文摘
糖尿病会增加肺动脉高压的风险和与肺血管功能改变有关。不过,目前尚不清楚是否改变糖尿病引起的肺动脉内皮细胞的表型是截然不同的,相比周边内皮。在目前的工作,我们在肺癌和糖尿病并发症之间的差异特征在db / db小鼠主动脉先进的糖尿病。男,20-week-old db / db老鼠显示增加糖化血红蛋白和葡萄糖浓度符合先进的糖尿病。糖尿病肺轻度纤维化的迹象,显示肺动脉内皮细胞明显超微结构的变化。孤立的,从db / db小鼠肺灌注,过滤系数(Kf、c酸)和收缩反应2模拟被加强,而内皮一氧化氮调制肺部缺氧反应的通风和累积的生产受损,没有免疫染色的变化以挪士表达式。反过来,6-keto-PGF1α释放从孤立肺db / db老鼠增加,以及thrombomodulin组织化学染色(CD141)。与肺癌、一氧化氮、ionophore-stimulated acetylcholine-induced血管舒张代,6-keto-PGF的生产1α都从db / db小鼠主动脉环受损。虽然以挪士疣并不改变,CD141明显降低。有趣的是,diabetes-induced硝化的蛋白质在主动脉高于肺。总之,糖尿病诱发明显肺动脉内皮细胞超微结构的变化与渗透率的增加有关肺微循环、一氧化氮血管功能受损,PGI增加补偿2生产,增加CD141表达式。相比之下,在主动脉内皮功能障碍,没有受损,PGI2端依赖功能和减少CD141表达式。
1。介绍
糖尿病诱发深刻变化的主要原因是在体循环和宏观和微血管病,如糖尿病视网膜病变、肾病、心肌梗塞,以及外周动脉疾病(1- - - - - -3]。糖尿病的不利影响在肺部临床上明显较低。然而,流行病学和实验数据表明,胰岛素抵抗和糖尿病影响肺部。糖尿病患者的肺动脉高压和肺栓塞的风险增加(4]。有趣的是,一些研究表明,糖尿病导致的呼吸功能障碍(5- - - - - -7),过敏反应/炎症诱导的敏感性与有限合伙人或呼吸道细菌感染(8- - - - - -10]。的结构性变化blood-alveolar屏障和扩散障碍在活的有机体内也被报道(11,12]。尽管这些报告,胰岛素抵抗和糖尿病的可能的不利影响肺循环没有受到应有的重视,因此糖尿病的病理生理学的研究在这方面在很大程度上被忽视了。我们所知,只有少数报告直接比较系统性和肺循环应对糖尿病在同一实验模型。这种方法可以给更好的理解异同diabetes-induced肺和末梢循环的变化(13,14]。
此外,虽然外围内皮功能障碍是一个公认的标志外围糖尿病宏观和微血管病2,7,15),证据对肺内皮功能障碍在糖尿病的发展是相当矛盾的。一氧化氮的存在和缺乏损伤肺内皮功能已报告(13,16,17]。反过来,肺微血管通透性的增加以挪士没有变化或增加伊诺表达式[也得到了证实13,16- - - - - -18]。
同样,报告diabetes-induced PGI的变化2肺循环的生产也不一致。在基底PGI streptozotocin-treated老鼠2生产和刺激PGI2据报道在肺循环生产增加或保持不变(14,19,20.]。有趣的是,PGI2表达的是一个主要的监管机构thrombomodulin (CD141) [21,22),与凝血酶复合物(花絮)和激活蛋白C作为抗凝剂和内皮保护中介23]。因此,PGI活动的变化2可能导致的变更thrombomodulin的活动,尽管先前的研究报告没有变化(24- - - - - -26]。
鉴于nonconsistent文学,本工作的目的是描述肺血管内皮功能的变化与周边的变化相比在主动脉内皮功能,特别关注没有PGI2端依赖途径。为此,男性db / db小鼠20周时功能先进的糖尿病患者,肺和内皮功能和外围没有PGI2孤立的活动进行了分析,包括糖尿病肺,分别或主动脉环。
2。材料和方法
2.1。动物
20-week-old db / db (BKS.Cg-Dock7m + / + LeprdbJ)和C57BL / 6 j小鼠,从查尔斯河实验室购买,被安置在特定的无菌条件(SPF)和美联储与一个标准实验室饮食和水随意。
