萝卜硫素调节AQP8-Linked在白血病细胞氧化还原信号gydF4y2Ba

文摘gydF4y2Ba

萝卜硫素,生物活性异硫氰酸酯化合物从十字花科蔬菜中提取,已被证明对许多人类肿瘤细胞发挥细胞毒性的影响,包括白血病。然而,背后的确切分子机制萝卜硫素在血液恶性肿瘤的作用仍不清楚。像其他癌细胞,白血病细胞产生高水平的活性氧;特别是,过氧化氢来自氮氧化物家庭参与各种氧化还原信号转导途径,促进细胞增殖和生存。最近的证据表明,许多肿瘤细胞表达高水平的水通道蛋白亚型,和我们之前证明aquaporin-8充当HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba运输B1647细胞的质膜之间传递,人类急性髓系白血病的典范。因此,控制AQP8-mediated HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba运输可能是一个新策略来调节细胞信号和生存。为了这个目的,我们评估萝卜硫素是否会以某种方式影响aquaporin-8-mediated HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba运输和/或Nox-mediated HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba生产B1647细胞系。结果表明,萝卜硫素抑制aquaporin-8和Nox2表达式,从而减少B1647细胞生存能力。此外,通过coimmunoprecipitation技术获得的数据表明,这两种蛋白质是互相联系;因此,萝卜硫素在调节下游有一个重要的角色轴Nox2-aquaporin-8引发的事件。细胞治疗萝卜硫素也减少peroxiredoxin-1的表达,增加在几乎所有急性髓系白血病亚型。有趣的是,萝卜硫素浓度能够触发这些影响是通过饮食摄入十字花科蔬菜,可实现的确认的重要性,富含生物活性化合物的饮食的有益作用。gydF4y2Ba

1。介绍gydF4y2Ba

整个植物食品的消费作为chemopreventive代理商强烈推荐的膳食指南的基础上健康从饮食植物化学物质在流行病学研究gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。在食用植物,十字花科蔬菜已经被证明起到强有力的抗癌的作用由于异硫氰酸酯的存在,硫代葡萄糖酸盐的水解产品。在十字花科蔬菜,西兰花含有芥子油苷glucoraphanin浓度最高,由芥子酶水解和肠道微生物群,释放萝卜硫素,SFN(异硫氰酸4-methylsulfinylbutyl)。除了众所周知的抗癌活性(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba),SFN已经证明拥有心血管(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba),神经保护(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba),和抗炎活动(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba),暗示这营养复合的多效性的保护作用。gydF4y2Ba

SFN的有力chemopreventive效应是基于目标的能力控制致癌作用的细胞内的多种机制。许多报告表明SFN防止由抑制肿瘤起始阶段我酶(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)和激活第二阶段解毒酶(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。此外,SFN防止不受控制癌细胞扩散通过调制基因参与细胞凋亡和细胞周期阻滞gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba),血管生成(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba),和转移(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

SFN细胞毒性效应也被证明在血液恶性肿瘤gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,据报道,SFN HL-60治疗和急性淋巴细胞白血病细胞引发细胞凋亡和细胞周期阻滞(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]。白血病是癌症相关死亡的主要原因之一,和高易感性治疗相关的毒性仍是治疗成功的主要限制。因此,小说的识别和发展代理从天然产物来抵消这种疾病需要为了最大化的疗效,减少抗肿瘤的耐药性加剧患者和治疗相关的毒性剂量的多种药物。gydF4y2Ba

在人类erythromegakaryocytic细胞系B1647,急性髓系白血病的典范,既定的生产VEGF及其酪氨酸激酶受体表达,VEGFR-2 [gydF4y2Ba18gydF4y2Ba),我们表明,VEGF信号耦合NAD (P) H氧化酶(Nox)活动gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。特别是,HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba生成通过Nox2——Nox4-dependent通路参与早期信号事件,如VEGFR-2磷酸化状态的维护,以及下游事件的调制导致细胞增殖和生存gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。必须指出,HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba派生的氮氧化物形成在细胞外,必须穿过膜达到其胞质目标。这方面,据报道,具体水通道蛋白亚型有能力将HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在质膜在许多细胞类型(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。特别是,AQP8同种型表明H通道的能力gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba通过等离子体膜在B1647细胞系(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba),海拉(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba)和B (gydF4y2Ba27gydF4y2Ba)细胞。gydF4y2Ba

