变减少BrdU公司(图名称)挑战6(一)),表明DNA合成的下降。自噬流量阻断剂e - 64 d,抑肽素,CQ,在北半球4Cl, BAF-A1表现出不同的模式在THP-1-derived巨噬细胞DNA合成的影响。e - 64 d、抑肽素和BAF-A1提出了一个轻微的抑制作用,与CQ提出了一个重要的抑制作用。NH4Cl对DNA合成有积极的影响。有趣的是,当自噬流量被溶酶体抑制剂,白念珠菌刺激导致了更重要的抑制作用比当细胞DNA合成的挑战白念珠菌一个人。这些数据表明,影像学上基底自噬可能是至关重要的维持细胞生存能力当巨噬细胞吞噬白念珠菌。重要的是,腿上也参与lysosome-like规范自噬过程的退化。因此,阻断溶酶体活动预计扰乱圈当自噬流量被阻塞。需要验证这个结论由特定方法扰乱的大腿上。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
自噬机械和凋亡调控之间的平衡是至关重要的对于切换细胞命运在应对各种压力。因此,我们使用流式细胞仪检测细胞凋亡与膜联蛋白V和PI染色和免疫印迹识别caspase-3乳沟。白念珠菌刺激,雷帕霉素治疗,白念珠菌刺激的雷帕霉素的存在并没有导致乳沟caspase-3(图6 (b))或增加膜联蛋白V-positive细胞相比,控制数据6 (c)和6 (d))。这些数据表明,吞噬作用白念珠菌抑制自噬流量并没有引发THP-1-derived巨噬细胞凋亡。
ROS生成也是一个重要的事件当细胞受到各种伤害。我们使用DCFH-DA染色显示白念珠菌在THP-1-derived巨噬细胞刺激诱导活性氧的增加。然而,与自噬诱导物雷帕霉素治疗并不影响THP-1-derived巨噬细胞的活性氧产量与挑战白念珠菌(数据6 (e)和6 (f))。
综上所述,无条件操作基底自噬流量是至关重要的维持低水平THP-1-derived巨噬细胞DNA合成的挑战白念珠菌。
4所示。讨论
我们的研究表明,吞噬白念珠菌导致了抑制基底THP-1-derived巨噬细胞自噬流量通过MTOR-independent机制。此外,自噬中扮演着重要的角色在THP-1-derived巨噬细胞保持基底DNA合成的挑战白念珠菌。
自噬通路包括phagophore的形成,最初的隔离舱,扩展成一个自噬小体,完成自噬小体,其次是与溶酶体融合,退化的内容,并完成自噬流量。LC3-II营业额的测定采用免疫印迹在溶酶体降解的存在与否是用来推断自噬流量(36]。LC3-II将更丰富的溶酶体抑制剂当自噬流量正在发生。目前,LC3-II营业额分析主要有助于区分实际自噬诱导自噬流量阻塞的(37]。这个试验是澄清的最新指南的使用和解释化验监测自噬(2016年12月出版)。例如,LC3-II水平较高和一些治疗+溶酶体抑制剂相比,溶酶体抑制剂单独可能表明自噬流量的增强。如果治疗本身上调LC3-II水平,但治疗+溶酶体抑制剂不会增加LC3-II水平相比,溶酶体抑制剂,那么治疗可能导致自噬流量部分堵塞。此外,如果治疗本身增加LC3-II水平没有导致LC3-II不同水平时结合溶酶体抑制剂单独治疗相比,这可能表明一个完整的自噬在最后一步的堵塞。然而,指导方针没有讨论如何解释自噬流量的下降。我们对待THP-1-derived巨噬细胞白念珠菌和溶酶体抑制剂2 h和8 h(早期和晚期的吞噬作用时间点白念珠菌)。有趣的是,LC3-II水平增加细胞接触白念珠菌和四个溶酶体抑制剂相比白念珠菌在我们的研究中。这一发现表明,治疗没有阻断自噬流量。此外,LC3-II水平较低白念珠菌刺激加上溶酶体抑制剂相比,溶酶体抑制剂单独显示白念珠菌刺激减少自噬流量。我们的数据的RFP-GFP-LC3B puncta分析支持这个结论。据报道,自噬抑制导致白血病等恶性疾病的治疗38和非小细胞肺癌39]。因此,指南的使用和解释化验监测应该建立自噬抑制,虽然指南监测自噬诱导持续更新。
自噬体与溶酶体的融合是关键的自噬过程的结束。治疗方法有针对性的溶酶体和/或自噬体与溶酶体融合阻断自噬过程。e - 64 d和抑肽素溶酶体抑制剂。CQ, NH4Cl, BAF-A1可以中和溶酶体博士此外,BAF-A1可以阻断自噬体与溶酶体的融合。重要的是,这些代理(CQ BAF-A1特别是)复杂的药理作用(特别是CQ)除了调节自噬。我们观察到LC3-II积累在细胞与挑战白念珠菌在所有上述代理的存在与否。因此,我们观察到在四组LC3-II积累减少。我们的发现强烈认为白念珠菌导致自噬流量减少。有趣的是,我们的数据表明,不同的溶酶体抑制剂阻断自噬流量有不同的影响。在THP-1-derived巨噬细胞,CQ autophagy-blocking效应和BAF-A1强于e - 64 d +抑肽素和北半球4Cl。与e - 64 d +抑肽素,CQ, NH4Cl, BAF-A1都表现出时间增加的抑制作用。然而,在四个分析系统在溶酶体抑制剂的存在与否,只有e - 64 d +抑肽素和北半球4Cl提升白念珠菌全身的自噬抑制治疗时间短的2小时。虽然BAF-A1或CQ推荐的治疗时间短(1 - 4小时),上面的两个系统不能显示的效果白念珠菌刺激了2小时。我们的研究表明,自噬流量的增加或减少应确定使用至少三种溶酶体抑制剂。此外,每个人都应该记住,溶酶体功能是活跃在巨噬细胞和巨噬细胞数量增加几个溶酶体储存疾病(40]。巨噬细胞自噬监测,使用方法阻止溶酶体应强调口译与多个溶酶体抑制剂治疗的结果。
