文摘
aucubin能否保护心肌梗死(MI)诱导的心脏重建还不清楚。在这项研究中,在老鼠模型中,心脏重构是引起冠状动脉左前降枝结扎手术。小鼠腹腔注射aucubin mi(10毫克/公斤)3天。mi后两周,老鼠aucubin治疗组显示降低死亡率,减少梗塞面积,改善心脏功能。Aucubin也减少了心脏重塑mi。一致,aucubin体外心肌细胞对缺氧损伤的保护。从力学上看,我们发现aucubin抑制ASK1 /物信号。这些影响被物取消激活。此外,我们发现氧化应激是减毒在体内aucubin-treated小鼠心脏和vitro-treated心肌细胞,导致减少硫氧还蛋白(硫氧还蛋白)消费,导致ASK1形成硫氧还蛋白的复杂活动。在体内和体外Aucubin nNOS-derived没有增加生产。 The protective effects of aucubin were reversed by the NOS inhibitors L-NAME and L-VINO in vitro. Furthermore, nNOS knockout mice also reversed the protective effects of aucubin on cardiac remodeling. Taken together, aucubin protects against cardiac remodeling post-MI through activation of the nNOS/NO pathway, which subsequently attenuates the ROS production, increases Trx preservation, and leads to inhibition of the ASK1/JNK pathway.
1。介绍
包括不良的左心室(LV)重构复杂变化LV的大小、形态、功能、和细胞分子(1]。炎症、细胞凋亡、纤维化和胶原蛋白的成熟瘢痕改造在心肌梗死后心脏(1,2]。虽然早期炎症、细胞凋亡和纤维化是心脏修复的必要事件,不成比例的长期炎症,过度凋亡,和过度的纤维化反应会导致持续的组织损伤和增加细胞损失和不当治疗,促进梗死面积的扩张,导致室膨胀(3,4]。在临床实践中,治疗操作接下来的修复过程已经被证明是更具有挑战性和难以捉摸。因此,探索新的治疗策略,有效地目标这个有害的过程具有十分重要的意义。
Aucubin是一种天然化合物,可以从树叶中提取的Aucuba粳稻和杜仲(5]。它显示了多种药理作用,包括抗炎(6,7],antiapoptosis [8,9),神经保护(10),和抗氧化5,11]属性。通过抑制NF -κB信号,aucubin防止促炎细胞因子诱导的炎症反应(6,7]。Aucubin也报道调节bcl - 2家族蛋白的表达和抑制细胞死亡12和细胞凋亡8,9]。何鸿燊等人报道,aucubin防止UVB-induced皮肤成纤维细胞激活的抑制生产矩阵metalloproteinase-1 [13]。由于炎症、心肌细胞凋亡和纤维化都参与心肌梗死后的心脏重构的发展(1),aucubin对心脏重塑mi后应该有保护作用的抗炎、抗凋亡和antifibrotic属性。直到现在,它仍不清楚aucubin能否延缓甚至逆转心脏重构mi。因此,我们的研究的目的是探讨保护aucubin对心肌梗死后的LV重构的影响。
2。材料和方法
2.1。试剂
Aucubin(纯度98%)是购自上海Winherb医疗科技发展有限公司(上海,中国)。主要的抗体伯灵顿,bcl - 2, c-caspase 3, TNFα、磷酸化和总物、nNOS GAPDH是购买从细胞信号技术(马、美国)。硫氧还蛋白抗体总ASK1, SOD, gp91, P67,进气阀打开,以挪士是购自Abcam(英国剑桥)。圣克鲁兹的磷酸化抗体ASK1买来Inc .(美国TX)。
2.2。动物
所有动物程序依法进行指导发表的实验动物保健和使用由美国国家卫生研究院(NIH出版物编号为85 - 23,1996年修订)和批准的动物保健和使用委员会的武汉大学人民医院。8 - 12个男性C57 / BL6老鼠购买实验动物研究所的科学(中国,北京)。nNOS-KO老鼠从杰克逊实验室购买。动物被随机分配到4组:vehicle-sham集团aucubin-sham集团vehicle-MI集团和aucubin-MI组。aucubin管理(10毫克/公斤,腹腔内注射)进行3天MI手术后和维护为11天。
2.3。左冠状动脉结扎手术
左冠状动脉结扎手术(小伙子),在我们之前的研究(14]。简单地说,老鼠被戊巴比妥钠麻醉(50毫克/公斤,ip)。打开心包,7丝缝合后用于结扎左冠状动脉下行。在sham-operated老鼠,没有结扎左冠状动脉是包围在虚假的手术的老鼠。的操作和分析失明。
