文摘

糖尿病心肌病(DCM)是严格与心脏疾病和障碍或死亡的心肌细胞包括居民心脏祖细胞在糖尿病患者(年度"特别关注国")。为了恢复损失函数的居民或移植年度"特别关注国",许多研究都集中在小说的治疗策略包括发现小说function-modulating因素如活性氧(ROS)的食腐动物。在这里,我们开发和定义了一个新颖的抗氧化剂,mhy - 1684,增强血管生成的潜力与ROS-related DCM年度"特别关注国"。短期治疗mhy - 1684恢复ROS-induced共产党细胞死亡。重要的是,mhy - 1684降低高血糖诱导线粒体ROS生成和减毒高血糖诱导的线粒体碎片。我们观察到的激活过程Drp1 Ser616现场(磷酸化)和Fis-1大幅减毒暴露在高浓度的葡萄糖与mhy - 1684。有趣的是,磷酸化的Drp1 Ser637的网站,这是一种抑制线粒体融合信号,由mhy - 1684治疗恢复,表明这种抗氧化剂可能影响线粒体的激活和抑制dynamics-related信号和线粒体功能,以应对ROS的压力。总之,我们发现小说的化合物,mhy - 1684,作为活性氧清除剂,可能提供一个有效的治疗策略对糖尿病心肌病CPC-based疗法。

1。介绍

糖尿病(DM),通常称为糖尿病,是一种常见的全球公共卫生问题。与糖尿病相关的最严重的问题是各种dm相关并发症如心血管疾病、肾脏疾病、神经病变、糖尿病肾病。一般来说,糖尿病是一种失调的主要原因由于故障血糖水平的胰岛素分泌(1]。这个故障是由于胰岛β细胞的毁坏在I型糖尿病和胰岛素抵抗在2型糖尿病。无论类型,糖尿病是归类为一种疾病的血糖升高,这最终导致高血糖症,这是心血管疾病的主要原因。在临床的设置,据报道,糖尿病患者心血管疾病的死亡比率远远高于正常患者心血管疾病(2,3]。此外,高血糖会导致额外的并发症如神经病变,中风,糖尿病酮症酸中毒,hyperosmolar高血糖的状态(4,5]。

糖尿病心肌病(DCM)会导致心脏疾病和障碍或死亡的居民在糖尿病患者心肌细胞。DCM的特点是一个改变脂质成分和线粒体功能障碍在糖尿病的心6),开发各种诱发因素,如氧化应激、线粒体功能异常、内皮细胞损失,炎症,自噬,mitophagy [7,8]。为了降低心力衰竭的风险,需要通过减少控制高血糖DCM和提高心肌细胞的细胞功能或居民心脏祖细胞(年度"特别关注国")。在临床环境中,高血糖诱导DCM影响共产党生存能力和居民年度"特别关注国"或移植的血管生成潜力年度"特别关注国" (9]。因此,识别小说对高血糖有cytoprotective影响因素是细胞疗法治疗扩张型心肌病的先决条件。

通常是众所周知,生产过剩的活性氧(ROS)对糖尿病并发症的发展有至关重要的影响(10]。活性氧过剩组织引起线粒体功能障碍,最终导致细胞衰老和细胞死亡,以及胰腺细胞的生物活性包括组织干细胞(11,12]。几项研究都集中在天然或合成的化合物的cytoprotective效应ROS拾荒者(13- - - - - -15]。最近,我们表明,oleuropein-primed内皮祖细胞(epc)调节血管修复的潜力与激活ROS-induced细胞外signal-regulated激酶1/2-peroxiredoxin (ERK1/2-Prdx)途径15]。此外,与番茄红素预处理变弱ROS-induced细胞凋亡在人类间充质干细胞(hMSC)蛋白激酶B-manganese超氧化物歧化酶(AKT-MnSOD)途径14]。

