文摘

本研究旨在探讨对心脏的过度氧化应激损伤的影响在急性心肌缺血(AMI),专注于细胞凋亡、自噬,炎性细胞浸润,检测硫化氢(H的角色2在这个过程中。我们发现SOD1基因敲除小鼠(KO)显示过度氧化应激和加剧了AMI后心肌损伤。增加缺血性心肌细胞凋亡和炎症反应导致这种恶化,而增强的自噬具有保护作用。心肌炎症AMI后更加严重SOD1 KO小鼠比野生型老鼠。预处理与H2年代供体硫氢化钠减少缺血性心肌中自噬和凋亡水平和缓解区域炎症反应SOD1 KO小鼠的心脏组织。此外,自噬和凋亡水平显著增强SOD1击倒小学新生大鼠心肌细胞(3)葡萄糖剥夺。与硫氢化钠预处理可以部分地抑制这个高度。综上所述,我们发现过度氧化应激会加重心脏AMI期间的伤害。外生H2年代在AMI可以减轻心肌损伤,减少细胞凋亡在心脏组织氧化应激和炎症反应。

1。介绍

急性心肌缺血(AMI)引起的冠状动脉阻塞是全球心血管发病率和死亡率的主要原因(1- - - - - -3]。急性心肌缺血是一种多因素疾病,主要导致线粒体能量代谢的障碍,其次是心肌损伤的起始4,5]。受损的线粒体代谢的主要特点是生产过多的活性氧(ROS),包括过氧化氢、过氧化物、过氧亚硝基,羟基自由基(6- - - - - -8),这主要是来自线粒体(9]。而低水平的活性氧对细胞信号转导至关重要,大量活性氧氧化应激诱导细胞凋亡和坏死。因此,ROS清除由抗氧化剂对细胞的生存是必要的。抗氧化防御系统等涉及酶超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽氧化物酶(GPx)和非酶的抗氧化剂如维生素和谷胱甘肽(GSH) (10]。作为主要的抗氧化酶,杆如铜/ Zn-SOD Mn-SOD, EC-SOD(细胞外SOD)中扮演至关重要的角色清除ROS (11]。纯合子(−−)铜/ Zn-SOD (SOD1) KO小鼠表现出高水平的氧化应激(12]。氧化应激诱导,抗氧化酶活性下降在AMI患者的临床研究[13- - - - - -15]。然而,目前尚不清楚ROS水平高的人容易AMI。相反,过度的SOD亚型保护心肌细胞缺血再灌注损伤小鼠(16,17]。然而,如何在SOD1-deficient小鼠氧化应激的机制在AMI影响心脏功能在活的有机体内不能完全证明。

自噬是一种细胞内溶酶体降解途径(18)负责细胞内蛋白质和细胞器的降解。自噬包括三个主要类型:macroautophagy microautophagy,即使伴娘自噬(19]。Macroautophagy是最广泛的研究自噬,本研究集中在这种类型的自噬,仅仅是指自噬。Macroautophagy特点是自噬小体的形成,隔离细胞质组件和最终与溶酶体融合,吞没了货物在哪里退化(20.]。在生理条件下,自噬对维持细胞内稳态和保持细胞健康很重要(21]。自噬特异表达导致各种疾病,如感染、神经退行性疾病,肿瘤发生[22- - - - - -25]。在文献中报道,自噬是调节各种心脏疾病,包括急性心肌缺血(26- - - - - -28]。过度自噬可能导致程序性细胞死亡(29日]。自噬特异表达和细胞死亡都参与了心肌梗死。心肌梗死激活先天免疫途径,引发一场激烈的炎症反应(30.]。促炎趋化因子和细胞因子显著调节和促进炎症细胞的招聘和公司梗塞的面积(31日]。招募了炎性细胞吞噬坏死细胞和矩阵的碎片25]。然后,炎症的修复反应是紧随其后的是分辨率,myofibroblast扩散,形成collagen-based疤痕(32- - - - - -34]。综上所述,自噬,细胞死亡,炎症反应在AMI心脏损伤和修复的重要组成部分。

硫化氢(H2)是一个新发现的气体信号分子扮演重要的角色在不同的生理和病理生理过程。内源性H2S是由催化底物l -胱硫醚γ裂合酶(CSE)、胱硫醚-β合酶(CBS), 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase (3-MST)。先前的研究已经发现,H2年代发挥了至关重要的作用在血管放松打开K三磷酸腺苷渠道(35,36),通过针对促进血管生成二硫bond-containing受体蛋白(37- - - - - -39),抑制氧化应激(40),从心肌缺血再灌注损伤和保护心肌细胞41,42]。

