文摘
良性前列腺增生(BPH)是一种男性常见疾病。2-Methoxyestradiol(我)是一个结束的雌激素代谢物多向性的药理特性。本研究旨在探讨潜在的改善2我不要在老鼠testosterone-induced良性前列腺增生的影响。2-Methoxyestradiol(50和100毫克/公斤,溶解在DMSO)预防前列腺指数的上升和重量相比testosterone-alone-treated动物2周。组织学检查显示,2我改善前列腺的病理变化的体系结构。这证实了我的能力,以减少腺上皮高度相比,睾酮组。同时,2我改善testosterone-induced氧化应激,抑制过氧化脂质含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性的疲惫。2我的有利影响与BPH的发展证实了评估增殖标记,防止细胞周期蛋白D1蛋白表达和增强伯灵顿/ Bcl2 mRNA比率。它显著降低前列腺肿瘤坏死因子的内容α(肿瘤坏死因子-α),interleukin-1β(il - 1β),核转录因子κB (NF -κB)和转化生长因子β(TGF -β)。此外,低氧诱导因子1 - 2我减少α(HIF-1α)和phospho-Smad2 (p-Smad2)蛋白表达与睾酮组相比。总之,2我变弱睾酮在大鼠实验性地诱导前列腺肥大,至少在一定程度上抑制HIF-1α/ TGF -β/ Smad2轴。
1。介绍
良性前列腺增生(BPH),它的特点是增加前列腺上皮和间质细胞的增殖,是一种常见的疾病在男性人口1]。据报道,良性前列腺增生的发病率随着年龄的增加(2]。据估计,大约60岁的男性体验前列腺肥大的症状。这个数字增加到90%,男性85岁,据美国泌尿协会(3]。前列腺组织增生伴有腺体弹性不佳,可能会导致尿道口缢痕。男性患有前列腺肥大通常表现出一系列的下尿路症状(附近地区)包括频繁和紧急排尿,夜尿症,尿犹豫,削弱了排尿。良性前列腺增生的分子事件,引导发展还没有完全显示。已经提出许多重叠的风险因素包括老化、氧化应激、直接感染,尿回流,炎症,和雄激素有点交织在一起(1,4]。
2-Methoxyestradiol(2)是一种天然的雌激素的代谢产物。它是由17的氧化β雌二醇的酶、细胞色素P450和随后通过O-methylation catechol-O-methyltransferase (COMT的)。然而,我有一个非常低或几乎没有雌激素的活动(5]。有趣的是,我有多效性的药理作用包括抑制肿瘤细胞生长的6),转移(7),和血管生成8]。在同一时间,只有微不足道的副作用报道。最常见的毒性是疲劳、恶心、低磷酸盐血,咳嗽,和腹部肿胀9]。试验表明,2我是耐受性良好,表现出良好的安全性,没有严重的毒性作用[9- - - - - -11]。
良性前列腺增生(BPH)患者显示常数雌二醇水平,而二氢睾酮会随着年龄的增长而减少。这表明雌激素的作用和/或其代谢物在前列腺疾病的发病机制12,13]。低氧诱导因子1α(HIF-1 2-Methoxyestradiol选择性的块α)[14]。后者已经与良性前列腺增生的发病机制,因为它增强了雄激素受体信号与肿瘤生存因素促进前列腺细胞增殖(15,16]。HIF-1α和芳族烃(啊)受体信号网络的组件支持抵抗癌症化疗。啊E3连接酶受体退化的芯片。以前的工作表明,2我诱发E3连接酶的磷酸化啊受体和HIF-1芯片和退化α(17]。我们最好的知识,2我对BPH尚未尝试过。本研究的目的是检查潜在的衰减影响2我testosterone-induced BPH和阐明潜在的机制。
2。材料和方法
2.1。化学物质
2-Methoxyestradiol购买从Fraken物化学有限公司(青岛)纯度超过98%。睾酮enanthate(类固醇公司。,Cologno Monzese, Italy) was provided by Chemical Industries Development Co. (CID), Giza, Egypt. Other chemicals were of the highest analytical grade available commercially.
