文摘

天麻(气)是主要的组件从中国传统草药的粉末分离”天马。“许多临床研究发现,气体保护心肌细胞在心血管疾病,虽然效果和潜在机制对心血管缺氧/复氧(A / R)损伤仍然未知。本研究旨在探讨天麻的影响在A / R损伤心肌细胞。我们的研究结果表明,气体对心肌细胞的保护作用与调节14-3-3η的水平。预处理气体可以增加细胞的生存能力和减少的活动肌酸磷酸激酶(CPK)、乳酸脱氢酶(LDH)。天然气也可以减少活性氧(ROS)生产、抑制线粒体渗透性转换孔注射(mPTP药物),线粒体膜电位改变的维护(∆Ψ米),减少caspase-3的激活,最终抑制细胞凋亡。表达下调14-3-3η通过转染siRNA14-3-3水平η很明显减毒气体在心肌细胞的保护作用/ R损伤。

1。介绍

心肌缺血/再灌注(I / R)是一个重要的并发症再灌注治疗心肌梗死(MI)。缺血/再灌注(I / R)损伤是全球死亡和残疾的主要原因1]。天麻(4-hydroxybenzylalcohol4-O-beta-D-glucopyranoside)是一种水溶性的根中提取的天然化合物天麻布卢姆(兰科),一个古老的中药临床应用有着很长的历史。气体有深远的生物活性的活性化合物,包括镇静、抗惊厥、抗癫痫、催眠、抗抑郁、抗焦虑、抗精神病,神经保护,antivertigo,抗炎,循环system-modulating、memory-improving,镇痛,抗氧化和抗衰老的,抗病毒和抗肿瘤效果2]。然而,详细的心血管效应气体分子机制/ R-induced受伤之前没有被报道。

14-3-3蛋白是一种酸化和高度保守的蛋白质家族所有的真核生物中,特别是在哺乳动物大脑。这种蛋白质是由七个亚型,标有七个单独的基因,每个取而代之的是一个希腊字母(β,γ,ε,ζ,η,τ,σ)[3]。14-3-3蛋白是高度保守的分子伴侣’与重要的细胞功能的规定,包括压力反应、代谢、信号转导、贩卖蛋白质,细胞循环控制、转录、细胞凋亡、神经传递(4]。先前的研究已经表明,14-3-3η蛋白质作为一种内源性cardioprotector和限制糖尿病心肌病的发展通过限制心肌细胞凋亡,肥大、纤维化和内皮功能障碍通过抑制Ask1激活后诱导实验性糖尿病(5- - - - - -8]。因此,本研究的目的是调查如果气体对心肌细胞的保护作用与A / R-induced损伤可能与14-3-3η。

2。材料和方法

2.1。试剂

气体(纯度:> 97.6%)购买的国家控制药品和生物制品研究所(中国,北京)。的anti-14-3-3η从Abcam抗体,抗-β肌动蛋白抗体从南京建成生物工程研究所(南京、江苏、中国),和siRNA14-3-3η腺病毒是来自上海GeneChem有限公司LDH和肌酸磷酸激酶包购自南京建成生物工程研究所(南京、江苏、中国)。

2.2。细胞培养

H9c2细胞系,从美国获得组织培养(马纳萨斯,弗吉尼亚州)集合,是一个附着老鼠心肌细胞与成肌细胞形态(9]。这些细胞被培养在杜尔贝科修改鹰的单层介质(DMEM)与10%胎牛血清(卷/期)。介质是由葡萄糖(4.5 g / L), NaHCO3 17毫米,100 U /毫升的青霉素,100μ链霉素的g / mL。细胞在37°C的环境湿度在95%和5%的公司2。