在目前的研究中,我们关注的是调查过度氧化应激如何影响心脏损伤在AMI和外生H的角色2在AMI与受损的小鼠模型的抗氧化防御。

2。材料和方法

2.1。急性心肌缺血小鼠模型和硫氢化钠管理在活的有机体内

按照指南进行了动物实验的实验动物保健和使用美国国立卫生研究院(NIH)的美国和伦理委员会批准的实验研究,复旦大学上海医学院。所有实验进行8-12-week-old成年老鼠。杂合的铜/锌SOD (SOD1) KO小鼠(股票编号:002972)购买杰克逊实验室。纯合子动物实验中使用,而杂合的动物被用于繁殖。

老鼠与异氟烷麻醉(2%)和通风通过气管插管与啮齿动物呼吸机(美国肯特科技公司,托灵顿校区,CT)。胸部被打开,AMI是通过阻碍左冠状动脉的前降支。最后,胸壁被关闭。sham-operated动物经历了同样的手术没有结扎冠状动脉。心收获在特定的时间点。

老鼠接受硫氢化钠预处理,50μ摩尔/公斤硫氢化钠是由腹腔内注射AMI手术前30分钟服用。盐被用作车辆控制。

2.2。测定梗死大小

2、3、去除氯(TTC),σ,圣路易斯,密苏里州,美国)染色法是用来测量梗死大小。老鼠牺牲2 h MI后手术。心脏组织切除,切成1 - 2毫米厚片。片是孵化温度记录在37°C 1% 30分钟在黑暗中并在4%多聚甲醛固定。最后,由ImageJ图像拍摄和分析软件。

2.3。新生大鼠心室心肌细胞的主要文化和硫氢化钠治疗

小学新生大鼠心肌细胞(3)隔绝已经Sprague-Dawley老鼠像前面描述的那样43]。实验伦理委员会批准的协议是实验研究,复旦大学上海医学院。短暂,解剖心与冷洗了三次磷酸盐(PBS),剁碎成1毫米3件,并与0.125%胰蛋白酶消化几次。消化后,心肌细胞是由微分依恋和纯化培养杜尔贝科的修改鹰中/ F-12 (DMEM / F12)含10%胎牛血清,100 U /毫升青霉素,100μ克/毫升链霉素。5-Bromo-2-deoxyuridine (Brdu)(0.1毫米)添加在第一次48 h,以防止noncardiomyocytes扩散。对葡萄糖剥夺实验中,心肌细胞被洗了三次与PBS和孵化glucose-free DMEM(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)不含血清。医疗保险与硫氢化钠治疗50浓度μM葡萄糖剥夺前30分钟。

2.4。ROS水平的检测

ROS水平检测dihydroethidium(她Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。为在活的有机体内化验,心脏组织切除,嵌入在最佳切削温度复合(O.C.T.化合物,樱花,托兰斯,加利福尼亚,美国),然后切成段(6μ米),孵化了她的部分(10μ在黑暗中M)为30分钟。最后,图像被荧光显微镜(徕卡,位于德国)。为在体外化验,医疗保险与她(10孵化μM)为30分钟37°C在黑暗和流式细胞仪探测到。

2.5。免疫印迹分析

心脏组织或原发性心肌细胞与裂解细胞溶解缓冲区(含50 mM Tris-HCl (pH值7.4),1毫米EDTA (pH值8.0),150毫米氯化钠,triton - 100 1%, 0.1% SDS和0.25% DOC)补充了蛋白酶抑制剂鸡尾酒(图片,罗氏、巴塞尔、瑞士)和磷酸酶抑制剂鸡尾酒(罗氏、巴塞尔、瑞士)。蛋白质浓度测定用BCA试剂盒(“深博Cai、上海、中国)。蛋白质是由钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶(sds - page)和转移到聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF)(微孔,贝德福德,妈,美国)。与5% BSA被屏蔽后,PVDF膜分离蛋白质与初级孵化抗体和辣根peroxidase-conjugated二级抗体。主要抗体用于本研究包括anti-LC3 (nb100 - 2220,罗福斯,利特尔顿有限公司,美国),anti-ribosomal S6激酶(S6K)(2708,细胞信号传导,丹弗斯、马、美国),antiphosphorylated S6K(刺- 389)(9205,细胞信号传导,丹弗斯、马、美国),antiphosphorylated AMPK(刺- 172)(2535,细胞信号传导,丹弗斯、马、美国),anti-ATG5(12994,细胞信号传导,丹弗斯、马、美国),anti-Bax(50599 - 2搞笑、Proteintech Rosemont,,美国),anti-Bcl2 (12789 - 1 - ap、Proteintech Rosemont,,美国),和anti-GAPDH (60004 - 1 - ig、Proteintech Rosemont,,美国)。化学发光信号是由添加增强化学发光(ECL)试剂(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。强度的蛋白质乐队被ImageJ量化软件。