2.2。动物
所有动物程序伦理研究伦理委员会批准,学院制药、阿卜杜勒阿齐兹国王大学,号码1438 - 101。此外,所有方法进行按照美国政府利用指南和护理的脊椎动物测试,研究和培训。12个雄性Wistar鼠(220 - 250克)是获得法赫德国王医学研究中心,阿卜杜拉国王大学。老鼠一直在空调半天光/暗周期。一个标准的食物颗粒饮食随意和水是免费提供给动物。动物的驯化之前延长一个星期。
2.3。实验设计
老鼠老鼠被随机疏远分成4组(8)和治疗5天/周,连续2周。第1组(对照组)是2.5毫升/公斤DMSO溶液(50%),2我的车辆IP和1毫升/公斤橄榄油SC,和睾酮enanthate的车辆。组2给出了DMSO IP和3毫克/公斤睾酮SC BPH的感应。组3和4有50和100毫克/公斤2我(溶解在50% DMSO剂量体积2.5毫升/公斤)的IP,分别前1 h睾酮enanthate管理。在72小时后睾丸激素剂量,老鼠牺牲和前列腺组织解剖。前列腺腹叶的部分被保留在10%的中性缓冲福尔马林组织学和免疫组织化学处理。一半剩下的前列腺组织存储实时聚合酶链反应(rt - pcr)中提供RNeasy迷你包(试剂盒、希尔登,德国),而另一半是储存在−80°C对后续生化实验。
2.4。前列腺重量和前列腺指数
每个老鼠迅速的前列腺解剖,重。前列腺指数计算为每个鼠前列腺重量除以体重(毫克/克)。
2.5。组织病理学
简单,固定前列腺组织从不同的组由石蜡处理技术准备的4μ米厚度。其次是deparaffinization、补液、苏木精和伊红染色())。至少有三个彩色部分拍摄和用于评估前列腺腺上皮高度ImageJ使用图像分析软件,1.46一个,美国国家卫生研究院。
2.6。测定氧化应激的标记
部分的前列腺组织受到同质化使用冰冷磷酸盐(50毫米磷酸钾,pH值7.5)。丙二醛(MDA)含量是用来测量脂质过氧化spectrophotometrically通过硫代巴比土酸活性物质的方法,如前所述[18]。此外,我们决定减少谷胱甘肽(GSH)含量和评估了过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活动在前列腺组织匀浆使用商用设备(Biodiagnostic,吉萨金字塔,埃及)。BCA蛋白质分析工具包(Biovision®Inc .)、钙、美国)被用来确定蛋白质含量。
2.7。细胞周期蛋白D1通过免疫组织化学方法检测
组织部分干使用高压釜、deparaffinized和患者使用乙醇。然后,他们在柠檬酸缓冲(pH值6.0)煮十分钟。之后,部分被孵化5%牛血清白蛋白(BSA) tris-buffered盐水(TBS)两个小时接着浸泡一夜之间在4°C的主要抗体(1μg / ml),兔多克隆抗体anti-cyclin D1 (ABCAM,剑桥,英国)。TBS用于冲洗幻灯片然后孵化与生物素化的二次抗体使用细胞和组织染色工具包(研发系统、MN、美国)。图像分析进行至少三个部分每鼠记录,量化ImageJ分析软件(美国国家卫生研究院ImageJ, 1.46)。
2.8。分析伯灵顿和bcl - 2通过实时聚合酶链反应(rt - pcr)
2.8.1发布。RNA提取和互补脱氧核糖核酸的合成
进行RNA提取前列腺组织使用RNeasy迷你包(试剂盒)按照制造商的指示。RNA检查完整性在2%琼脂糖凝胶电泳。NanoDrop是用来确定提取的RNA的纯度和浓度。上标三世合成第一链cDNA工具包(热费希尔科学)是用于在20互补脱氧核糖核酸的合成μl反应混合物(如前所述)(19]。
2.8.2。引物设计
跑使用基因引物设计软件和合成了Macrogen(韩国)。基因特异性引物序列同源性和总确定爆炸与分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)。引物由不同的外显子序列生成和侧翼基因内区,避免基因组的扩增DNA (gDNA)。核苷酸序列所使用的引物如表所示1。
2.8.3。定量rt - pcr
相对伯灵顿和bcl - 2基因的表达是使用1执行μl合成互补脱氧核糖核酸(10 ng /μ在5 l)作为模板μl PowerUp SYBR绿色PCR大师混合和1μl每个底漆使用7500快速实时PCR系统(应用生物系统公司)。最初的热循环由uracil-DNA糖基化酶激活的2分钟50°C, 2分钟的DNA聚合酶的激活在95°C,紧随其后的是40周期3 s在95°C,和30年代60°C。B2m作为内生控制基因,为每个数据点进行了一式三份。证实了qPCR反应的特异性融化曲线分析。量化方法的选择来验证芯片结果的相对量化(∆∆Ct)方法(20.]。规范化了的意思是B2m的意思是一式三份运行每个基因的兴趣。