2.3。实验组和治疗

H9c2细胞被随机分成不同的实验小组如下:(1)对照组:H9c2细胞在前面描述的条件下孵化。(2)A / R组:H9c2细胞培养在一个新鲜缺氧(1.8毫米CaCl媒介2氯化钾,消息灵通的20毫米,10.0毫米,1.2毫米MgSO4氯化钠,98.5毫米,6.0毫米NaHCO30.9毫米,不2阿宝440毫米乳酸钠,pH值6.8,37°C),缺氧诱导通过将细胞在低氧室,含氧量可以监控(Biospherix ProOx C21, Lacona,纽约,美国)对3 h。3 h后缺氧,细胞再氧化介质(1.8毫米CaCl所取代220毫米,5.5毫米葡萄糖,玫瑰,MgSO氯化钾5.0毫米、1.2毫米4129.5毫米氯化钠,NaHCO 20毫米30.9毫米,不2阿宝4pH值7.4,37°C)和孵化的氛围中95% O2和5%的公司22 h。(3)气体浓度效应+ A / R组:H9c2细胞使用气体(5、10、20、40、80、160和320 mg / L) 24 h / R的感应。(4)气体+ A / R组:H9c2细胞使用20 mg / L气24 h / R的感应。(5)数控+气体+ A / R组:H9c2细胞转染与数控36 h和使用20 mg / L气24 h / R的感应。(6)siRNA14-3-3η+气体+ A / R组:与siRNA14-3-3 H9c2细胞转染η36 h和使用20 mg / L气24 h / R的感应。

2.4。MTS试验

细胞生存能力评估的3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 5 - (3-carboxymethoxyphenyl) 2 - (4-sulfophenyl) 2 h-tetrazolium (MTS)试验(细胞效价96水一个解决方案,Promega,米兰,意大利)。H9c2细胞培养在96 -孔板的密度1×104细胞每口井。MTS试剂(20μL)添加到每个细胞随后孵化2 h公司37°C和5%2调湿孵化器遵循制造商的指示。2 h后,吸光度测量的波长490 nm使用标(Bio-Rad美国)。结果表示为%的变化对控制视为等于1。

2.5。LDH和肌酸磷酸激酶活性测定

LDH和肌酸磷酸激酶可以释放细胞由于细胞坏死;因此,LDH的活性和肌酸磷酸激酶是用来评估细胞死亡的存在10]。上层清液是用来测量LDH在440 nm和660 nm的肌酸磷酸激酶根据制造商的指示(11,12),吸光度检测使用一个自动标仪(美国PerkinElmer)。

2.6。Annexin-V /π化验

已经发表,应该评估凋亡流式细胞分析仪的膜联蛋白V-FITC凋亡检测设备(凯基生物生物技术、江苏、中国)13]。A / R治疗后,H9c2细胞收集和清洗两次磷酸盐(PBS)然后resuspended绑定缓冲(500μL)。膜联蛋白V-fluorescein异硫氰酸酯(V-FITC 5μL)和碘化propidium(π,5μ(左)被添加到细胞的浓度为1×106细胞/毫升)在孵化前15分钟在室温下在黑暗中。然后,在1小时内检测凋亡细胞用流式细胞分析仪(美国BD生物科学,圣何塞,CA)。

2.7。TUNEL分析,苏木精伊红染色(他)

TUNEL染色法用于检测细胞凋亡。H9c2心肌细胞培养在24-well盘子。治疗后,心肌细胞凋亡是由TUNEL工具包(WI Promega,麦迪逊,美国),根据制造商的指示。光学显微镜下细胞与苏木精复染色检查。凋亡细胞被积极的TUNEL染色。凋亡细胞染色棕色。图像可视化在奥林巴斯显微镜使用10倍的目标。

2.8。测量细胞内活性氧(ROS)

活性氧的形成(Applygen,北京)被流式细胞术检测使用DCFDA (2 ,7 二乙酸-dichlorofluorescin)如前所述14]。治疗后,细胞收集和PBS洗两次,然后用DCFHDA孵化(10μm / L) 37°C在黑暗中20分钟,最后用流式细胞分析仪测量。