此外,肿瘤细胞AQP过表达和肿瘤组织学年级之间存在正相关关系,AQP表达与正常组织相比gydF4y2Ba28gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

AQP8-mediated H的抑制gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba进入细胞,或减少AQP8表达式,需要Nox-derived HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba不能发挥其促生长效果。因此,控制AQP8-mediated HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba运输提供了一个新颖的机制来调节细胞信号和生存。gydF4y2Ba

本研究旨在评估潜在的抗癌活性SFN B1647白血病细胞系,关注AQP8函数和表达式。我们也调查了Nox2 SFN的影响,Nox4,酶类的表达和VEGFR-2和一种蛋白激酶的磷酸化状态。gydF4y2Ba

2。材料和方法gydF4y2Ba

2.1。化学药品和试剂gydF4y2Ba

杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM),罗斯威尔公园纪念研究所(RPMI) 1640中、青霉素、链霉素、谷酰胺,phytohaemagglutinin (PHA)、3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT), DAPI,里帕裂解缓冲,10% SDS溶液中,哺乳动物蛋白酶抑制剂混合物,磷酸酶抑制剂鸡尾酒PhosSTOP(罗氏)Laemmli示例包含2-mercaptoethanol缓冲,Tris-HCl,牛血清白蛋白(BSA),汉克的平衡盐溶液(hbs), 2, 7-dichlorodihydrofluorescin二乙酸(DCFH-DA) plumbagingydF4y2Ba石墨籼gydF4y2Ba(5-hydroxy-2-methyl-1 4-naphthoquinone)和所有其他化学品都从Sigma-Aldrich购买。Iscove修改杜尔贝科的介质(IMDM)与谷酰胺、胎牛血清(的边后卫),和人类血清AB男(HS)购买来自擤鼻涕。DL-Sulforaphane (SFN) (LKT实验室)溶解在DMSO和存储在−20°C股票10毫米的浓度。绝对的RNA Miniprep工具包是安捷伦科技;RNA-to-cDNA转换工具包是应用生物系统公司;SsoAdvanced™普遍SYBR绿色Supermix Bio-Rad实验室;和AQP8 rt - pcr引物,gydF4y2BaβgydF4y2Ba从Sigma-Aldrich 2-microglobulin,肌动蛋白制造。从Ambion SiRNA Nox4和炒了生命科技(美国)。Mini-PROTEAN®TGX™预制凝胶4 - 20%,精度+蛋白质™清白的标准,清晰™西方ECL衬底,直流™蛋白质化验来自Bio-Rad实验室。硝化纤维膜来自通用电气医疗集团。主要抗体:AQP8 (# WH0000343)gydF4y2BaβgydF4y2Ba肌动蛋白(# A5441)来自Sigma-Aldrich, phospho-Akt (Ser473)(# 4058)和Prx-1(# 8499)从细胞信号技术,从热phospho-VEGFR-2科学、gp91-phox (Nox2)从微孔,并从圣克鲁兹Nox4。二次抗体:辣根peroxidase-conjugated二级抗体anti-rabbit(# 7074)和anti-mouse(# 7076)从细胞信号购买技术;山羊anti-Mouse免疫球蛋白(H + L)高度Cross-Adsorbed二级抗体,Alexa萤石®+ 488 (# A32723)来自热科学。gydF4y2Ba

2.2。细胞培养gydF4y2Ba

B1647 erythromegakaryocytic细胞株,建立骨髓的急性骨髓性白血病(AML)患者,是培养与5% (IMDM补充gydF4y2BavgydF4y2Ba/gydF4y2BavgydF4y2Ba)热灭活HS、谷酰胺100 U /毫升青霉素,100gydF4y2BaμgydF4y2Bag / mL链霉素在湿润孵化器维持在37°C和5%的公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