2.9。测定IL 1β肿瘤坏死因子-αTGF -β和NF -κB (p65)
前列腺匀浆被用来确定鼠il - 1β肿瘤坏死因子-α,TGF -β使用ELISA包根据协议所提供的制造商(ABCAM,剑桥,英国)。前列腺匀浆被用来准备核提取使用EpiQuik™核提取工具包(op - 0002, EpiGentek,纽约,美国)。核提取测定,蛋白质含量和固定数量(100μ决定NF - g)使用κB的水平。然后,核分数被用来评估NF -κ使用ABCAM NF - BκB (p65)转录因子分析工具包(英国剑桥)。NF -值κB (p65)表示为褶皱变化的对照组与参考光记录密度。
2.10。低氧诱导因子-免疫印迹α和p-Smad2蛋白表达
前列腺组织溶解产物制备用冰冷的里帕裂解缓冲(ABCAM、剑桥、马、美国)补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒,通过样品用近5次(每次10秒)冰,让他们在冰半个小时,其次是离心10分钟4°C和14000 rpm。BCA蛋白质分析工具包(美国CA Biovision Inc .)是用来确定浮在表面的蛋白质。蛋白质样品(100μ每口井的g)加载的SDS - page凝胶电泳凝胶浓度(10%)使用缓冲区组成的甘氨酸(0.192米),三羟甲基氨基甲烷(25毫米)液,SDS (0.1%)。后续电泳,凝胶感动到PVDF膜(美国Bio-Rad实验室、大力神、CA)使用传输缓冲区由甘氨酸(0.192米),三(25毫米),SDS(0.025%)和甲醇(10%)。然后,5%的牛奶TBST被用来阻止膜之后,切成2块75 kDa的分子量。包含蛋白质高于75 kDa的薄膜片与主兔多克隆anti-HIF-1孵化过夜α抗体1:500 (sc - 10790,圣克鲁斯生物技术、钙、美国)。然后,它是用Tris-buffered Tween-20 0.5%生理盐水洗净和孵化HRP-conjugated anti-rabbit二级抗体(1:5000)。此后,细胞膜是由增强化学发光免疫印迹(ECL)工具包(Licor®,东北,美国)和扫描Licor C-Digit污点扫描仪(美国东北3600型)。其他膜切片(< 75 kDa)探测与兔单克隆抗体anti-phospho-Smad2 1: 1000 (ab - 188334, ABCAM,剑桥,英国)。随后,片被剥夺,其次是reprobing兔单克隆抗-β微管蛋白抗体(ab - 179513、ABCAM剑桥,英国)作为加载控制。
2.11。统计分析
结果显示为平均数±标准差。单向方差分析之后,图基作为一种事后测试是用来进行多重比较,评估统计学意义在不同群体之间的反应。差异意味着被认为是重要的 。GraphPad Instat软件版本3是用于进行统计分析。
3所示。结果
3.1。前列腺重量和索引
为主,2我都容忍剂量治疗动物没有死亡或任何毒性的迹象。前列腺重量和指数都显著增加了76%和93%的老鼠注射睾丸激素enanthate,分别与对照组相比(表2)。Cotreatment 2我剂量50和100毫克/公斤引起前列腺重量显著下降了34%和52%,前列腺指数18%和47%,分别比仅仅睾丸酮组。指出,治疗的大鼠使用剂量的2我2周体重显著下降18%相比,控制动物。
3.2。组织病理学检查
显微镜检查H&E-stained部分取自控制老鼠显示正常前列腺组织结构的形式大量腺泡不同的大小和形状包含同质嗜酸性物质。粘膜上皮细胞的腺泡是由两个截然不同的细胞类型,即基底和腺泡的主要细胞。腺泡细胞柱状,从基板腔的导管。他们以esinophilic细胞质颗粒状和球形或椭圆形的细胞核总是位于细胞质(图的下半部分1(一))。相反,前列腺从睾酮enanthate-treated老鼠显示一个明显的中断的histoarchitecture前列腺组织表现为显著增生,腺泡的不规则折叠intraluminar预测,拥堵(图1 (b))。2-Methoxyestradiol剂量的50和100毫克/公斤是有效改善肥大、增生,intraluminar预测检测睾酮组,几乎恢复正常的组织学结构(数据1 (c)和1 (d))。这些数据经评估腺上皮细胞的高度。2-Methoxyestradiol显著降低高56和74%的剂量水平50和100毫克/公斤,分别(图1 (e))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.3。氧化应激的标记