本研究中使用的所有实验过程进行了根据动物护理和治疗指南的欧洲共同体和指南发表的实验动物保健和使用由美国国家卫生研究院(NIH出版物编号为85 - 23,1996年修订)。所有程序都是通过当地的大学动物实验伦理委员会(53/2009)。
2.2。血细胞计数、糖化血红蛋白和基底在等离子体生物化学
血液收集麻醉动物(戊巴比妥,140毫克/公斤,i.p)通过一个注射器的右心室nadroparine(浓度:10 U /毫升)分析血细胞计数和糖化血红蛋白,和其余的样品离心获得等离子体(1000 ,5分钟,4°C)。后15分钟内完成血细胞计数分析收集(通过自动血液计数器ABC兽医,HORIBA)。糖化血红蛋白和总血红蛋白浓度测定采用生化分析仪(ABX Pentra 400, HORIBA),比例是糖化血红蛋白的比例。葡萄糖、天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、肌酐、白蛋白、总蛋白测定使用比色方法(ABX Pentra 400, HORIBA)。
2.3。肺组织学分析
肺被麻醉后,缓冲福尔马林固定在4%(24小时),然后脱水,嵌入在石蜡,切成5μ米部分Accu-Cut®SRM™200旋转切片机,并与苏木精和伊红染色()),马森三色的,地衣红和甲基红色蓝色(OMSB [27),或者Picro天狼星红。光显微镜检查和摄影的文档进行了使用一个奥林巴斯显微镜BX53F配备了数码相机。
2.4。评估肺超微结构的变化
麻醉大鼠的胸部开了,肺组织样本被削减和固定立即用2.5%戊二醛和2%的混合物刚做好的多聚甲醛在0.1 mol / L甲次砷酸盐缓冲pH值7.4。肺组织固定12 h在4°C。然后,肺部后缀在四氧化锇缓冲2%,脱水一系列梯度乙醇和环氧丙烷,812年Epon和嵌入。超薄部分是根据常规染色协议与醋酸双氧铀及柠檬酸铅和被透射电子显微镜检查和记录(JEOL Jem 1011年,日本)。
2.5。免疫组织化学的肺组织
切除后,肺组织被固定为4%福尔马林溶液(10分钟)和放置在低温贮藏10月50%(24小时),然后快速冻结在−80°C。切成10块μ米厚的横断面幻灯片。5%正常山羊血清(杰克逊免疫)或2.5%马血清(向量实验室)和2%过滤奶粉被应用于减少非特异性结合的抗体。间接免疫组织化学检测的血管性血友病因子(vWF) thrombomodulin (CD141),内皮一氧化氮合酶(以挪士)、血管细胞粘附分子1 (VCAM-1)和巨噬细胞内容(MAC3),部分与兔子孵化anti-vWF多克隆搞笑(Abcam),老鼠多克隆anti-CD141搞笑(BD生物科学),小鼠单克隆anti-eNOS搞笑(BD生物科学),鼠anti-VCAM-1单克隆搞笑(微孔),或鼠anti-MAC3单克隆搞笑(热),分别为(1 h)。抗体应用于浓度的5μ克/毫升或10μ克/毫升(稀释1:100 - 1:300股票的解决方案)。在PBS冲洗后,二级生物素化的马anti-rabbit(向量实验室),山羊anti-mouse,山羊anti-rat或山羊anti-rabbit(杰克逊免疫)抗体申请30分钟。在染色的第三步,Cy3-conjugated链霉亲和素(杰克逊免疫)和赫斯特33258解决方案。
2.6。评估孤立肺内皮功能的准备
在麻醉小鼠气管插管,肺通风用积极压力的速度90次/分钟(VCM模块从雨果(goldman Sachs)电子(HSE))。剖腹手术后,膜片被切断和nadroparine剂量的600国际单位是注入右心室,以防止microthrombi形成在外科手术。然后,动物被切口左肾动脉抽血。肺部受到通过正中。肺动脉及左心房插管通过左、右心房,分别。
管子后,肺/心块切割的胸腔。使用气管插管,孤立肺是安装在一个水套(38°C),密封的玻璃室(HSE)和通风与消极的压力。肺灌注了低糖DMEM 4%白蛋白和消息灵通的0.3%;灌流液的pH值维持在7.35在整个实验连续添加5%股份有限公司2吸入的空气,使用蠕动泵(ISM 834, HSE)恒流(CF)约为1.50毫升/分钟。2和5之间的静脉压力设置而言不啻2o .呼气压力室是将−3而言不啻2啊,和吸气压力−6和10−而言不啻之间调整2O产生最初的潮汐卷(电视)约为0.2毫升。呼吸频率是90次/分钟,吸气和呼气的时间是1:1在每一次呼吸。在整个实验中,每5分钟的深呼吸end-inspiratory−21而言不啻的压力2O是自动发起VCM模块(HSE)避免肺不张。气流速度与气流速度计测量管连接到一个压差传感器(HSE)的呼吸潮气量确定的价值。与恒压灌注实验(CP)、CP模式被打开后放置在人工胸肺。人民行动党而言不啻是在32o·2和5之间的静脉压力设置而言不啻2O。