越来越多的证据表明,线粒体动力学包括线粒体核裂变和核聚变维持线粒体稳态(16]。例如,几个研究小组已经清楚地展示了特定中断的线粒体动力学fission-related抑制剂包括的具体针对dynamin-related蛋白1 (Drp-1),最终导致细胞死亡和促进心脏疾病(17- - - - - -19]。多种治疗策略一直尝试,包括ROS-induced线粒体分裂的具体目标(20.],hyperglycemia-related心脏干细胞归巢[21),高血糖诱导血管生成能力的年度"特别关注国"9]。最近,我们还报道,高血糖在年度"特别关注国"改变线粒体动力学和fission-related蛋白的表达增加,包括线粒体蛋白质(Fis1)和Drp1裂变1。此外,我们表明,葡萄糖转运蛋白1 (GLUT1)的具体堵塞提高细胞生存能力,管的形成,调节线粒体动力学在年度"特别关注国"17]。尽管如此,仍有一些报告,确认新化合物对DCM加强共产党生物活性。

因此,本研究的目的是开发一种新型的抗氧化化合物对高血糖诱导心肌病和评估潜在的角色化合物的氧化应激、细胞死亡和线粒体动态年度"特别关注国"。

2。材料和方法

2.1。人类心脏祖细胞(hCPCs c-Kit-Positive的隔离c - kit +)

hCPCsc - kit +隔绝人类infant-derived心脏外科手术后组织,如先前所述修改协议(22]。釜山国立大学的伦理审查委员会Yangsan医院,Gyeongsangnam-do,大韩民国,批准了这项协议。执行这种隔离,检查心脏标本碎和孵化0.2%胶原酶II型(美国新泽西州沃辛顿)37°C 30分钟来获得单个心肌细胞。单个心肌细胞培养在火腿的F12媒体(HyClone UT)含10%胎牛血清(美国的边后卫,Gibco, CA), 1 x青霉素和链霉素(P / S, Welgene、大邱、韩国),2.5 U人类红细胞生成素(hEPO、研发系统,明尼阿波利斯,美国),5μg基本重组人成纤维细胞生长因子(bFGF、PeproTech落基山,新泽西,美国),和0.2毫米的谷胱甘肽(美国Sigma-Aldrich,圣路易斯,CA)。当单个心肌细胞种植到一个足够高的融合进行排序,单个心肌细胞是共轭的c - kit主要抗体(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国),根据磁激活细胞分选(mac)。

2.2。测量过氧亚硝基(ONOO−)清除活动

ONOO−(美国俄勒冈州尤金)清除测量使用监测123年dihydrorhodamine氧化(DHR 123,尤金,俄勒冈州,美国)通过修改方法(23]。ONOO−清除氧化的DHR 123测量微型板块荧光分光光度计高度层500(美国BioTek仪器)激发和发射波长485 nm和530 nm,在室温下分别。背景和最终的荧光强度测量在治疗后5分钟有或没有SIN-1(最终浓度,10毫米)或真实的ONOO−(最后的浓度,10毫米)在0.3 N氢氧化钠。SIN-1 DHR 123年由氧化分解(美国Sigma-Aldrich,圣路易斯,CA)逐渐增加,而真实的ONOO−迅速氧化DHR 123年最后的荧光强度随时间是稳定的。

2.3。hCPCc - kit +文化和mhy - 1684

hCPCsc - kit +保持在火腿的F12培养基37°C湿润5%股份有限公司2。D -(+)葡萄糖(美国Sigma-Aldrich,圣路易斯,CA)添加到正常培养基。mhy - 1684是溶解在DMSO(100毫米)和不同浓度进一步稀释。相同浓度的DMSO溶液添加到所有实验的对照组。mhy - 1684作为一种抗氧化剂。hCPCs治疗与D -(+)在不同浓度葡萄糖和mhy - 1684。

2.4。细胞生存能力分析

细胞生存能力是衡量使用WST工具包(Ez-Cytox,日常实验室、首尔、韩国)。hCPCsc - kit +被播种在96孔板与D -(+)在不同浓度葡萄糖和mhy - 1684。文化板块孵化24、48和72 h。孵化后,培养基与D -(+)在不同浓度葡萄糖和mhy - 1684改为WST解决方案。盘子被孵化的1 h,使用分光光度计吸光度测量在450海里(Tecan、Grodig、奥地利)。