人类成纤维细胞生长和a .洛伦西尼教授提供的请博洛尼亚大学。gydF4y2Ba

外周血淋巴细胞(PBL)是由密度梯度离心法分离histopaque - 1077全健康献血者外周血。PBL是培养在37°C和5%股份有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Barpmi - 1640年青霉素和链霉素补充1%,15%热灭活的边后卫,PHA谷酰胺,1%和0.5%。gydF4y2Ba

2.3。细胞生存能力gydF4y2Ba

MTT测定细胞生存能力评估。细胞治疗SFN浓度增加(5 10到30gydF4y2BaμgydF4y2Ba米)24 h 96 -孔板,然后孵化与肝癌和0.5毫克/毫升4 h 37°C。到紫罗兰甲瓒盐晶体溶解,形成溶液化的解决方案(10% SDS, 0.01 M盐酸)保持盘子一夜之间在37°C和5%的公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在湿润的气氛中。570纳米的吸光度测量使用多井板读者(Wallac胜利者gydF4y2Ba^2gydF4y2BaPerkinElmer)。gydF4y2Ba

2.4。信使rna表达通过rt - pcr分析gydF4y2Ba

后24 h与SFN治疗(1、5或10gydF4y2BaμgydF4y2Ba米),总RNA提取使用绝对从B1647细胞RNA Miniprep装备根据制造商的建议。RNA进行量化使用NanoVue分光光度计(通用电气医疗集团)。信使rna reverse-transcribed进cDNA从1开始gydF4y2BaμgydF4y2Ba使用高容量RNA-to-cDNA g总RNA的转换工具。PCR进行总量的20倍gydF4y2BaμgydF4y2BaL包含2gydF4y2BaμgydF4y2BaL (cDNA、10gydF4y2BaμgydF4y2BaL SsoAdvanced™普遍SYBR绿色Supermix, 1gydF4y2BaμgydF4y2Ba每个引物的L(500海里)。所使用的特定的引物是由Sigma-Aldrich: AQP8(向前序列:TTCTCCATCGGCTTTGCCGTCA;反向序列:CAGCCAGTAGATCCAGTGGAAG;扩增子135 pb),gydF4y2BaβgydF4y2Ba肌动蛋白(向前序列:5gydF4y2Ba - - - - - -gydF4y2BaAAGACCTCTATGCCAACAC-3gydF4y2Ba ;gydF4y2Ba反向序列:5gydF4y2Ba - - - - - -gydF4y2BaTGATCTTCATGGTGCTAGG-3gydF4y2Ba ),gydF4y2Ba和gydF4y2BaβgydF4y2Ba2-microglobulin(向前序列:5gydF4y2Ba - - - - - -gydF4y2BaACTGGTCTTTCTACATCCTG-3gydF4y2Ba ;gydF4y2Ba反向序列:5gydF4y2Ba - - - - - -gydF4y2BaAGATGATTCAGAGCTCCATAG-3gydF4y2Ba )。gydF4y2BaβgydF4y2Ba肌动蛋白和gydF4y2BaβgydF4y2Ba2-microglobulin被用作参考基因。反应混合物在45°C,保持45分钟2分钟在94°C,然后骑35次通过30年代的一个程序在94°C, 1分钟56岁°C,在72°C和1分钟;最后,反应是孵化一个额外的7分钟在68°C。规范化表达水平计算相对于控制细胞根据2gydF4y2Ba^{-ΔΔCTgydF4y2Ba}方法。gydF4y2Ba

2.5。细胞转染gydF4y2Ba

B1647与细胞系细胞nucleofected Nucleofector™工具V (Amaxa生物系统公司、德国科隆)程序t - 019后,制造商的指示。反对Nox4核(序列5gydF4y2Ba - - - - - -gydF4y2Ba3gydF4y2Ba :gydF4y2BaCAACUCAUAUGGGACAAGAtt;从Ambion反义UCUUGUCCCAUAUGAGUUGtt)和炒了生命科技(美国)。RNA沉默与300 nM siRNA获得。随后,细胞就悬浮在完全培养基和孵化湿润37°C / 5%的股份有限公司gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba孵化器。24小时后,细胞用于实验:评价Nox4表达式通过免疫印迹分析和细胞内ROS水平测量。gydF4y2Ba