动脉和静脉的肺动脉压力(PAP, PVP)被ISOTEC不断监控压力传感器(HSE)连接到一个灌注对动脉和静脉,分别。肺的重量是由重量传感器监测(HSE)。TC,行动党、PVP和肺重量数据被电脑传感器获得卡,随后分析了Pulmodynpulmo软件(HSE)。
所有肺部准备被允许平衡灌注新鲜缓冲区的第一个15分钟直到基线行动党,PVP,电视,和体重稳定。在这个时间点,肺的重量(实验)之间差异的价值被设置为0。
2.6.1。缺氧性肺血管收缩(HPV)
人乳头状瘤病毒诱发了10分钟间隔的低氧通风95% N的混合物2和5%的公司2。人乳头状瘤病毒,测量子宫颈的变化,稳定5分钟后。戒烟后的急性缺氧,行动党回到基础水平。有一个10分钟的间隔之间的正常通风人乳头状瘤病毒程序。人乳头状瘤病毒重复了两次,然后L-NAME (300μ米)添加到通过肺灌流液和循环10分钟,再和人乳头状瘤病毒反应是重复两次。虽然电视,人民行动党,PVP,体重不断监控在整个实验过程中,仅供数据分析,最大限度的增加PAP(ΔPAP)人乳头状瘤病毒引起的。电视,PVP,在人乳头状瘤病毒和体重没有显著变化。
2.6.2。Vasoreactivity
平衡后,U46619 (1μM)被添加到灌流液,导致增加人民行动党,但其他参数的孤立肺并没有改变。进行数据分析,只有最大限度的增加的PAP(ΔPAP)。
2.6.3。肺微循环渗透率
在平衡隔离肺,与恒压灌注肺静脉压力增加获得1.5而言不啻PVP2O以上PAP通过15分钟,并保持在这一水平。这导致增加肺的重量;其他参数是稳定的。15分钟后,PVP是设置为基值,这个过程重复。过滤系数(Kf、c)计算基于录音5分钟后PVP增加(28]。
2.6.4。生化测量
6-keto-PGF1α和/浓度测定样品的废水收集后15分钟的平衡与恒流隔离灌注肺,然后5 45分钟后再循环灌流液的开始。评估6-keto-PGF的酶的来源1α之前和之后,样本选择性cox - 2抑制剂(dup - 697, 1μ米)或非选择性COX-1 / cox - 2抑制剂(消炎痛,1μ米)。
2.7。评估孤立的主动脉内皮功能的戒指
胸主动脉很快被解剖的麻醉小鼠的胸部,和周围的脂肪/结缔组织被Krebs-Henseleit (KH)解决方案(118.0 mM:氯化钠,CaCl22.52,MgSO41.16,NaHCO324.88 K2阿宝410.0 4.7 1.18,氯化钾,葡萄糖,丙酮酸2.0,EDTA 0.5)。然后,主动脉环切成2 - 3毫米,被安装在两个别针满5毫升KH解决方案的钱伯斯(37°C, pH值7.4,加油carbogen: 95% O2,5%的公司2)线肌动描记器(620,丹麦Myo技术、丹麦)。未拉伸主动脉环被允许平衡30分钟。然后,环的静息张力增加逐步达到10 mN和戒指是用新鲜KH的解决方案和孵化为未来30分钟平衡。
平衡后,组织的生存能力收缩反应了氯化钾(氯化钾30毫米,60毫米),然后是主动脉瓣环和苯肾上腺素收缩(0.01 - -3.0板式换热器μ米)获得最大可能的环的收缩。所有组织响应记录,使用数据采集系统和记录软件(PowerLab, LabChart ADInstruments,澳大利亚)。主动脉环和苯肾上腺素获得下一个合同80 - 90%的最大收缩,和endothelial-dependent反应是评估使用累积浓度的乙酰胆碱(ACh 0.01 -10μ米)。冲刷后,与去甲肾上腺素血管又简约,endothelial-independent血管舒张的累积浓度硝普酸钠(SNP 0.001 - 1μ米)评估。放松的反应表示为一个百分比的precontraction苯肾上腺素引起的。
2.8。评估内皮(PGI2在孤立的主动脉环)生产