2.5。免疫印迹分析

整个细胞细胞溶解里帕裂解和提取缓冲(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(美国Sigma-Aldrich,圣路易斯,CA)上的冰,和总蛋白浓度是量化使用Bicinchoninic酸工具包(美国热科学,罗克福德,IL)。一般来说,汽车销售μg总蛋白质的分离了8 - 15%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳,和蛋白质转移到聚偏二氟乙烯(PVDF微孔,Billerica,妈,美国)膜。膜被封锁的5%脱脂牛奶在室温下1 h和孵化主要抗体在一夜之间在4°C。随后,这些膜孵化与辣根过氧化物酶(合)共轭二次抗体室温1 h(微孔)和蛋白质乐队是可视化使用增强化学发光试剂(热费希尔科学)。以下主要使用抗体:磷酸化细胞外signal-regulated激酶(p-ERK、细胞信号技术,丹弗斯,妈,美国),细胞外signal-regulated激酶(ERK、细胞信号技术),磷酸化蛋白激酶b (p-AKT、细胞信号技术),蛋白激酶b(一种蛋白激酶,细胞信号技术),活化蛋白激酶(AMPK,细胞信号技术),glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH,圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国),β肌动蛋白(Santa Cruz), p-Drp1ser616年(细胞信号技术),p-DRP1ser637年(细胞信号技术),Drp1(细胞信号技术),Fis1 (Abcam、剑桥、马、美国),mitofusin-1 (Mfn-1, Santa Cruz),和视神经萎缩1 (OPA1 Abcam)。以下二次抗体被用于:山羊anti-rabbit免疫球蛋白和山羊anti-mouse免疫球蛋白(美国法明岱尔恩佐生命科学)。

2.6。管形成分析

96 - 70孔板被涂上一层μL(基底膜基质(BD生物科学,富兰克林湖,新泽西)和孵化在37°C为30分钟。hCPCs被播种在96 -孔板与基底膜基质,然后孵化6 h。在孵化后,管总长度是衡量计数管的数量在一个微观可视化领域每口井(40 x放大)至少3独立复制使用ImageJ软件(免费软件从国立卫生研究院)。

2.7。线粒体ROS的测量

线粒体ROS决心使用荧光MitoSOX探针(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)。hCPCs孵化在火腿的F12培养基2μM MitoSOX红色为30分钟37°C公司5%2的气氛。孵化后,细胞用磷酸盐(PBS)和荧光被fluorescence-activated细胞评估排序(流式细胞仪;美国BD Accuri C6,圣何塞,CA)。分析了线粒体ROS使用BD FACSDiva软件(BD生物科学,贝德福德,MA)。

2.8。细胞死亡分析

测量凋亡细胞死亡,hCPCs通过流式细胞仪检测(BD Accuri C6)与膜联蛋白V / propidium碘(PI)细胞凋亡检测设备(BD生物科学、圣地亚哥、钙、美国)。轻轻地,hCPCs收获后的培养基中含有葡萄糖和mhy D - (+) - 1684。细胞被膜联蛋白V /处理π至少15分钟在黑暗中根据制造商的指示。

2.9。免疫荧光

线粒体形态测量hCPCs沾200海里MitoTracker红色CMXRos(分子探针,尤金,或者美国)用共焦显微镜(奥林巴斯、FV1000、东京、日本)。在线粒体形态来确定任何变更,我们测量了线粒体使用ImageJ软件总长度。

2.10。统计分析

所有的实验结果给出平均值±标准偏差(SD)使用方差分析。比较两组使用未配对学生的进行 以及。的值 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。发展一种新的化合物,mhy - 1684,增强hCPCs)的生物活性

为了开发一种新型的化合物,我们设计了一个mhy - 1684是一种抗氧化剂复合,这是合成基于曲酸(图1(一))。此前,曲酸的抗氧化作用已报道(24,25]。它证实的抗氧化效果mhy - 1684(补充表1、补充材料)。评估hCPCs mhy - 1684的细胞毒性,我们把细胞为0.1,1,100μM, 1毫米mhy - 1684 24 h。细胞生存能力显著降低,当细胞暴露在超过10μM mhy - 1684。因此,我们优化所有实验用不到10μM mhy - 1684(图1 (b))。评估在hCPC mhy - 1684生物活性的影响,我们下一个调查mhy - 1684的作用hCPC成型能力和细胞增殖,包括调查ERK1/2和AKT通路。治疗hCPC mhy - 1684 24 h显著增加p-ERK和p-AKT(数字的表达1 (c)和1 (d)),以及增强hCPC成型能力,表明mhy - 1684影响潜力hCPC血管生成,细胞增殖。