2.9。免疫印迹分析

分别提取总蛋白。蛋白质含量是决定使用BCA蛋白质化验设备(Beyotime生物技术,中国上海)15]。总蛋白溶菌产物分离10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)和转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜和屏蔽5%脱脂牛奶TBST缓冲2 h。膜被孵化的主要抗体(1:500)β肌动蛋白和14-3-3η在4°C一夜之间,与TBST洗了三次,孵化与辣根peroxidase-conjugated二级抗体(1:2000)在室温下2 h。这些墨迹可视化使用化学发光,最终数据显示蛋白质强度之间的比率在细胞和对照组治疗。

2.10。测定∆Ψ米

方法测量JC-1(凯基生物生物技术、江苏、中国)被用来评估线粒体膜电位。治疗后,这些细胞被收集,与PBS洗两次,然后收获与200年孵化μmol / L JC-1 30分钟在黑暗中在37°C。之前测试通过流式细胞术FL1和FL2频道,500年样本resuspendedμL孵化的缓冲区。结果表示为一个相对红/绿荧光比率。

2.11。Caspase-3活动分析

的活动caspase-3测量后的生产商提供的协议caspase-3活动分析工具包(凯基生物生物技术、江苏、中国)。布拉德福德的蛋白浓度测定方法,与每组150人μg蛋白质吸收的细胞溶解产物。后添加50的混合物μL 2 x反应缓冲区,5μL caspase-3衬底被添加到96 - 37°C的微量滴定板和孵化4小时。然后我们发现405海里的吸光度。

2.12。注射的mPTP药物

我们之前发表如何隔离渗透率交通孔注射(mPTP药物)和检测线粒体(16]。心肌细胞的线粒体分离线粒体/胞质分离设备(试剂盒、希尔登,德国)然后resuspended肿胀缓冲区(120毫米氯化钾,KH 5毫米2阿宝4,20毫米拖把,10毫米Tris-HCl (pH值7.4))并将其添加到200μmol / L氯化钙。吸光度测量的波长520 nm,线粒体光密度的变化率由注射的mPTP药物表示。

2.13。统计分析

所有数据都表示为均值±SEM和由方差分析评估(方差分析)。 被认为是表明一个统计上的显著差异。

3所示。结果

3.1。气体增加心肌细胞的生存能力受到A / R

我们检查了使用MTS试验H9c2细胞的可行性。如图1(一)、缺氧复氧损伤细胞存活率显著下降。前的预处理与不同浓度的气体/ R和20 mg / L气体+ A / R组表现出最高的细胞生存能力。因此,20 mg / L的最佳浓度的气体被选为后续实验。在图1 (b),我们的数据表明,siRNA14-3-3η可以通过气体抑制这种效应显著。

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图1
天麻种(气)对细胞的影响的可行性H9c2细胞/ R。(3)- 4 5-dimethylthiazol-2-yl 5 - (3-carboxymethoxyphenyl) 2 - (4-sulfophenyl) 2 h-tetrazolium (MTS)分析结果表明,(a) / R组显示H9c2细胞(细胞生存能力降低 和对照组)。预处理与不同浓度的气体和20 mg / L气体+ A / R组表现出最高的细胞生存能力 和 与A / R组)。(b) A / R治疗可以减少心肌细胞的细胞生存能力( 与对照组)和气体+ A / R组和数控+气体+ A / R组增加了细胞生存能力 与A / R组),而siRNA14-3-3η废除了气体对细胞生存能力的影响 与气体+ A / R组)。数据表示为均值±SEM ( )。
3.2。气体对心肌细胞肌酸磷酸激酶的影响和LDH水平引起的A / R

/ R治疗后,细胞膜的破坏程度分析了在A / R CPK和LDH的活性在培养基中。如图2与对照组相比,LDH和肌酸磷酸激酶的活动/ R组显著增加。预处理CPK和LDH水平气体显著减少的活动相对于A / R组。此外,在与siRNA14-3-3转染η,CPK和LDH活性水平显著增加。