PGI的浓度2由主动脉环,量化的基础上6-keto-PGF的形成1α,一个稳定的PGI代谢物2。15分钟的主动脉环preincubated thermoblock (Liebisch Labortechnik)的温度37°C, 250年μl KH缓冲区,加油carbogen没有或选择性cox - 2抑制剂的存在(dup - 697, 1μ米)或非选择性COX-1 / cox - 2抑制剂(消炎痛,5μ米)。所有的抑制剂在DMSO溶液溶解,然后控制环孵化与增加相同数量的DMSO (1μl /毫升)。
主动脉环被孵化为60分钟,样品废水收集后3和60分钟。实验后,主动脉环(1 h, 50°C)和干重。6-keto-PGF1α废水浓度的测量使用一个环评工具包(恩佐,生活技术)。结果表示为6-keto-PGF的变化1α浓度之间60和3分钟的孵化和规范化的干重主动脉环(pg / ml /毫克)。
2.9。孤立的亚硝酸盐生产评估主动脉环
基底主动脉被测量估计没有生产的亚硝酸盐,一氧化氮氧化的主要稳定的产品,因此被认为是相关的估计没有合成的主动脉内皮。部分来自主动脉弓纵向打开,放在96 -孔板面临的内皮,并在120年孵化一小时μl KH缓冲在37°C,使用专门设计的封闭室(BIO-V (Noxygen))与carbogen产物气体混合物(95%啊2,5%的公司2)。亚硝酸盐浓度降低后回没有测量使用之间的气相化学发光反应没有使用西弗斯和臭氧一氧化氮分析仪诺亚280我。减少亚硝酸盐进行了在一个封闭的玻璃室包含还原剂(wt /卷KI 1%乙酸)转化为亚硝酸盐。独立的校准在新鲜的NaNO2标准的解决方案是为每个实验前准备测量一系列样品后再充填玻璃反应室,根据制造商的说明(西弗斯∗一氧化氮分析仪诺亚280我)。亚硝酸盐的检测极限是大约10纳米。多个空白样品(没有主动脉环)被用来监控亚硝酸盐污染的缓冲和/或实验室气氛在每组实验中。平均空白信号从一个空白样品在给定实验是减去背景信号。样本后直接保存在冰和测量实验。亚硝酸盐浓度表示为ng / ml /毫克的主动脉环的干重。
2.10。免疫组织化学的主动脉
解剖胸主动脉,清除周围的脂肪和结缔组织Krebs-Henseleit (KH)解决方案,与4%福尔马林溶液固定(10分钟),嵌入在低温贮藏10月50%(24小时),快速冻结在−80°C,削减10μ米厚的横断面幻灯片免疫组织化学。2.5%马血清(向量实验室)和2%奶粉被应用于减少非特异性结合的抗体。血管性血友病因子(vWF)染色,兔子anti-mouse vWF多克隆搞笑(Abcam),其次是生物素化的马anti-rabbit搞笑(向量实验室)和Cy3-streptavidin(杰克逊免疫),如上所述。核与赫斯特33258年复染色(Sigma-Aldrich)。图片是使用一个Axio观察者D2荧光显微镜,哥伦布和荧光参数自动分析软件(PerkinElmer)。
2.11。点污点分析主动脉和肺
蛋白表达和修改评估标准点污点分析使用建立协议(29日]。3-Nitrotyrosine -(3元)积极的蛋白质被点污点分析评估的蛋白质在主动脉和肺匀浆,被转移到一个Protran BA85 (0.45μ米)硝化纤维素膜(Schleicher & Schuell Dassel,德国)由点状Minifold我真空系统(Schleicher & Schuell, Dassel,德国)30.]。鼠单克隆抗体3元(1:1000年,北部的生物技术,妈,美国)是用于点污点分析。检测和量化的印迹与过氧化物酶由ECL anti-mouse(向量实验室。1:10000年,伯林盖姆,CA)。光密度的antibody-specific乐队进行量化ChemiLux成像仪(csx - 1400 M,落脚,哥廷根,德国)和Gel-Pro分析仪软件(媒体控制论,马里兰州贝塞斯达)。
3所示。统计分析
结果提出了均值±SEM。分析了结果的正常使用达&皮尔森综合测试和Shapiro-Wilk测试正常。计算统计学意义,成对的学生的t以及,Mann-Whitney测试或未配对的学生t以及使用。事后分析计算使用邓恩的多个对比测试。
4所示。结果