2.6。末端转移酶- (TdT)介导的dUTP尼克结束标记测定(TUNEL分析)

劈理的基因组DNA在细胞凋亡可能产生DNA链断裂,可以识别标签免费3 -哦与修改DNA片段核苷酸的TdT。在这项研究中,原位检测细胞死亡工具包(罗氏、巴塞尔、瑞士)是用于检测细胞凋亡。简单地说,心脏石蜡包埋组织切片在6μ米厚度。脱蜡后,组织部分和蛋白酶K消化,然后用TUNEL孵化反应混合物缓冲区在37°C在黑暗中60分钟。然后,组织部分沾Fluoromount-G™与DAPI (eBioscience、圣地亚哥、钙、美国)。最后,图像被荧光显微镜(徕卡,位于德国)。

2.7。在医疗保险siRNA-Mediated SOD1击倒

小干扰rna序列设计SOD1-targeting 5 -GGTGGTCCACGAGAAACAAGA-3 。小干扰rna序列和SOD1-targeting负控制核(siNC)合成了Biotend(上海,中国)。的设计并合成小干扰rna序列Atg5-targeting Biotend(上海,中国)。培养48 h后,医疗保险被转染每6-well 40 pmol siRNA板使用Lipofectamine RNAiMAX(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)制造商的指示。短暂、核和Lipofectamine RNAiMAX Opti-MEM稀释,在室温下混合,孵化为5分钟。然后,siRNA-Lipofectamine RNAiMAX混合物加入到细胞中。媒体取代新鲜的DMEM / F12完全培养基后6 h孵化。实验进行转染后48 h。可拆卸的效率被免疫印迹检测。

2.8。膜联蛋白V-FITC / Propidium碘染色

细胞凋亡在3个测量使用膜联蛋白V-FITC凋亡检测设备(美国BioLegend,圣地亚哥,CA)根据制造商的指示。城镇职工基本医疗保险被胰蛋白酶化收获和洗两次与PBS和绑定缓冲。然后,医疗保险是沾膜联蛋白V和propidium碘(PI)在4°C,持续15分钟。最后,医疗保险是resuspended绑定缓冲,流式细胞术分析。

2.9。检测免疫细胞

两天后AMI、心脏组织和全血分离得到了老鼠。在PBS洗几次后,心脏组织被绞成碎片,消化消化缓冲区包含1毫克/毫升胶原酶IV(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)和20μg / mL DNase我(Solarbio,北京)37°C 1 h。全血样品孵化与红细胞裂解缓冲(美国eBioscience,圣地亚哥,CA)在室温下10分钟去除红细胞。洗两次后,单个细胞在mac resuspended缓冲区(包含25毫米EDTA和1%胎牛血清在PBS)。细胞标记、新鲜细胞孵化与主要使用以下抗体抗体在冰上:BV421-labeled anti-CD3(562600年,BD生物科学,圣何塞,CA), APCcy7-labeled anti-CD19 (50-245-965, eBioscience,圣地亚哥、钙、美国),PE-labeled Ly6G (CD183)(108408年BioLegend,圣地亚哥、钙、美国),APC-labeled anti-CD11b (17-0112-82, eBioscience,圣地亚哥、钙、美国),和FITC-labeled Ly6C (11-5931-81, eBioscience,圣地亚哥、钙、美国)。这些细胞被洗两次在mac缓冲区,并立即分析BD LSRFortessa™细胞分析仪。

2.10。免疫组织化学分析的心脏组织

心脏组织的石蜡包埋部分(6μ米),脱蜡和检索压力锅在柠檬酸(12分钟 )。然后,部分是孵化CD11b抗体(ab133357 Abcam,剑桥,英国)在室温下2 h和随后孵化与辣根过氧化物酶,(合)共轭二次抗体和diaminobenzidine衬底。最后,光学显微镜图像被收购(徕卡,位于德国)。

2.11。自噬流量测量

测量自噬流量在活的有机体内40毫克/公斤,老鼠服用氯喹(CQ)腹腔内注射1 h在AMI。两个小时后手术,心脏组织收获和LC3蛋白表达被免疫印迹检测。为在体外化验,与CQ细胞进行预处理(10μ米)4 h在收获之前LC3免疫印迹。

在体外自噬流量也使用mCherry-GFP-LC3调查研究。mCherry-GFP-LC3腺病毒是购自Beyotime(上海,中国)。小干扰rna转染48 h后,医疗保险与mCherry-GFP-LC3转染腺病毒在感染复数(MOI) 40。两天后,荧光信号被共焦显微镜检查(蔡司,耶拿,德国)。黄色和红色LC3 puncta手工计算。