圈是由LC3在巨噬细胞吞噬作用和单膜结合含有病原体的时间。这个过程促进与溶酶体融合时间。腿上可以观察到GFP-LC3 puncta和LC3 lipidation LC3-II(增加)37]。然而,大腿上,自噬是很难区分LC3由于依赖两个过程。可用的区分标准包括以下:(i) ROS生产参与LC3招聘在膝盖上;(2)圈不需要ATG9,但自噬(macroautophagy)的细菌确实需要ATG9;和(3)single-membrane结构参与圈(37]。在我们的研究中,我们观察到,ROS水平增加,ATG9和p62没有参与LC3招聘THP-1-derived巨噬细胞治疗白念珠菌,显示的感应圈。事实上,白念珠菌感应圈被描述的其他研究[9,12,41]。此外,卢比孔河的关键作用在大腿上被其他研究证实22,42]。在我们的研究中,我们验证了colocalization卢比孔河phagosome-engulfed白念珠菌。我们的研究结果表明,原位检测LC3招聘(例如,GFP-LC3 puncta病原体或LC3通过免疫荧光检测)是一个关键的方法监测感应圈。目前尚不清楚是否LC3营业额发生在大腿上的过程。然而,我们的研究表明,LC3招聘感应圈的一个标志,但LC3-II水平的增加并非如此。因此,化验LC3-I LC3-II转换和LC3-II营业额应避免在学习圈的过程。此外,LC3-II营业额下降白念珠菌在我们研究电极刺激诱发的大腿上。
总之,我们的研究表明,吞噬作用白念珠菌导致自噬通量下降伴随着的感应圈。LC3的职业招聘吞噬白念珠菌可能导致基底的抑制自噬流量。我们的研究揭示了协调机械之间的规范自噬,在防御圈白念珠菌挑战。当巨噬细胞吞噬影像学基底自噬维持细胞生存能力白念珠菌。规范在巨噬细胞自噬的作用,参与免疫防御白念珠菌入侵必须澄清剥夺了自噬机制的具体措施。
缩写
| 圈: | LC3-associated吞噬作用 |
| PAMP时: | 其分子模式 |
| PRRs: | 模式识别受体 |
| LC3: | Microtubule-associated蛋白质1轻链3 |
| MTOR: | 机械的雷帕霉素的目标 |
| MTORC1: | MTOR复杂1 |
| MTORC2: | MTOR复杂2 |
| AO: | 吖啶橙 |
| CQ: | 氯喹 |
| BAF-A1: | Baflomycin-A1 |
| ATG: | Autophagy-related基因 |
| PBS: | 磷酸盐 |
| CFW: | Calcofluor白 |
| BMDMs: | 骨骨髓来源的巨噬细胞 |
| ROS: | 活性氧 |
| ULK1: | Unc-51-like激酶1 |
| DMSO溶液: | 二甲亚砜 |
| 的边后卫: | 胎牛血清 |
| PMA: | Phorbol-12-myristate-13-acetate |
| WT: | 野生型 |
| BSA: | 牛血清白蛋白 |
| 分: | 酸性泡状细胞器 |
| PI: | Propidium碘化 |
| EP: | e - 64 d +抑肽素 |
| 拉伯: | 雷帕霉素。 |
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
Zhimin段和徐陈写主要的手稿文本。Zhimin段,雷雷Du、简帛,歌曲,和荣曾共同进行实验,准备所有的数据,并进行统计分析工作。清陈,个妈,徐陈,李敏监督实验设计和修订后的手稿文本。所有作者回顾了手稿。Zhimin段,青橙,雷雷Du和简帛通导致这篇文章一样。
确认
这项工作是支持由中国国家自然科学基金(81773338,81773338,81773338,81722037,81671630),凸轮医学科学创新基金(2017 - i2m - 1 - 017和2016 - i2m - 1 - 005),中国国家基础研究计划(973年计划,没有。2013 cb531605),“五13”关键在科学和医学人才项目江苏省教育(ZDRCB2016010),江苏研发计划社会发展项目(BE2015717),科学技术部中华人民共和国(国家重点研发项目,没有。2017 yfa0506200),江苏省自然科学基金(BK20170006和BK20160379),和非营利组织中央研究院中国医学科学院基金(2016 zx310194和2017 rc31008)。