4.1。db / db老鼠的基底特征
20-week-old db / db老鼠肥胖(体重:53.77±0.18与29.5±0.12 g, db / db和控制,分别地; ),增加了糖化血红蛋白(15.38±1.7与4.12±1.36%,db / db和控制,分别地; 在等离子体)和空腹血糖浓度(40.64±5.41与8.66±1.24更易/ l, db / db和控制,分别地; )作为控制老鼠相比。除了hyperglycaemic概要,db / db小鼠肝损伤的迹象显示(增加等离子体AST、ALT,例如,ALT: 141.90±19.68与38.02±2.80 db / db和控制,分别地; )和肾损伤(增加血浆肌酐62.90±63.61与46.74±7.02μ摩尔/(左厘米2),db / db和控制,分别地; )。
4.2。肺组织学和超微结构在db / db老鼠
从db / db小鼠肺显示炎症,就是明证多细胞(包括粒细胞、巨噬细胞)在孔隙空间的渗透(他染色,图1 (b))与对照组相比(图1(一));轻度纤维化(增加胶原蛋白的量),三色的染色(图就证明了这一点1 (d))与对照组相比(图1 (c));和内皮炎症,就是明证VCAM-1表达增加肺内皮(480937±70112与247193±64821 AU, db / db和控制,分别地; )。有趣的是,超微结构的调查证实了存在大量的巨噬细胞(通常是彼此躺下)从db / db小鼠肺部,控制老鼠相比,他们也发现坚持内皮(数据没有显示)。此外,semithin部分肺组织肺泡面积减少(34.13±4.25与50.75±3.83 db / db和控制,职责)。毛细血管内皮细胞顶端显示凸现区域进入毛细管腔,增加肌浆网,plasmalemmal囊泡(小凹),有时多泡体或溶酶体的存在。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
的典型特征之一db / db肺微循环的增生基板在db / db(数字1 (f)和1 (h)),在控制样本(数据并不明显1 (e)和1 (g))。毛细血管基膜的厚度范围从0.1μ米至0.35μ0.05 m,相比μ在控制。此外,隔膜分离肺肺泡在db / db厚,也包含丰富的胶原原纤维和可能弹性蛋白纤维的薄片uncontrasted区域经常沾醋酸双氧铀及柠檬酸铅(数字1 (f)和1 (h)),也未见的控制样本(数据1 (e)和1 (g))。
4.3。在肺血管功能和炎症改变孤立的,肺灌注db / db老鼠
4.3.1。肺参数和Vasoreactivity基底的变化
孤立的基底肺动脉压力,灌注肺(bPAP)可比在db / db和控制老鼠(PAP: 4.70±0.62与5.20±0.30而言不啻2O, db / db和控制,分别地。,图2(一个))。Vasoreactivity血栓素一个2模拟U46619增加三倍的孤立从db / db小鼠肺(Δ人民行动党:4.83±0.32与1.43±0.69而言不啻2O, db / db和控制,分别地; )(图2 (b))。遵循但不抵抗减少db / db老鼠(合规:0.016±0.002与0.030±0.003 ml /而言不啻2O, db / db和控制,分别地; ;电阻:1.09±0.04与0.99±0.04而言不啻2O /毫升/秒,db / db和控制,分别地;数据2 (c)和2 (d))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
4.3.2。渗透系数(K的变化f、c)
孤立,灌注肺,肺静脉压力的增加导致缓慢的、可逆的体重增加肺,在控制和db / db老鼠。计算Kf、c显示更高的过滤系数在控制糖尿病肺与肺(8.70±1.33与5.02±0.27 ml / min /而言不啻2O / 100克体重,db / db和控制,分别地; ,图2 (e))。
4.3.3。缺氧性肺血管收缩的一氧化氮调控缺陷(HPV)