2.6。电泳和免疫印迹分析gydF4y2Ba

后24 h与SFN治疗(1、5或10gydF4y2BaμgydF4y2Ba米),B1647细胞(1×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba/毫升)与冰冷的PBS和细胞溶解洗里帕缓冲区包含哺乳动物蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物。蛋白质浓度的清除溶解产物是由Bio-Rad直流™蛋白质分析。蛋白质(10gydF4y2BaμgydF4y2Bag每车道)electrophoretically分离在4 - 20% sds - page Mini-Protean®TGX™预制凝胶使用Mini-Protean II装置(Bio-Rad实验室)和转移到Hybond-C硝化纤维膜。非特异性结合被孵化避免膜阻断缓冲区中含有5% (gydF4y2BawgydF4y2Ba/gydF4y2BavgydF4y2Ba)白蛋白Tris-buffered盐水(TBS) /渐变,然后探讨了硝化纤维膜在一夜之间在4°C主要抗体(anti-AQP8、anti-Nox2 anti-phospho-VEGFR-2, anti-phospho-Akt, anti-Nox4,或反gydF4y2BaβgydF4y2Ba肌动蛋白内部标准化者)。硝化纤维膜洗了TBS /渐变和孵化室温1 h和辣根peroxidase-conjugated二级抗体在TBS /渐变包含脱脂奶粉5%或5%白蛋白和先后洗TBS /渐变。化学发光检测是使用清晰执行™西方ECL衬底。乐队获得了CCD成像仪(ChemiDoc™议员制度,Bio-Rad实验室),和相对光密度分析进行实验室通过使用图像分析软件(Bio-Rad实验室)。gydF4y2Ba

2.7。免疫荧光共焦显微镜gydF4y2Ba

B1647细胞治疗10gydF4y2BaμgydF4y2BaM SFN 24 h,加载到cytospin钱伯斯在450转离心10分钟。细胞被固定在甲醛3.7%,持续15分钟,洗两次PBS,阻止了PBS / BSA 1% (gydF4y2BawgydF4y2Ba/gydF4y2BavgydF4y2Ba)1 h,孵化用鼠标anti-AQP8抗体1 h。连续,细胞治疗与荧光山羊anti-Mouse二级抗体,Alexa萤石®+ 488共轭1 h在黑暗中,原子核与DAPI染色,盖玻片是安装在幻灯片。共焦成像获得了尼康A1共焦激光扫描显微镜(日本尼康仪器)。gydF4y2Ba

2.8。测量细胞内ROS水平gydF4y2Ba

B1647细胞治疗5或10gydF4y2BaμgydF4y2BaM SFN 24 h,当指定,1gydF4y2BaμgydF4y2BaM plumbagin 30分钟。评价细胞内ROS水平,1×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞/毫升洗两次在哈佛商学院和孵化20分钟和5gydF4y2BaμgydF4y2Ba米DCFH-DA 37°C。DCFH-DA是一个小的、非极性和nonfluorescent分子通过细胞膜进入细胞的扩散;胞质中,保持酶的胞内酯酶脱去乙酰基的极性nonfluorescent化合物,由细胞内ROS的高度氧化绿色荧光2,7-dichlorofluorescein (DCF)。DCF荧光测量使用多井板读者(Wallac Victor2, PerkinElmer)。激发波长485 nm,发射波长为535 nm。荧光值报告为细胞内ROS的比例控制。gydF4y2Ba

2.9。免疫沉淀反应gydF4y2Ba

控制或SFN-treated B1647细胞(1×10gydF4y2Ba^6gydF4y2Ba细胞/毫升)是细胞溶解如上所述。一夜之间,溶解产物含有等量的蛋白质被孵化anti-AQP8抗体。然后,样本孵化与蛋白质G-agarose 1.5 h在4°C和颗粒状在12000 xgydF4y2BaggydF4y2Ba30分钟。颗粒与缓冲洗5次(pH = 8)和离心机在12000 xgydF4y2BaggydF4y2Ba为5分钟。样本进行sds - page及免疫印迹分析anti-Nox2如上所述。乐队获得了CCD成像仪(ChemiDoc™议员制度,Bio-Rad实验室),和相对光密度分析进行实验室通过使用图像分析软件(Bio-Rad实验室)。gydF4y2Ba