2.4。超声心动图和血流动力学
超声心动图和血流动力学进行了测量,如我们之前所述研究[14]。短暂,MyLab 30简历超声波(Biosound Esaote)使用。
对于血流动力学测量,microtip导管传感器(spr - 839;米勒仪器,休斯顿,德克萨斯州)使用。
2.5。组织学分析和免疫组织化学
苏木精和伊红(他)染色和马森三色的染色进行,正如我们之前研究描述(14]。免疫组织化学的核心部分是孵化主要抗体anti-CD68 (ABD Serotec MCA1957)和anti-CD45 (Abcam ab10558)。然后,部分与想象™孵化+ /合试剂和彩色涂检测设备。
2.6。TUNEL染色
TUNEL染色了,因为我们之前描述的研究(14]。简单地说,用TUNEL检测(美国微孔)根据制造商的指示。荧光显微镜(奥林巴斯DX51)是用来评估凋亡细胞。
2.7。没有和活性氧检测
没有确定生产硝酸盐和亚硝酸盐的测定使用格里斯反应试验(开曼化工、安阿伯、MI)根据制造商的指示15]。
2,7-dichlorodihydrofluorescein二乙酸(DCF-DA英杰公司)是用于检测活性氧水平标仪来检测激发波长为488 nm和排放在525海里。
2.8。rt - pcr和免疫印迹分析
rt - pcr和免疫印迹进行,我们之前描述的研究(14]。短暂,总RNA提取reverse-transcribed互补。LightCycler 480 SYBR绿色1主混合(04707516001;罗氏公司)被用来量化放大。GAPDH基因被用作参考。
免疫印迹,心肌细胞和心脏组织细胞溶解,然后加载sds - page。转移膜后,主要抗体被用来孵化污点。与二次抗体孵化后,墨迹扫描了一种双色红外成像系统(奥德赛,LI-COR)。GAPDH蛋白质被用来作为参考。
2.9。细胞培养
H9c2细胞培养进行了,因为我们之前研究描述(14,16]。细胞用aucubin预处理(1μ10米,μ50米,μ米)和/或NAC(10毫米),L-NAME (100μL-VINO(10米)μ米),L-canavanine(1毫米)12 h,然后暴露于低氧在BioSpherix C-Chamber(5%氧气)24 h。对照组细胞培养在5%的股份有限公司2和95%的空气在37°C。
2.10。统计分析
数据呈现的 。单向方差分析之后,图基的事后测试被用来分析组间的差异。学生的以及用于分析两组之间的差异。一个值小于0.05被认为是显著的。
3所示。结果
3.1。Aucubin提高存活率和Postinfarction心脏功能
虚假的组的老鼠还活着在观察期结束aucubin和vehicle-treated虚假的组。vehicle-MI组小鼠的生存率明显低于aucubin-MI组(分别为61.6%和30%; ;图1(一))。此外,氯化三苯基四氮唑(TTC) 1%,σ,美国)染色显示aucubin减少梗塞大小的比例在MI后2周,如图1 (b)和1 (c)。
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超声心动图和血流动力学测量显示,aucubin改善心脏功能障碍2周mi,就是明证提高LVEF, LVFS, dP / dtmax, dP / dtmin, ESP和减少EDP aucubin-treated老鼠的价格相比vehicle-treated老鼠(数字1 (d)和1 (e))。然而,aucubin并不影响心率在虚假的或MI组(图1 (e))。值得注意的是,在基础条件下,aucubin政府并不影响正常的心脏结构和功能。
3.2。心脏肥大和纤维化mi Aucubin减毒
MI在2周后,心脏重量的比率(HW) /体重(BW), HW /胫骨长度(TL)和肺重量(LW) / BW在vehicle-treated显著增加小鼠(图2(一个))以及横截面面积(CSA)的心肌细胞(图2 (b))。Aucubin治疗抑制这些改变。一致,aucubin也阻碍了增加LVEDd和LVESd mi(图2 (c))。此外,aucubin肥厚性标记的转录水平下降,同时增加α肌球蛋白重链(αmhc)表达水平的价格相比汽车集团(图2 (d))。
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同时,aucubin也减少间质纤维化mi的价格相比汽车集团(图2 (e))以及纤维化标志物的表达(图2 (f))。这些数据表明,管理aucubin减轻心脏肥大和纤维化mi。
3.3。Aucubin抑制炎症和细胞凋亡
CD45和CD68免疫组织化学染色(白细胞和巨噬细胞标记,resp)。在梗塞的边界区显示减少白细胞和巨噬细胞的浸润aucubin-treated老鼠心脏而车辆老鼠心脏(图3(一个))。此外,aucubin减少促炎细胞因子的表达水平较vehicle-MI mi组(图3 (b))。