孤立的,从控制小鼠肺灌注,缺氧的通风导致增加肺动脉压(PAP)在其他参数没有显著变化的孤立肺(图做准备3(一个))。在控制肺部,非选择性一氧化氮合成酶的抑制剂,L-NAME,增强HPV响应(ΔPAP: 0.87±0.32与2.73±0.44而言不啻2啊,之前和之后L-NAME、职责; )。然而,在孤立的,从db / db小鼠肺灌注,L-NAME对HPV的影响大幅下跌(ΔPAP: 0.60±0.04与1.17±0.12而言不啻2啊,之前和之后L-NAME、职责; )表明一氧化氮功能受损。L-NAME没有修改基底PAP(ΔL-NAME后基底行动党:0.17±0.03与0.19±0.06而言不啻2啊,在控制和db / db老鼠,职责)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
4.3.4。亚硝酸盐/硝酸盐(/)和环前列腺素(PGI2)生产
废水从孤立、灌注肺、基底 浓度比较两组(例如,0.40±0.04与0.56±0.19μM db / db和控制,分别地。,数据3 (b)和3 (c))。的累积浓度从糖尿病肺(有关详细信息,请参阅方法)显著降低(Δ :-0.04±0.04与0.11±0.05μM db / db和控制,职责。),但没有变化浓度(图3 (d)和3 (e))。PGI的累积浓度稳定2代谢物,6-keto-PGF1α在废水从孤立的糖尿病肺高于控制(Δ6-keto-PGF1α:223.5±57.91和95.06±24.00 pg / ml, db / db和控制,职责)cox - 2抑制剂后,钝化,dup - 697(图3 (f))。
4.3.5。血管炎症的标志
糖尿病肺,免疫组织化学染色强度血管粘连molecule-1 (VCAM-1)增加了一个趋势相比,控制样品(图4(一))。血管性血友病因子(vWF)和thrombomodulin (CD141)(但不是以挪士)更高的比在控制糖尿病肺肺(数字4 (b)- - - - - -4 (d))。所有在一起这些结果支持增加炎症在糖尿病大鼠的肺系统。
(一)
(b)
(c)
(d)
4.4。内皮功能损伤和炎症标记物在db / db小鼠的主动脉
Vasoreactivity苯肾上腺素(30μ米)从db / db小鼠主动脉环增加(没有显示)。乙酰胆碱(ACh)诱导endothelium-dependent血管舒张降低浓度在db / db老鼠,而硝普酸钠——(SNP)诱导反应是保存相比对照组(数字5(一个)和5 (b))。损伤的功能反应是由ionophore-stimulated下降生产从db / db小鼠主动脉环(33.88±10.01与173.30±77.79 nM, db / db和控制,分别地; )。基底浓度的缓冲孵化主动脉环类似的两组(27.17±13.43与32.75±11.68 nM, db / db和控制,职责),而NOS抑制剂的影响,L-NIO,引人注目的主动脉控制老鼠和糖尿病组(图中所没有的5 (c))。COX-2-dependent PGI生产2(测量6-keto-PGF1α浓度废水)减少主动脉环的db / db老鼠相比控制(148.80±27.20与329.30±68.18 pg / ml, db / db和控制,分别地; ),和COX抑制剂PGI有所下降2生产控制而不是糖尿病小鼠的主动脉(图5 (d))。此外,在主动脉内皮显示增加VCAM-1表达式与内皮功能障碍(图兼容6(一)以挪士),尽管没有改变免疫染色强度(图6 (c))。反过来,与肺内皮thrombomodulin (CD141)免疫染色强度降低(图6 (b))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(一)
(b)
(c)
4.5。非酶的硝化在肺部和主动脉
Dot-blot-assessed一般蛋白质硝化在主动脉但不增加肺部的db / db老鼠,相比与控制;在肺,只有增加硝化的趋势观察(图7(一)和7 (b))。免疫组织化学染色显示仅略有增加硝化蛋白质在肺部的信号。轻微增加PGIS疣状糖尿病肺还发现(图7 (c))。
(一)
(b)
(c)
5。讨论