(一)
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(b)
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图2
影响天然气在H9c2细胞LDH和肌酸磷酸激酶活动/ R。数据表示为均值±SEM ( )。 相对于对照组; 与A / R组; 与气体+ A / R组。
3.3。气体抑制心肌细胞凋亡诱导的A / R

每组的细胞凋亡检测通过流式细胞术使用膜联蛋白V-FITC和π双染色(数字3(一个)和3 (b))和TUNEL分析(图3 (c))进一步验证了细胞凋亡的结果。凋亡细胞发生缺氧复氧损伤,增加和气体抑制细胞凋亡的增加,诱导的A / R。气体的凋亡效应与siRNA14-3-3转染后被取消了η。

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(c)
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图3
预处理的影响气体抑制细胞凋亡的心肌细胞暴露于A / R。(一)代表点块π( 设在)与膜联蛋白V ( 通过流式细胞仪设在)。(b)的定量分析凋亡细胞数量。的值表示为±SEM手段( )。 相对于对照组, 与A / R组和 与气体+ A / R组。(c)凋亡心肌细胞被TUNEL检测,和凋亡细胞染色棕色。
3.4。气体减少ROS水平H9c2细胞诱导/ R

活性氧可以攻击细胞组件和引起细胞凋亡和坏死17]。DCFH-DA荧光探针用于分析心肌细胞的细胞内ROS水平。我们的结果表明,活性氧的A / R组显著增加,气体预处理明显减少ROS水平诱导的A / R,这影响气体减少活跃的ROS H9c2细胞被siRNA14-3-3η(图4)。

(一)
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(b)
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图4
天麻(气)预处理降低H9c2细胞诱导的活性氧生成A / R,而siRNA14-3-3η废除这一效应。(一)DCF荧光流式细胞术分析。(b)列柱状图对DCF的细胞荧光。数据表示为均值±SEM ( )。 相对于对照组, 与A / R组和 与气体+ A / R组。
3.5。与天然气预处理移植14-3-3η表达心肌细胞/ R

调查如果14-3-3η参与保护作用的气体/ R-induced心脏保护和确定最优浓度的气体,蛋白质水平的14-3-3η进行了分析。在执行之前缺氧复氧损伤,H9c2细胞使用气体在不同浓度(5、10、20、40、80、160和320 mg / L) 24 h。如图5(一个),14-3-3的表达η20 mg / L气体被证明表达的最高14-3-3η。最优浓度和时间前提类似于MTS的结果。此外,14-3-3的水平η使用天然气显著增加;然而,当与siRNA14-3-3转染η,这些保护作用是废除(图5 (b))。

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图5
天麻的影响(气)在14-3-3的表达ηH9c2细胞暴露在缺氧/复氧(A / R)损伤。14-3-3η免疫印迹表达评估,β肌动蛋白是作为内部控制。(一)14-3-3的表达η蛋白质/ R组显著增加( 和对照组)。气体浓度效应+ A / R组,14-3-3的表达η在气+ A / R组高于A / R组( 和 与A / R组)和20 mg / L气+ A / R组呈现表达最高的14-3-3η( 和5,10,80,160,320 mg / L气+ A / R组)。(b) 14-3-3的表达η蛋白质/ R组显著增加( 和对照组)。和14-3-3的表达η蛋白显著增加气体+ A / R组和数控+气体+ A / R组( 与A / R组),但siRNA14-3-3下降η+气体+ A / R组( 与气体+ A / R组)。数据表示为均值±SEM ( )。
3.6。线粒体膜电位的测量(∆Ψ米)

线粒体膜电位(∆的维护Ψ米)非常重要对于线粒体的完整性和生物能量学函数(18]。JC-1是唯一导致聚合,形成一个红色荧光阳离子染料荧光峰值在较高的线粒体膜电位,而JC-1作为单体形式存在,发出绿色荧光峰值低线粒体膜电位。从红色到绿色荧光变化表明线粒体膜电位的损失。图6显示红色的逐步丧失JC-1总/ R-treated细胞的荧光和天然气预处理可显著减轻损失的红色荧光。然而,气体被逆转的影响与siRNA14-3-3转染η。