2.10。统计分析gydF4y2Ba

每个实验至少进行三次,和所有的值表示为±SD方法。单向方差分析是用来比较组间差异其次是Bonferroni测试(棱镜5;GraphPad软件)。的值gydF4y2Ba 被视为具有统计学意义。gydF4y2Ba

3所示。结果gydF4y2Ba

据报道,SFN能够选择性地发挥细胞毒性作用在许多人类肿瘤细胞而不影响正常细胞(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。在这些基地,白血病B1647细胞和人类淋巴细胞或成纤维细胞,选择的模型是非细胞,与SFN浓度增加,孵化和细胞生存能力评估了MTT试验(图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。10和30gydF4y2BaμgydF4y2Ba在B1647 M SFN显示细胞毒性作用,细胞生存能力来控制细胞相比显著降低。在人类淋巴细胞和成纤维细胞,30岁gydF4y2BaμgydF4y2BaM SFN显著降低细胞生存能力;与此同时,10gydF4y2BaμgydF4y2BaM SFN没有任何细胞毒性效应。因此,SFN浓度低于或者至少10一样gydF4y2BaμgydF4y2Ba米被用于后续的实验。gydF4y2Ba

调查机制支撑SFN B1647细胞,观察细胞毒性效应评估AQP8 SFN治疗后表达,因为我们假设SFN可能损害细胞氧化还原状态影响HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba通过AQP8运输通道。为了验证这一假说,B1647细胞治疗与不同浓度SFN 24 h, AQP8的表达是通过rt - pcr(图评估gydF4y2Ba2(一个)gydF4y2Ba)和免疫印迹(图gydF4y2Ba2 (b)gydF4y2Ba)分析。gydF4y2Ba

结果表明,AQP8显著降低转录和蛋白质含量在细胞治疗10gydF4y2BaμgydF4y2BaM SFN,而1或5gydF4y2BaμgydF4y2BaM SFN并没有造成任何重大变化。gydF4y2Ba

以证实这些发现,B1647细胞治疗10gydF4y2BaμgydF4y2BaM SFN,然后在质膜AQP8内容是评估使用immune-fluorescence通过共焦显微镜(图技术和可视化gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

正如预期的那样,SFN治疗强绿色荧光降低B1647等离子体膜,确认SFN的能力减少AQP8水平,同意rt - pcr和免疫印迹数据。gydF4y2Ba

因为SFN减少AQP8水平,它是合理的,一个小数量的HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba运输到细胞。调查这方面,B1647细胞孵化24 h浓度随着SFN然后化验ROS水平通过使用光纤荧光探针。结果在图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba显示,只有10gydF4y2BaμgydF4y2BaM SFN治疗导致明显降低活性氧对细胞内水平控制的细胞,根据以前的观测。gydF4y2Ba

为了更好地阐明SFN背后的机制能够减少细胞内ROS水平,我们调查SFN影响H的来源gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba出现在B1647细胞。这方面,我们先前已经表明,H的主要来源gydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在B1647细胞系Nox2和Nox4亚型(gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。Nox-derived ROS参与早期信号事件,如auto-phosphorylation VEGFR-2导致下游事件,包括维护活动的一种蛋白激酶的磷酸化形式(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。因此,SFN的可能影响Nox亚型表达和磷酸化水平的VEGFR-2和Akt B1647细胞系(图进行调查gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