在目前的工作,我们在肺内皮细胞,内皮功能障碍的表型特征与外围内皮的糖尿病小鼠(db / db老鼠)。我们表明,糖尿病诱导标志着肺动脉内皮细胞超微结构的变化,与肺微循环和渗透率的增加一氧化氮功能受损,以及PGI增加补偿2生产增加thrombomodulin表达式。相比之下,在主动脉内皮功能障碍,没有和PGI受损2端依赖功能和减少thrombomodulin (CD141)表达式。这些结果表明微分反应肺血管的糖尿病侮辱PGI而言2端依赖函数,它可能会被关联到一个较小的非酶的蛋白质硝化肺,与周边PGI内皮和保存2合酶的活动。
内皮功能障碍引起的糖尿病末梢循环在db / db老鼠已经被很好地记录下来了31日- - - - - -33),包括(1)活性氧产量的增加,内皮不清除,增加非酶的蛋白质硝化(31日,32];(2)减少PGI的生产2和CD141表达和endothelial-dependent受损功能响应(31日,34- - - - - -36]。我们的研究结果与以前的研究一致认为表型主动脉内皮功能障碍。重要的是,我们评估了外围内皮细胞表型的比较与分析表型肺循环的内皮功能障碍,大大减少研究,包括只有少数报告在db / db老鼠13,17,18和在糖尿病大鼠模型的研究16,37]。
在目前的工作中,我们表明,糖尿病肺从db / db老鼠显示轻度炎症细胞浸润和超微结构的变化,深刻的基底膜的增厚,与先前的报道在人类糖尿病肺(11,38,39]。事实上,基底膜增厚和渗透率的损害肺泡基底膜共存的人类肺二型糖尿病,这些变化是紧随其后的是减少呼吸功能(6,40]。据肺动脉内皮细胞超微结构的变化在这里也激活的内皮细胞、然而,少明显是high-convoluted顶端原生质膜和无数plasmalemmal囊泡在转基因小鼠模型的糖尿病I型(41),这表明温和肺动脉内皮细胞激活的db / db老鼠。然而,我们发现了一个显著增加内皮渗透性的糖尿病肺循环,增加K就证明了这一点f、c测量(28],似乎也符合人类肺部的渗透率增加糖尿病患者(42]。
这项工作的重要的发现是一氧化氮的障碍函数的演示从db / db小鼠肺部。我们利用主导作用的内源性没有削弱人乳头状瘤病毒(43]研究整个隔离肺功能一氧化氮反应,而不是选择孤立的肺动脉,可能反映了一氧化氮功能只有在选定的肺循环的一部分。原来的方法来检测一氧化氮功能受损是基于减少调节NOS的影响抑制在孤立的人乳头状瘤病毒反应,灌注肺(43,44)也支持的累积浓度降低废水从糖尿病肺。另一方面,以挪士表达式在肺部的控制和db / db老鼠没有不同,表明变更没有负责功能受损的一氧化氮的生物利用度的反应从db / db老鼠肺循环。
Endothelium-derived PGI2通常是在一个耦合的方式没有45,46]。没有缺陷有时与PGI减少2生产,但在许多血管病理,PGI2生产可能会增加一氧化氮缺乏反应(44,47]。在这里,PGI2在主动脉生产减少,但孤立从db / db小鼠肺,PGI2生产增加。PGI的主要酶的来源2在主动脉和肺癌cox - 2,通过抑制cox - 2的明显效果,这是符合cox - 2的概念作为系统性PGI的主要来源2(48肺内皮功能障碍[]和重要贡献者49,50]。PGI2放大CD141表达式(21- - - - - -23]。如下所示,CD141 immunointensity肺的增加,虽然在主动脉减少,支持PGI之间的联系2生产和CD141。PGI2通过CD141激活蛋白C,从而增强血管壁的抗凝机制。相反地,活化蛋白C促进PGI2生产在内皮细胞(51]。
因此,肺PGI2提供有效的抗血小板和vasoprotective活动,激活也CD141-dependent抗凝机制可能构成一个重要的代偿机制在糖尿病糖尿病抵消炎症和血栓形成的过程也涉及到有害COX-2-derived代谢物导致内皮功能障碍在糖尿病49,50,52]。
有趣的是,1-MNA发挥抗血栓形成的(53和抗炎54]属性由cox - 2的激活和PGI2通路。极有可能,1-MNA先前报道的治疗效果53- - - - - -62年是与1-MNA刺激的能力与肺PGI补偿机制2(44]。显然,这一假设需要进一步的研究验证。