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TUNEL分析被用来检测心肌细胞凋亡。MI诱发大量的细胞凋亡在心肌细胞(图3 (c))与降低凋亡bcl - 2蛋白的表达和减少表达proapoptotic蛋白质伯灵顿和裂解半胱天冬酶3(图3 (d)),而aucubin减少凋亡细胞数量和增加bcl - 2表达和降低了伯灵顿和裂解半胱天冬酶3表达(数据3 (c)和3 (d))。
aucubin对心肌细胞的直接影响测定体外研究。在使用aucubin (1μ10米,μ50米,μ米)12 h,心肌细胞缺氧暴露在24 h。CKK8结果显示,10μ米和50μM aucubin可以提高细胞生存能力,而1μM aucubin似乎不能保护心肌细胞暴露于低氧后12 h(图3 (e))。因此,10μ米和50μM aucubin选择执行进一步的研究。符合我们体内的结果,两个10μ米和50μ分别M aucubin TUNEL-positive细胞的数量减少(图3 (f))。因此,伯灵顿的表情和裂解半胱天冬酶3显著减少,和抗凋亡蛋白bcl - 2治疗后增强了aucubin(图3 (g))。
3.4。Aucubin抑制TNF的MI和低氧诱导激活α-ASK1-JNK信号
识别aucubin政府的潜在机制,我们检测到的信号通路参与心脏重塑mi。MI诱导增加TNF的表达αJNK1/2磷酸化水平的增加和ASK1。这些水平是完全被aucubin治疗(数字4(一)和4 (b))。一致,低氧诱导增强TNF的表达α和激活ASK1和JNK1/2被50μM aucubin预处理(数据4 (c)和4 (d))。
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进一步验证是否TNF aucubin目标α-ASK1-JNK信号级联来执行其心血管效应,物抑制剂(SP600125)和受体激动剂(茴香霉素)。SP600125显著降低低氧诱导细胞凋亡。重要的是,aucubin不能进一步改善细胞凋亡减少了SP600125(数字4 (e)和4 (f))。物受体激动剂,茴香霉素,加速低氧诱导细胞凋亡而废除aucubin的凋亡效应(数字4 (g)和4 (h))。综上所述,抑制肿瘤坏死因子α-ASK1-JNK信号通路的保护作用占aucubin心脏重塑。
3.5。Aucubin变弱氧化应激,提高硫氧还蛋白(硫氧还蛋白)的体内和体外
在生理条件下,硫氧还蛋白债券ASK1导致其失活。在各种刺激下,ASK1硫氧还蛋白磷酸化和分离的,导致其激活(17]。然后我们发现aucubin治疗后的氧化应激。NADPH氧化酶亚基,P67 gp91,被aucubin下降,而抗氧化剂SOD和硫氧还蛋白增加aucubin治疗体内改造小鼠心脏和心肌细胞暴露于低氧(数字5(一个),5 (b),5 (d),5 (e))。Aucubin也减少ROS在心肌细胞暴露于低氧(图生产5 (f))。我们进一步发现一氧化氮(NO)生产减少改造小鼠心脏和hypoxia-damaged aucubin治疗后心肌细胞和增加(数据5 (c)和5 (g))。
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3.6。nNOS介导Aucubin体外的保护作用
一氧化氮合成酶(诺斯)是负责从精氨酸的合成没有。因此,NOS表达aucubin治疗后检测。神经元NOS (nNOS),诱导NOS(间接宾语)和内皮NOS(以挪士)都是调节改造小鼠心脏和hypoxia-damaged心肌细胞。然而,只有nNOS进一步增加了aucubin治疗(数据6(一)和6 (c))。我们进一步确认的角色nNOS aucubin-mediated保护作用。心肌细胞是用aucubin预处理和活性氧清除剂N-acetyl-cysteine (NAC),然后刺激与H2O2诱导氧化应激。H2O2细胞生存能力降低,增加活性氧的生产,而aucubin和NAC可以维持细胞生存能力和减少活性氧的水平。合作aucubin和南汽不能提高这些保护作用(数字6 (e)和6 (f))。心肌细胞是使用非选择性NOS抑制剂(L-NAME),选择性nNOS抑制剂(L-VINO)或选择性伊诺抑制剂(L-canavanine),然后aucubin是暴露于低氧。L-NAME和L-VINO逆转aucubin的保护作用,减少细胞生存能力和评估的ROS水平增加(数据6 (g)和6 (h))。此外,伊诺抑制剂不能阻止aucubin的保护作用,可以通过增加细胞生存能力和减少ROS水平(数字6 (g)和6 (h))。