表中的数据3表明,睾酮治疗引起的脂质过氧化作用的重要高程标记MDA几乎4折叠和SOD活性下降30%相比,相应的控制的价值观。然而,没有明显的谷胱甘肽含量的变化或猫活动。2我治疗(50和100毫克/公斤)显著改善testosterone-induced脂质过氧化增加30 - 59%。同时,2我明显阻止SOD疲惫甚至规范化高剂量的价值观。
3.4。2我的抗增殖活动
3.4.1。评估增殖周期蛋白D1的标志
增殖标记免疫组织化学和细胞周期蛋白D1蛋白表达是评估显示,对照组适度染色细胞的数量(图2(一个))。然而,在接受睾酮组,发现染色细胞的增加,表明海拔增殖率(图2 (b))。Cotreatment 2我能够大大降低细胞周期蛋白的数量D1-positive细胞,相比testosterone-treated集团(数字2 (c)和2 (d))。细胞周期蛋白量化densitometrically D1-positive细胞。图中的数据2 (e)表示,2我(50和100毫克/公斤)减少细胞周期蛋白D1表达了26个和39%,分别。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
3.4.2。伯灵顿和bcl - 2 mRNA表达的评估
图中的数据3表明,睾酮enanthate显著降低伯灵顿/ bcl - 2比例83.5%相对于控制。然而,2我(50和100米/公斤)显著减少防止testosterone-induced mRNA表达的伯灵顿/ bcl - 2比例值达36和90%的控制价值,分别。
(一)
(b)
(c)
3.5。评价前列腺il - 1的含量β肿瘤坏死因子-αNF -κB (p65), TGF -β1
il - 1β肿瘤坏死因子-αNF -κB (p65), TGF -β1水平明显高于testosterone-treated前列腺组织的动物相比,控制。2我治疗(50和100毫克/公斤)显著降低il - 1β38岁,62%,肿瘤坏死因子-α27岁,40%,NF -κB (p65)由19个和50%,TGF -β1×18 - 32%。没有统计TGF -在组织层面上的差异β1动物接受100毫克/公斤之间2我和对照组(数据4(一)-4(d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.6。评估HIF-1α和Phospho-Smad2
HIF-1的表达水平α在前列腺组织匀浆免疫印迹(图了5)。睾酮增加HIF-1α老鼠和p-Smad2蛋白表达与控制。2-Methoxyestradiol(50和100毫克/公斤)显著降低HIF-1蛋白表达α12%和60%和p-Smad2(图18 - 56%5)。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
在男性,良性前列腺增生是最常见的良性肿瘤表现出与年龄相关的发病率(21]。细胞增殖和细胞凋亡之间的失衡,氧化应激和炎症的关键球员在BPH开发(22- - - - - -24]。良性前列腺增生的恼人的影响男性的生活质量产生负面影响。良性前列腺增生的主要药理方法管理接受5 -的使用α还原酶和肾上腺素能α1抑制剂(25]。然而,这些涉及各种各样的副作用26,27]。2-Methoxyestradiol是雌激素的最终代谢产物。它是由17的氧化β雌二醇的酶、细胞色素P450和随后由O-methylation catechol-o-methyl转移酶(COMT)(5)。据闻COMT基因多态性与良性前列腺增生(28]。2-Methoxyestradiol有抗增殖6),抗氧化剂(29日),和抗炎30.]属性。我们的目标是探索的能力2我抑制testosterone-induced BPH的老鼠。
对待动物与我(50和100毫克/公斤)2周改善testosterone-induced增加前列腺重量和指数。此外,组织病理学调查证实这些发现2我几乎保存了正常前列腺组织的组织学结构和统计预防腺上皮高度的增加。这是按照已知的抗增殖特性2我31日),才使其成为一个非常有前途的候选药物在第二阶段研究castrate-resistant前列腺癌患者(10]。许多报道强调了氧化应激的作用testosterone-induced BPH (32]。我们的数据显示,2我表现出抗氧化性能,改善前列腺脂质过氧化物含量的增加以及SOD的疲惫。然而,谷胱甘肽含量的值和猫活动没有显著改变。这可能是由于使用的分析方法的局限性。这些发现符合许多报道,由于几个特工的预防作用抗氧化剂性能(33- - - - - -35]。