免疫印迹分析显示,当处理10gydF4y2BaμgydF4y2BaM SFN B1647细胞表达Nox2比控制在较小程度上,表现出一种减少VEGFR-2和一种蛋白激酶磷酸化水平。另一方面,Nox4的数量显著增加。这个结果可以解释观察到的轻微下降,细胞内ROS水平在SFN治疗。更好地欣赏Nox2 SFN影响,Nox4同种型被plumbagin抑制,Nox4抑制剂(gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba),或用siRNA反对Nox4沉默。图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba显示细胞内ROS水平的评价存在plumbagin(图gydF4y2Ba6(一)gydF4y2Ba)或特定Nox4沉默后(图gydF4y2Ba6 (b)gydF4y2Ba)。有趣的是,SFN治疗导致更加明显减少细胞内ROS内容当Nox4抑制或沉默。gydF4y2Ba

最近报道,水通道蛋白可以有蛋白质交互合作伙伴(gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba];因此,AQP8之间可能的相互作用和Nox2 B1647细胞中活性氧的主要来源,研究通过免疫沉淀反应技术。结果在图gydF4y2Ba7gydF4y2Ba表明Nox2 AQP8共沉淀,说明这两个蛋白质之间强有力的联系。正如所料,在10gydF4y2BaμgydF4y2BaM SFN治疗,相对应的乐队Nox2明显失去强度,根据AQP8减少SFN的效果和Nox2表达式。以证实这一结果,“gydF4y2Ba亦然gydF4y2Ba“执行免疫沉淀反应,即。,IP for Nox2 and WB for AQP8, and also, in this case, the coprecipitation of the two proteins was observed (not shown).

(插件可以)抗氧化蛋白催化半胱氨酸展示伟大的容易被过氧化氢氧化gydF4y2Ba32gydF4y2Ba];因此,他们peroxide-dependent信号途径有重要的调控作用。此外,插件可以被发现在许多人类提升癌症细胞和组织,在那里他们增强积极的生存表型,并赋予增加抗化疗和放射疗法(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。为了确定SFN可能影响Prx-1表达式,B1647细胞孵化与SFN 24 h,然后进行免疫印迹分析,如在图gydF4y2Ba8gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

结果表明,细胞治疗10gydF4y2BaμgydF4y2BaM SFN 24 h显著降低Prx-1表达式。gydF4y2Ba

4所示。讨论gydF4y2Ba

在先前的研究在B1647细胞系,我们已经表明,AQP8表达调节下游VEGF信号的振幅,通过参与的Nox-produced HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba作为第二信使[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。因此,这AQP同种型罚款水平监管机构获得了一个重要的角色在氧化还原信号的转导。据报道,活细胞可以调节的渗透性AQP8 HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba通过临时修改功能半胱氨酸和水,特别是在细胞压力条件(gydF4y2Ba34gydF4y2Ba,gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]。极大的兴趣似乎能够调节的分子识别的活动和/或表达AQP8同种型以影响细胞反应。特别是注意指向自然产品的标识或休分子作为chemopreventive代理。在这些前提,我们调查的潜在影响异硫氰酸SFN的调制AQP8和氮氧化物表达在白血病B1647细胞系。由于很多gydF4y2Ba在活的有机体内gydF4y2Ba和gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba研究,指出,SFN能够选择性地发挥细胞毒性作用在不同的人类癌症细胞,而没有细胞毒性效应,甚至被cytoprotective在正常细胞(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。治疗HL-60细胞随着SFN的浓度(0 - 100gydF4y2BaμgydF4y2Ba米)据报道,诱导剂量依赖性降低细胞生存能力,集成电路gydF4y2Ba_50gydF4y2Ba值确定为49.5gydF4y2BaμgydF4y2Ba米(gydF4y2Ba36gydF4y2Ba];在前b(急性淋巴细胞白血病)和t细胞系,观察,SFN诱导细胞毒性浓度从4到10gydF4y2BaμgydF4y2Ba在90年与MgydF4y2BaμgydF4y2BaM nonleukemic控制(gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]。这些数据表明高SFN浓度需要对正常细胞发挥细胞毒性作用,而低浓度引发对转化细胞选择性的影响。我们的数据显示,30岁gydF4y2BaμgydF4y2BaM SFN显著降低白血病和正常细胞的生存能力,而10gydF4y2BaμgydF4y2BaM只在癌症细胞产生细胞毒性效应。因此,SFN浓度低于或等于10gydF4y2BaμgydF4y2Ba米被用于所有的实验。有趣的是,可以真正实现类似的数量级的浓度在人血浆通过膳食摄入十字花科蔬菜。因为它已经估计40 g的新鲜花椰菜芽产生瞬态SFN的血清水平约为2gydF4y2BaμgydF4y2Bamol / L (gydF4y2Ba38gydF4y2Ba),一份200克西兰花可以提供所需的SFN等离子体水平的大约10gydF4y2BaμgydF4y2Bamol / L。gydF4y2Ba