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图1
的角色在hCPCs mhy - 1684作为活性氧清除剂。(a)的化学结构mhy - 1684。(b) hCPCs被播种在96 -孔板和培养表示浓度mhy - 1684 24 h。使用WST测定细胞生存能力评估。值均值±S.E.M. 和 与对照组相比。(c)的成型能力hCPCs检查时细胞暴露于mhy - 1684 24 h。tubular-like网络使用人工基底膜管的形成分析评估。(d)与mhy - 1684治疗后24 h, prosurvival-related蛋白(ERK-1 AKT-1)被免疫印迹分析。(e) hCPCs使用mhy - 1684的浓度表示的24小时之前,过氧化氢(h2O2,800年μ米)治疗。线粒体ROS水平hCPCs测量通过流式细胞术MitoSOX红色。(f)直方图显示中值±S.E.M.MitoSOX-positive细胞暴露在H2O2。MitoSOX-positive细胞增加暴露在H2O2;然而,当cotreated mhy - 1684, MitoSOX-positive细胞明显减少。值均值±S.E.M. 和 与对照组相比, 和 与25毫米治疗组D -(+)葡萄糖72 h。
3.2。抗氧化效果mhy - 1684 H2O2全身的ROS在hCPCs

确定的潜在作用mhy - 1684是一种抗氧化剂,我们检查了线粒体ROS生成对氧化应激的反应。具体来说,当hCPCs暴露于800年μM H2O2,产生了大量的线粒体ROS。相比之下,hCPCs使用mhy - 1684显示线粒体活性氧的水平显著降低,表明mhy - 1684对线粒体ROS生成有抑制作用(数字1 (e)和1 (f))。

3.3。Cytoprotective mhy效果- 1684在hCPCs高血糖诱导细胞死亡

调查是否在hCPCs高血糖诱导细胞死亡,我们对待hCPCs 25毫米D -(+)葡萄糖以时间的方式。结果,我们发现这个浓度的葡萄糖诱导大量hCPC 72 h(图中细胞死亡2(一个))。重要的是,hCPCs cotreated与D -(+)葡萄糖和mhy - 1684显著减毒高血糖诱导细胞死亡(图2 (b))。此外,我们还观察到一个扩散的表达增加标记包括p-ERK和p-AKT(图2 (c)),这表明mhy - 1684可能促进细胞增殖。

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图2
影响mhy - 1684 hCPCs高血糖诱导细胞死亡。(一)hCPCs处理25毫米D -(+)为0 - 72 h葡萄糖,和细胞随后可行性评估。(b)的cotreatment hCPCs mhy - 1684(0.1 1和10μ米)和25毫米葡萄糖72 h,细胞生存能力评估。值均值±S.E.M. 与对照组相比, 相比25毫米的D - (+) glucose-treated组。与mhy - 1684 (c)治疗后24 h D -(+)葡萄糖25毫米,prosurvival-related蛋白(ERK-1 AKT-1)被免疫印迹分析。(d) hCPCs孵化了25毫米d -(+)为0 - 72 h葡萄糖有或没有1μmhy - 1684 72 h。hCPCs是沾膜联蛋白V /π,然后,hCPCs通过流式细胞仪测定。hCPCs被归类为可行的细胞(膜联蛋白V - /π-),凋亡细胞(膜联蛋白V + /π-膜联蛋白V +π+),和死细胞(PI膜联蛋白V + / +)。(e)死亡的细胞群表示为占总细胞数的百分之一。(f)凋亡的细胞群表示为占总细胞数的百分之一。值均值±S.E.M. 和 与对照组相比, 与25毫米治疗组D -(+)葡萄糖72 h。
3.4。Cytoprotective mhy - 1684在hCPCs高血糖诱导细胞凋亡的影响

调查是否高血糖诱导细胞死亡是由于高血糖诱导细胞凋亡,我们评估hCPC通过膜联蛋白V / PI染色细胞死亡。如图2 (d),高葡萄糖条件显著增加的百分比死细胞hCPC人口。相比之下,预处理的hCPCs mhy - 1684和72 h的高葡萄糖显著减毒高血糖诱导hCPC细胞死亡(数字2 (d)- - - - - -2 (f))。