睾酮治疗导致了令人不安的前列腺细胞增殖和细胞凋亡之间的平衡有利于增殖和细胞周期进程。这是证明由伯灵顿/ Bcl2比率的下降和增加细胞周期蛋白D1的表情。这是符合我们之前的研究对testosterone-induced白杨素BPH (36]。2-Methoxyestradiol在两种剂量水平显著增强的伯灵顿/ Bcl2比率和减轻细胞周期蛋白D1的增加表达。这就是我支持的观念增强了伯灵顿,抑制Bcl2表达在前列腺癌和其他细胞系(37- - - - - -39]。另外,2我抑制的能力在不同的细胞周期蛋白d1之前已经报道过(40,41]。
前列腺炎症代表的一个重要因素影响发展的良性前列腺增生(42]。良性前列腺增生患者前列腺体积和患者的症状评分显著高于高档前列腺炎症(43]。实验,一些报告显示testosterone-induced前列腺肥大是由炎症和保护剂被证明有消炎44,45]。在最近的研究中,睾酮显著升高前列腺il - 1的含量β和肿瘤坏死因子-α。然而,2我在剂量减少炎症介质。这符合报告展示2我抑制il - 1的能力β和肿瘤坏死因子-α表达在肾组织46]。同时,我们的数据表明,testosterone-mediated炎症及增生由高架NF -κB和TGF -β信号。这给了一个额外的解释观察到的减少前列腺伯灵顿/ Bcl2比率(47]。
2我的保护作用对NF -κB也可以链接到其抗氧化活性氧化应激也可以说服通过redox-sensitive转录因子激活炎症反应包括NF -κB (48]。NF -κB是一个转录因子组成的p65 p50子单元,保留在细胞质内一种活动形式。在激活,运入核(49)和控制一些促炎介质TNF的表达α(50]。这证明了il - 1的检测高程β和肿瘤坏死因子-αtestosterone-treated动物和符合他们的角色在促进前列腺细胞增殖(51]。先前的调查结果,我们的结果支持的功能镇压TGF - 2我原因β信号在子宫肌瘤细胞(52]。
2我目标TGF -的能力β在前列腺组织中被评估上游HIF-1进一步探讨α和下游p-Smad2。在目前的工作,睾酮明显增强HIF-1α在大鼠前列腺蛋白表达。这是与先前的调查结果,组织缺氧和HIF-1一致α涉及testosterone-stimulated增长的大鼠前列腺53]。另一方面,大大阻碍了HIF-1 2我α表达相比,睾酮alone-treated动物。之前报道,2我的抗增殖活动涉及HIF-1抑制α(54,55]。此外,抑制HIF-1α据报道,抑制炎性细胞因子和肿瘤坏死因子-α(56,57]。因此,HIF-1的致病作用α在前列腺增生收益由观测海拔TNF -额外的支持α和il - 1β由睾酮(58]。
2我的命题由抑制HIF-1有益的效果αtgf -β证实了这一发现,p-Smad2对待动物蛋白表达明显降低。这一发现是依照认为Smad蛋白质与细胞对缺氧的反应(59]。此外,抑制TGF -β-Smad据报道减少前列腺癌的细胞增殖信号(60]。除此之外,我们的数据支持的报道2我抑制TGF -的能力β-Smad子宫肌瘤细胞(52]。2我的建议机制防止testosterone-induced增生在图进行了总结6。总之,2我施加抗氧化活性,导致抑制NF -κB激活和核易位,最终导致减少炎症介质的释放。此外,2我抑制HIF-1α表达式,它将导致减少的表达TGF -β和p-Smad2。双臂与降低前列腺细胞增殖。
5。结论
2-Methoxyestradiol防止testosterone-induced PBH在老鼠剂量的高剂量(100毫克/公斤)显示更好的预防效果。至少在一定程度上,这可以归因于HIF-1的抑制α/ TGF -β/ Smad2轴。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
阿什拉夫b Abdel-Naim和奥萨马m . Ashour生成研究的想法。Basma g .开斋节Thikryat Neamatallah艾哈迈德•Esmat和Abdulmohsin j . Alamoudi进行生化、基因表达和免疫印迹分析。贾迈勒美国Abd El-Aziz,奥萨马·m·Ashour Ashraf b . Abdel-Naim艾哈迈德Esmat进行组织学和免疫组织化学研究。阿什拉夫Abdel-Naim,奥萨马·m·Ashour和艾哈迈德Esmat执行统计分析。阿什拉夫b . Abdel-Naim Basma g .开斋节Thikryat Neamatallah,艾哈迈德Esmat,奥萨马·m·Ashour参与写作手稿。
确认
这个项目是由院长以来科研阿卜杜勒阿齐兹国王大学(域),吉达,在批准号g - 308 - 166 - 37。因此,作者承认和感谢安全域的技术和财政支持。