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3.7。nNOS淘汰赛(KO)废除了Antiremodeling Aucubin体内的影响
nNOS KO小鼠受到小伙子aucubin治疗的手术和管理。两周后,nNOS-KO老鼠经历了高死亡率(图7(一)),增加梗死区(数字7 (b)和7 (c)),增加了心肌肥大(数字7 (b)和7 (d))、纤维化(数字7 (e)和7 (f))和细胞凋亡(数字7 (g)和7 (h))。然而,aucubin治疗不能改善这些恶化的结果(数据7(一)和7 (h))。
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4所示。讨论
心肌梗死后心肌ischemia-mediated坏死和凋亡促进心衰的进展(18]。因此,针对防止心脏重塑的细胞凋亡是一种很有前途的战略。有研究报道aucubin在PC12细胞的凋亡作用[19)和神经细胞(20.]。在这项研究中,我们发现MI-induced细胞凋亡,诱导心肌细胞凋亡均减毒aucubin治疗,从随后的炎症和保护心脏肥厚性反应和纤维化,最终导致心脏重构和改善小鼠的存活率增加。两个通路调节细胞凋亡在梗塞的心:一个是内在通过线粒体信号通路激活;另一个是外在途径由死亡的绑定与死亡受体配体在细胞表面(18]。研究表明,aucubin参与两个内在(20.)和外在途径(21]。我们的数据表明,aucubin监管bcl - 2家族蛋白的表达和减少乳沟的半胱天冬酶3,这表明内在途径的抑制。
肿瘤坏死因子α,发布了许多炎症细胞以及心肌梗死后心肌细胞,是调节细胞凋亡(1]。肿瘤坏死因子α结合对肿瘤坏死因子α受体的激活导致ASK1 [16]。激活后,ASK1激活物通过招募oligomerized IRE1复合物,导致其激活(17,22]。激活物可以使磷酸化proapoptotic蛋白质,荡妇,并阻止凋亡蛋白bcl - 2,导致proapoptotic蛋白/凋亡蛋白比例的失衡,因此细胞凋亡(17]。在我们的研究中,肿瘤坏死因子α被发现增加mi和缺氧暴露诱导激活ASK1 /物的途径。这个信号被aucubin治疗。有趣的是,物抑制剂逆转aucubin的保护作用对心肌细胞缺氧模型。这些数据表明,aucubin施加anticardiac重构效果通过抑制ASK1 /物的途径。
ASK1作为氧化还原传感器。在生理条件下,硫氧还蛋白债券ASK1导致其失活。在各种刺激(TNFα或各种氧化剂),ASK1硫氧还蛋白磷酸化和分离的,导致其激活(23]。ASK1 /物的激活信号通过氧化应激和肿瘤坏死因子α导致细胞凋亡在不同的细胞类型。因此,消极的调节器,硫氧还蛋白是一个潜在的目标(24]。我们发现aucubin衰减超过氧化应激和保存Trx改制的老鼠心脏和心肌细胞,从而阻止ASK1的激活。不,自由基气体,起着重要的作用在氧化还原信号在心脏疾病。在心脏,没有主要来源于经典L-arginine-NOS-NO通路(25]。没有可以针对不同类型的蛋白质,导致下游信号级联激活的数组。兴趣,nNOS表达的所有部分的心,及其派生的没有心脏的病理生理过程中起着基本的作用[26]。nNOS航天飞机进入细胞核,条带和规范元素参与氧化磷酸化和线粒体生物起源26]。此外,通过直接瞄准心脏氧化酶类,如硫氧还蛋白氧化还原酶,和NADPH氧化酶,nNOS-derived没有控制氧化还原信号和下游影响心脏(27]。我们发现aucubin-triggered减少氧化应激介导的增强nNOS-NO途径。Aucubin nNOS表达增加导致增强没有生产和随后的减少氧化应激。这个保护aucubin被nNOS缺乏完全废除。
总之,我们的数据表明aucubin减轻心脏重塑过程中应对MI和改善心脏功能和小鼠的存活率。这些保护作用的aucubin涉及nNOS /不通路的调节,从而导致减少氧化应激和随后ASK1 /物信号的阻塞。存在一些限制在我们的研究中。首先,只有一个剂量是用于我们的体内研究。未来研究的分布aucubin腹腔内注射后血液中,应确定适当的剂量。第二,aucubin是否会影响其他细胞类型和信号通路在心脏重塑的过程中需要进一步研究。
的利益冲突
作者希望确认没有利益冲突与此相关出版物。
作者的贡献
郑杨和启朱唐导致的概念和设计实验;郑,青青吴、杨小、明夏段,陈和刘进行实验;海汉辽元人民币,燕燕的男人,分析实验结果,修订后的手稿。郑杨、吴青青和杨小撰写并修改了手稿。
确认
这项工作是支持由中国国家自然科学基金(号。81470516,81530012,81700353),湖北省优秀医学学术领袖计划,中国湖北省自然科学基金(没有。2016 cfb254),中央大学,基础研究基金批准号2042017 kf0060。