作为我们的结果表明,SFN能够表达下调AQP8表达式,我们可以推测,细胞内ROS的低水平,我们衡量DCFH-DA由于小数量的HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba运输到细胞内。DCFH-DA不特定的HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba但与所有氧化剂反应存在于生物系统(gydF4y2Ba39gydF4y2Ba,gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]。然而,在我们以前的论文,报告数据中执行相同的白血病细胞株,即。,B1647, we measured the intracellular ROS level with both DCFH-DA and PF1, a boronate dye more selective for H_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba比DCFH-DA获得相似的结果(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。此外,在随后的论文,我们发现B1647细胞的细胞内巯基氧化还原状态的双甲酮的方法,能够与半胱氨酸次磺酸反应,形成在HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba作为信号分子的行动。我们观察到一个线性相关性的蛋白质硫醇氧化还原状态和应用刺激,即。HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba10 - 100gydF4y2BaμgydF4y2Bam .这项技术允许我们证明细胞内半胱氨酸氧化的振幅是依赖AQP8表达水平,调节量的HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba能够达到其细胞内目标(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

Nox2表达式在这项研究中观察到的减少,部分抵消了显著增加Nox4表达式。事实上,我们以前证明B1647细胞系表达Nox2 Nox4和持续活跃,但不是其他亚型gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。可以认为,细胞接受SFN治疗可能部署机制来抵消有限的HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba生产(由Nox2)和运输(AQP8)通过加强Nox4表达式。阻塞Nox4活动由特定抑制剂plumbagin或推倒这对碘氧基苯甲醚Nox4沉默导致更加明显SFN影响细胞内ROS(图的内容gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。在这种情况下,Nox2仍然B1647细胞中活性氧的主要来源,SFN效果可以更好的欣赏。虽然据报道,10gydF4y2BaμgydF4y2BaM plumbagin大大抑制HEK293 Nox4活动和LN229细胞(gydF4y2Ba41gydF4y2Ba),在我们的条件下,这plumbagin浓度明显降低B1647细胞生存能力(数据未显示),因此,我们用1gydF4y2BaμgydF4y2Ba据Guida M plumbagin,和同事(gydF4y2Ba42gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

通过使用coimmunoprecipitation技术,我们也证明了Nox2 AQP8互相联系,确认的存在Nox2-AQP8轴B1647细胞系。AQP8之间的交互和Nox2支持的证据的重要性,在氧化还原信号级联这两个合作伙伴。Nox2-AQP8轴的活动也是一个行列式在B细胞激活和分化gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。许多亚型水通道蛋白的蛋白质相互作用,特别是发现AQP0, AQP2, AQP4和AQP5 [gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba]。这些互动的合作伙伴是截然不同的特点,但是他们通常影响易位,走私、内化,或者磷酸化AQP亚型。B1647 self-producing VEGF细胞系,这是受到连续VEGF信号;因此,轴Nox2-AQP8核心作用在调节下游事件支持他们的生存能力和扩散。这个独特的特征,这些细胞可以解释观察到的SFN-induced细胞内ROS减少。尽管其他报告,获得在不同的细胞类型,展示SFN-induced ROS增加(gydF4y2Ba43gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba45gydF4y2Ba),它已被证明,SFN抑制VEGF的表达(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba9gydF4y2Ba),这是严格与氮氧化物激活。因此,VEGF抑制加上SFN-induced减少Nox2和AQP8表达下降可能导致观察到的细胞内ROS水平B1647细胞系。此外,众所周知,SFN诱导细胞内氧化还原状态的变化,以及根据其浓度,曝光时间,或细胞类型,它可以促进抗氧化或prooxidant响应。从文献的数据,它可以概括,主要是抗氧化剂的反应已经报道在低SFN浓度,即。,5gydF4y2BaμgydF4y2BaM SFN长达24 h,接近我们的条件,而高SFN浓度和长期暴露时间产生一个prooxidant效应(gydF4y2Ba45gydF4y2Ba,gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