3.5。mhy - 1684变弱线粒体ROS生成

根据以前的报告,高血糖诱导细胞凋亡是由线粒体ROS (17),我们调查了mhy - 1684对高血糖诱导的线粒体ROS生成的影响。如图3(一个)当暴露于高血糖,hCPCs产生更多的线粒体ROS。重要的是,cotreatment hCPCs mhy - 1684和D -(+)葡萄糖显著降低线粒体ROS(数字3(一个)和3 (b)),这表明mhy - 1684可能防止hCPCs凋亡细胞死亡通过阻断线粒体ROS生成。

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图3
mhy - 1684变弱线粒体ROS生成。(一)hCPCs处理25毫米D -(+)为0 - 72 h和葡萄糖μmhy - 1684 72 h。线粒体ROS贴上MitoSOX红,hCPCs被流式细胞术分析。(b)直方图显示中值±S.E.M.MitoSOX平均荧光强度(MFI)暴露在D -(+)葡萄糖。MitoSOX-positive细胞增加时间的方式暴露在D -(+)葡萄糖;然而,当cotreated mhy - 1684, MitoSOX-positive细胞明显减少。值均值±S.E.M , 与对照组相比, 与25毫米治疗组D -(+)葡萄糖72 h。
3.6。mhy - 1684变弱通过调节线粒体分裂裂变或聚变相关的蛋白质

检查mhy - 1684对高血糖诱导的线粒体碎片的影响(20.),我们观察到线粒体形态变化与葡萄糖和mhy hCPC治疗后- 1684。如图4(一)长度,总线粒体明显减少当细胞受到25毫米D -(+)葡萄糖。相比之下,cotreatment hCPCs的1μM mhy - 1684和25毫米D -(+)为72 h葡萄糖显著减毒线粒体碎片(数字4(一)和4 (b))。调查这种衰减发生的分子机制,我们接下来研究线粒体dynamics-related蛋白质的表达包括fission-associated Drp1和Fis-1 fusion-associated Mfn-1 Opa-1西方墨点法。值得注意的是,激活两Drp1 Ser616现场(磷酸化)和Fis-1大幅减毒暴露在高浓度的D -(+)葡萄糖。在Ser637 Drp1的磷酸化,有趣的是,这是一种抑制性信号线粒体融合,hCPC mhy - 1684治疗后恢复。相比之下,当hCPCs对待mhy - 1684的表达Mfn-1明显恢复,表明mhy - 1684可能影响治疗的激活和抑制线粒体dynamics-related信号和线粒体功能,以应对ROS压力(图4 (c))。

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图4
mhy - 1684变弱通过调节线粒体分裂裂变或聚变相关的蛋白质。(一)共焦图像hCPCs沾MitoTracker红CMXRos cotreatment后1μM mhy - 1684和25毫米D -(+)葡萄糖72 h。(b)线粒体长度分析hCPCs孵化时用1μM mhy接触25毫米后- 1684 D -(+)葡萄糖。结果意味着±SD。 和25毫米D -(+)葡萄糖。(c)的线粒体fragmentation-related Fis1标志,Drp1, OPA1, Mfn1孵化时1μM mhy接触25毫米后- 1684 D -(+)葡萄糖。
3.7。Cytoprotective mhy - 1684对hCPC成型能力在高血糖

与mhy - 1684确定预处理提高了血管生成的生物活性hCPCs高血糖,我们检查了成型mhy - 1684 hCPCs治疗的潜力。成型能力显著降低25毫米的D -(+)葡萄糖。然而,hyperglycemia-reduced成型能力hCPCs获救cotreated mhy - 1684(数据时明显5(一个)和5 (b)),这表明mhy - 1684提高了血管生成期间hCPCs高血糖的函数。

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图5
mhy - 1684救援期间hCPCs高血糖的成型能力。(一)管形成hCPCs 1处理的能力μM mhy - 1684和25毫米D -(+)葡萄糖72 h。的能力hCPCs形成capillary-like结构体外使用人工基底膜管的形成分析评估。(b)量化总长度的管状结构。 与对照组相比, 与25毫米治疗组D -(+)葡萄糖72 h。