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图6
天然气预处理对心肌细胞线粒体膜电位的损失引起的A / R。(一)流式细胞术的代表点图。(b)∆Ψ米被红/绿的比例计算荧光从流式细胞仪获得。数据表示为均值±SEM ( )。 相对于对照组; 与A / R组; 与气体+ A / R组。
3.7。影响气体的活动Caspase-3由A / R

测试气体预处理的影响在A / R-induced caspase-3活动的变化,细胞质蛋白质收集评估caspase-3的活动。程序性细胞死亡可以由几个因素,然后收敛于一个共同的和半胱天冬酶结合生化通路,批判涉及caspase-3的激活,导致细胞凋亡的执行19,20.]。如图7的活动,与对照组相比,caspase-3 A / R组显著增加,增加活动的caspase-3被显著地抑制气体。然而,这种效应被废除使转染H9c2 siRNA14-3-3细胞η腺病毒。


图7
天麻(气)预处理的影响的活动caspase-3 / R损伤引起的。caspase-3的列柱状图显示了活动在不同的组。数据显示为均值±SEM ( )。 相对于对照组, 与A / R组和 与气体+ A / R组。
3.8。天然气预处理/ R注射抑制了mPTP药物诱导的心肌细胞

线粒体发挥重要作用在细胞生命通过调节生存和死亡信号通路。线粒体是细胞死亡的主要监管机构通过细胞凋亡、坏死,自噬。我们发现吸光度分析注射的程度mPTP药物打开520海里/分钟(OD·分钟−1)率(图8(一个))。结果表明,A / R显著增加注射的mPTP药物,但这种变化明显被气体预处理、和气体被siRNA14-3-3有限的影响η(图8 (b))。

(一)
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(b)
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图8
注射天麻的影响(气)预处理抑制mPTP药物打开H9c2细胞诱导/ R。(a)注射的mPTP药物反映后被吸收的波长520 nm CaCl增加200毫米2和监控超过20分钟。(b)吸光度的变化值在520 nm /分钟(∆OD·分钟−1注射)是用来表达水平的mPTP药物(∆OD = A520开放0分钟−A52020分钟)。数据表示为均值±SEM ( )。 相对于对照组, 与A / R组和 与气体+ A / R组。

4所示。讨论

天麻的主要活性成分天麻布鲁姆,据报道,已在各种疾病具有抗炎和抗凋亡作用[21,22]。氧化应激中扮演一个重要的角色在缺血和再灌注引起的脑损伤。炎症和氧化应激是紧密交织在一起的。炎症细胞反应的因素(包括那些由于氧化应激)挑战组织的体内平衡,但是这个过程还可以作为防御机制来维持平衡的功能23]。许多报道表明,天麻可以在多个通路发挥重要作用,包括ERK1/2 p38MAPK GATA-4, NF -κB,进气阀打开,cox - 2和细胞因子(24- - - - - -26]。然而,天麻在心脏/ R-induced损伤的影响及相关信号机制尚不清楚。在这项研究中,我们发现天然气预处理显著增加细胞生存能力和减少LDH和肌酸磷酸激酶H9c2细胞释放。最高的细胞生存能力是20 mg / L,这表明气体保护心肌/ R-induced受伤,和预处理的最佳浓度和时间20 mg / L和24 h,分别。此外,所有这些引起气体是通过与siRNA14-3-3转染的影响η。