众所周知,糖尿病是与当地ROS增加有关生产在肺内的动脉,以及在体循环(16,63年,64年]。超氧化物阴离子和没有形成过氧硝酸盐可能导致非酶的硝化反应的蛋白质(63年,65年)包括PGIS;的nitration-mediated失活的内皮功能障碍的发展中起着重要的作用[66年- - - - - -69年]。在体循环在糖尿病患者中,蛋白质硝化影响许多酶,包括PGIS [64年,70年]。这里,我们呈现显著增加通用的蛋白质硝化主动脉和温和的影响(增高无统计学意义)被发现在肺部。非酶的硝化可能更少的意义在糖尿病肺而体循环。因此,尽管在本地增加活性氧生成在肺血管16,37,71年),在整个肺部,ROS可能不会在肺循环中发挥如此重要的作用的db / db老鼠相比系统性内皮。
6。结论
总之,我们的结果表明,糖尿病引起深刻的变化在db / db小鼠的肺内皮细胞超微结构的变化,增加内皮通透性,并增加vasoreactivity以及肺部炎症和纤维化。摘要肺血管功能受损与调节PGI有关2可能构成一个重要的代偿机制和CD141肺循环糖尿病不运行在主动脉内皮,内皮功能障碍是没有受损、PGI2,CD141。
缩写
| 6-keto-PGF1α: | 稳定的环前列腺素代谢物 |
| 和: | 血管紧张素 |
| AST / ALT: | 天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶 |
| CD141: | Thrombomodulin |
| CF: | 恒流 |
| CP: | 恒压 |
| 考克斯: | 环氧合酶 |
| dup - 697: | 选择性cox - 2抑制剂 |
| 以挪士: | 内皮细胞一氧化氮合酶 |
| ): | 苏木精和伊红 |
| 人乳头状瘤病毒: | 缺氧性肺血管收缩 |
| 伊诺: | 诱导一氧化氮合酶 |
| 1-MNA: | 1-Methylnicotinamide |
| 没有: | 一氧化氮 |
| / : | 亚硝酸盐/硝酸盐 |
| OMSB: | 地衣红和甲基红色蓝色染色 |
| 人民行动党: | 肺动脉压力 |
| ΔPAP: | 肺动脉压力的变化 |
| PGI2: | 环前列腺素 |
| PVP: | 肺部静脉压力 |
| RVW / BW: | 体重比右心室 |
| SNP: | 硝普酸钠 |
| 电视: | 潮汐卷 |
| U46619: | 血栓素一个2模拟 |
| vWF: | 血管性血友病因子。 |
数据可用性
在生成的数据集和/或分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突的存在。
作者的贡献
Andrzej Fedorowicz和Stefan Chlopicki构思和设计研究;Andrzej Fedorowicz, Elżbieta Buczek,芭芭拉•服务Łukasz Mateuszuk,阿格涅斯卡Jasztal, Antonina Chmura-Skirlińska, Mobin Dib,塞巴斯蒂安·史蒂文进行实验;Elzbieta Czarnowska、阿格涅斯卡Jasztal Andreas Daiber贡献的分析工具;Elzbieta Czarnowska Andrzej Fedorowicz,阿格涅斯卡Jasztal, Antonina Chmura-Skirlińska, Mobin Dib, Andreas Daiber和塞巴斯蒂安·史蒂文进行数据分析;Andrzej Fedorowicz和Stefan Chlopicki起草了这份手稿;Elzbieta Czarnowska Elżbieta Buczek,Łukasz Mateuszuk, Mobin Dib,塞巴斯蒂安·史蒂文,安德烈亚斯Daiber修订后的手稿;Andrzej Fedorowicz和Stefan Chlopicki写手稿的最终版本。所有作者阅读和批准最终的手稿。
确认
资源的资助支持的工作是创新经济下的欧洲区域发展基金项目(由JCET-UJ给予协调,没有。POIG.01.01.02-00-069/09)和部分由国家科学中心授予Symfonia没有。DEC-2015/16 / W / NZ4/00070。