4所示。讨论

尽管CPC-based疗法的临床影响新兴(26)和年度"特别关注国"的治疗效果在缺血性心血管疾病模型似乎清楚地证明了,基于质量和数量有一个限制居民年度"特别关注国",可用于临床治疗应用。医学界是有限的,因为patient-derived年度"特别关注国"具有治疗性生物活性降低由于多种危险因素包括年龄、吸烟、糖尿病和高血糖。为了实现从移植年度"特别关注国"显著疗效,有增加关注小说的发现function-modulating因素包括ROS拾荒者(13- - - - - -15]。在这个报告中,我们发现了一个新颖的抗氧化剂,mhy - 1684,增强对糖尿病心肌病ROS-related hCPC生物活性。有趣的是,短期治疗mhy - 1684 ex vivo-expanded年度"特别关注国"减毒高血糖诱导线粒体分裂和细胞死亡。这表明mhy - 1684可能是一个小说CPC-based启动剂治疗糖尿病心肌病通过减少线粒体ROS生产和调节线粒体动力学。

线粒体是移动和能源生产细胞器港动态网络结构。维持线粒体动力学是一个组织内稳态的重要组成部分,无序线粒体动力学与多种疾病相关(27]。现有证据还表明,线粒体分裂发生在高血糖从而导致hCPC功能障碍(17]。我们的研究结果支持的重要性的正确调制hyperglycemia-related线粒体动力学。预处理的hCPCs mhy - 1684大幅减少hyperglycemia-related线粒体通过衰减Drp-1的激活和Fis-1裂变。这是通过使用两个p-Drp-1西方墨点法616年和Fis-1抗体(数据4(一)和4 (b))。相比之下,p-Drp-1637年聚变相关蛋白,Mfn-1变得相对地激活期间高血糖。这些结果表明,无序的线粒体动力学部分恢复了mhy - 1684(图4 (c))。

线粒体ROS形成自然作为细胞内代谢副产品,他们起着至关重要的作用在细胞信号,扩散,体内平衡,细胞死亡28]。在临床,高血糖会导致活性氧的生产过剩,从而破坏细胞结构,导致细胞死亡(29日),导致心肌病。降低高血糖的影响如糖尿病心肌病的发展,线粒体ROS需要控制。因此,我们的小说活性氧清除剂,增强细胞功能,包括管形成和hCPC细胞生存,可能在CPC-based疗法治疗对糖尿病心肌病。特定的调制ROS-related高血糖也是一个重要问题,因为高血糖抑制移植细胞的血管生成能力和居民干细胞/祖细胞和抑制细胞归巢通过调节ERK1/2通路(9,21]。在我们目前的研究中,我们证明了ROS的衰减mhy - 1684激活ERK1/2和一种蛋白激酶信号通路。多个研究支持这一事实ROS生产过剩会抑制ERK1/2和一种蛋白激酶信号传导,最终导致细胞死亡30.,31日),这表明增强ERK1/2和AKT信号部分影响了救援过程由mhy - 1684高血糖诱导糖尿病心肌病。

5。结论

我们的研究结果表明,mhy - 1684增强hCPC细胞功能与ROS和高血糖。重要的是,mhy - 1684减毒线粒体ROS生成在高血糖和通过调节Drp-1和Fis-1显著降低线粒体碎片。mhy - 1684也减少了ROS-induced细胞死亡(图6)。总之,这部小说化合物,mhy - 1684是一种活性氧清除剂,可能是一种有效的治疗代理CPC-based疗法对糖尿病心肌病。


图6
提出工作模型。mhy - 1684中扮演着一个关键的角色在活性氧生成,恢复血管生成潜力,减少细胞死亡的hCPCs通过调节线粒体动力学。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关这篇文章的出版。

确认

这项工作是由国家研究基金会的资助(nrf - 2015 m3a9b4051053)和韩国的卫生技术研发项目,卫生部和福利(HI17C1662)由韩国政府。作者感谢釜山国立大学衰老组织银行提供材料和研究信息。

补充材料

补充表1:ONOO−(10μ的化学物质(40美元)清除活动μ米)。清除活动的力量真正的ONOO后添加−按照以下顺序或SIN-1: mhy - 1684 >青霉胺>白藜芦醇。mhy为清除ONOO - 1684显示最强的影响−的化学物质。(补充材料)