在目前的研究中,我们确认气体可以显著增加14-3-3的表达η蛋白质在H9c2细胞/ R。14-3-3η是14-3-3家族的一员。14-3-3蛋白是细胞内,二聚的,phosphoserine-binding分子信号转导中发挥重要作用,细胞凋亡,通过绑定和检查点控制通路Raf1等许多信号蛋白,蛋白激酶C, Ask-1, cdc25c,坏,forkhead转录因子1 (FKHRL1)。通过酶与Ask-1绑定,MAPKKK, 14-3-3停止激活物和p38 MAPK。因此,大多数的研究14-3-3蛋白质展示他们对凋亡细胞死亡的保护作用。据报道,14-3-3η蛋白在心脏是一个潜在的目标,我们可以通过减少心肌梗死的病理结果(27]。我们的结果表明,14-3-3的表达η蛋白质是最高的20 mg / L组。调查如果天然气相关的心血管效应14-3-3η与siRNA14-3-3 / R-induced受伤,转染η进行调查的差别如果能够消除这些影响,对这些基因的14-3-3η。这些保护作用与siRNA14-3-3废除当细胞转染η,这表明气体的心血管效应有关14-3-3η蛋白质。

作为I / A / R, R实验模型,广泛应用于实验室。根据先前的研究,A / R已被证实能够引起明显的细胞凋亡在心肌细胞培养,流式细胞仪可以检测到。/ R-induced受伤引起的氧化应激,和氧化stress-mediated活性氧与心脏功能障碍是紧密联系在一起的28,29日]。生产和清除活性氧之间的不平衡会导致不可逆转的损害细胞,最终导致细胞凋亡(30.]。众所周知,气体瞬态局部脑缺血后改善脑损伤通过促进能力减少ROS损伤体内和海马神经元死亡,会引起体外(31日,32]。心脏缺血再灌注产生过多的活性氧,后心肌细胞凋亡是一种重要的机制。我们的研究表明,天然气可以显著降低ROS生成,这效果是废除与siRNA14-3-3一旦心肌细胞转染η。

线粒体的损伤是威胁到适当的细胞功能,因为它会导致缺乏能源和ROS的冗余版本(33]。线粒体Δ之间的直接关系Ψ和活性氧的生产(34,35)保证的基础概念,解偶联氧化磷酸化消退线粒体O2−生产(36,37]。先前的研究已经发现,线粒体膜电位的改变是线粒体功能障碍的一个重要指标38]。在目前的研究中,我们分离心肌细胞的细胞质和线粒体组件注射评价程度的mPTP药物打开和使用JC-1评估线粒体膜电位。我们发现/ R-induced损伤不仅影响注射的mPTP药物,也导致线粒体膜电位,破坏矩阵肿胀,外膜破裂。我们已经证实气体注射可以抑制mPTP药物,减少破坏线粒体膜电位,最终减少H9c2细胞凋亡。当与siRNA14-3-3转染η气体对H9c2细胞的保护作用消除。所有这些研究结果表明,气体的保护作用H9c2细胞受A / R是线粒体相关通路。

线粒体功能障碍导致凋亡信号级联,导致细胞凋亡和细胞目标(39]。Caspase-3,效应器细胞凋亡的关键之一是启动和mitochondria-mediatedapoptosis[扮演着重要的角色40]。在我们的研究中,气体预处理显著降低caspase-3活动/ R损伤引起的,最终减少心肌细胞凋亡,引起了这些气体的影响与siRNA14-3-3转染η。

目前的研究已经证明,气体保护作用在H9c2 / R-induced损伤细胞。气体可以减少ROS的生成,线粒体膜电位改变的保存,注射抑制mPTP药物,减少caspase-3的激活,并最终减少心肌细胞凋亡;所有的这些影响被siRNA14-3-3废除η。这些发现表明,气体保护心肌细胞通过14-3-3对/ R损伤η蛋白质。

数据可用性

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的利益冲突

作者报告没有利益冲突。

作者的贡献

魏Meifang朱镕基和邓小平的贡献同样这项工作。

确认

这项工作得到了中国自然科学基金(81460551号,81760587,81460371,81760731),南昌大学的研究生创新专项基础(没有。cx2016292)、江西(没有技术支持和社会发展项目。2010 bsa13900)。