SFN的干扰氧化还原信号也证实对VEGFR-2和一种蛋白激酶磷酸化状态的影响,显著降低在SFN-treated细胞。p-VEGFR-2的减少是一个预期的结果,因为ROS源参与VEGFR-2激活已被确认氮氧化物活动(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。小数量的p-Akt SFN-treated细胞观察表明该异硫氰酸酯对其行动也在下游HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba目标,其中Akt代表一个关键酶控制许多癌症的标志。事实上,这种酶的活性磷酸化形式起着举足轻重的作用在肿瘤细胞生存,增殖和侵袭性gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

插件可以丰富thiol-dependent氧化物酶高效降低过氧化氢、过氧硝酸盐和其他氢过氧化物(gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]。由于他们的高反应活性和丰富,插件可以将细胞内过氧化氢的主要目标gydF4y2Ba49gydF4y2Ba),因此重要的监管机构peroxide-dependent信号通路(gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]。除了他们的抗氧化活性,最近的证据表明,插件可以显著影响癌症的开发和发展。Prx-knock-out老鼠经常表现出增强的致癌作用,而提升插件可以表达通常被观察到在人类肿瘤(gydF4y2Ba49gydF4y2Ba]。在白血病细胞,插件可以显示变量表达式,表明不同的功能性意义取决于细胞上下文(gydF4y2Ba51gydF4y2Ba]。特别是,蛋白质组学分析表明,插件可以显著增加在几乎所有急性髓系白血病(AML)亚型;因此,他们提出了作为潜在的目标AML患者(gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]。我们的结果表明,B1647细胞系表达Prx-1在SFN治疗显著降低,表明一个额外的保护作用的异硫氰酸酯对恶性肿瘤。然而,还需要进一步的研究来阐明一个明确的家庭角色插件可以在白血病。gydF4y2Ba

5。结论gydF4y2Ba

这里的数据报告显示,SFN会使AQP8 B1647细胞系和Nox2表达,限制了HgydF4y2Ba_2gydF4y2BaOgydF4y2Ba_2gydF4y2Ba生产和进入细胞。因此,过氧化氢的量能够达到其细胞内的目标是减少,和白血病细胞生存能力显著降低。事实上,通过减少Nox2-AQP8轴的影响,SFN造成深远的影响氧化还原信号的转导,因此,细胞存活和增殖,开辟了道路不可预见的机会在战斗中急性髓系白血病。值得注意的是,SFN浓度能够触发这些效应与十字花科蔬菜摄入量后血浆浓度测量。gydF4y2Ba

缩写gydF4y2Ba

SFN:gydF4y2Ba	萝卜硫素gydF4y2Ba
AQP8:gydF4y2Ba	Aquaporin-8gydF4y2Ba
VEGF:gydF4y2Ba	血管内皮生长因子gydF4y2Ba
VEGFR-2:gydF4y2Ba	血管内皮生长因子受体2gydF4y2Ba
氮:gydF4y2Ba	NAD (P) H氧化酶gydF4y2Ba
插件可以:gydF4y2Ba	的酶类。gydF4y2Ba

数据可用性gydF4y2Ba

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。gydF4y2Ba

信息披露gydF4y2Ba

投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表或论文准备工作。gydF4y2Ba

的利益冲突gydF4y2Ba

作者宣称没有利益冲突和竞争的经济利益存在。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

作者要感谢劳拉Bonsi教授请提供B1647细胞株用于这项研究。这项工作是支持由意大利教育部大学和研究(MIUR)从基金会del Monte e di博洛尼亚拉文纳,意大利。gydF4y2Ba

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