2.12。透射电子显微镜(TEM)

老鼠被注射过量麻醉剂,牺牲和心脏组织在PBS很快被删除,洗几次。心脏组织切成1毫米横向部分和沉浸在一夜之间2%戊二醛。然后,部分浸在1%四氧化锇2 h,在分级乙醇脱水,嵌入在环氧树脂。超薄部分(60 - 70 nm), poststained与醋酸双氧铀及柠檬酸铅,并检查使用TEM (Tenai G2精神;晚宴过后,美国)。

2.13。酶联免疫吸附试验(ELISA)

il - 6和TNF -α水平衡量标准的夹心ELISA协议从心脏匀浆和血清。il - 6检测使用一只老鼠anti-mouse白介素单克隆抗体(504502、BioLegend圣地亚哥、钙、美国)的捕获和生物素化的老鼠anti-mouse白介素单克隆抗体(504602、BioLegend圣地亚哥、钙、美国)的检测。肿瘤坏死因子-α用一只老鼠anti-mouse TNF -α抗体(14 - 8321,eBioscience,圣地亚哥,美国)的捕获和生物素化的兔子anti-mouse TNF -α多克隆抗体(14 - 7423,eBioscience,圣地亚哥,美国)的检测。

2.14。统计分析

提出的定量值 (标准误差)。蛋白质含量是归一化的均值控制在每组实验数据。统计比较组间进行单向方差分析。成对的数据被学生的评估 以及。在所有情况下, 值< 0.05被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。心脏损伤是增强SOD1 KO小鼠相比,在WT AMI后的老鼠

探讨AMI后氧化应激对心肌损伤的影响,WT SOD1−−/(SOD1 KO)小鼠使用。首先,过氧化物水平是衡量她染色。如图1(一),过氧化物水平更高SOD1的心肌−−/老鼠比WT老鼠。MI组的缺血性心肌中过氧化物含量明显高于sham-operated组。SOD1的缺血性心肌超氧化物水平−−/老鼠远远高于WT老鼠。检测细胞死亡的心脏组织,TTC染色法和TUNEL染色进行。TTC染色显示SOD1的梗死面积−−/AMI老鼠明显高于AMI WT老鼠(图1 (b))。TUNEL分析表明,凋亡细胞的比例明显高于AMI老鼠相比,在WT和SOD1 sham-operated控制−−/老鼠,而凋亡细胞的数量在SOD1进一步增加−−/AMI的老鼠比WT AMI老鼠(图1 (c))。免疫印迹结果表明,伯灵顿的表达增加,Bcl2减少在WT和SOD1 AMI的心脏组织−−/sham-operated组小鼠相比。伯灵顿的表达是进一步增加,Bcl2被SOD1基因敲除在心脏组织进一步降低(图2(一个))。

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图1
SOD1 KO小鼠显示增强的缺血性损伤。(一)心脏组织的过氧化物水平被她染色检测。代表图像和定量分析。规模 。(b)代表图像和梗塞的面积的定量分析。白色区域代表INF。LV:左心室;正:梗塞面积。(c)心肌凋亡细胞被TUNEL染色检测。代表图像和定量分析。规模 。值是 , 在每一个组。 和 。
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图2
SOD1 KO小鼠缺血性心肌显示增强的自噬水平。(一)代表滴LC3II / LC3I,伯灵顿,Bcl2, S6K磷酸化和AMPK磷酸化定量分析LC3II / LC3I,伯灵顿,Bcl2 p-S6K, p-AMPK。(b)代表TEM结果显示的图像。红色箭头指示自噬空泡。规模 。(c)心肌LC3检测40毫克/公斤氯喹的存在。代表印迹和定量分析LC3II / GAPDH显示。值是 , 在每一个组。 和 。NS:没有意义。

AMI(后自噬在心脏中扮演重要角色44]。因此,自噬被蛋白免疫印迹检测LC3蛋白质水平和电子显微镜(TEM)自噬体和自吞噬泡。结果表明,LC3II / LC3I显著增加的比率相比,心脏组织受到AMI sham-operated组。LC3II / LC3I进一步增加的比率在缺血性心肌SOD1 KO小鼠相比,在WT老鼠(图2(一个))。AMPK-mTOR通路被公认为自噬的关键调节器(26,45]。因此,进行蛋白质分析检测AMPK和mTOR的活动。Thr172 AMPK的磷酸化是AMI后显著增加,而S6K的磷酸化,mTOR的衬底,没有感应。AMPK活性进一步诱发缺血性心肌SOD1 KO小鼠与WT老鼠(图2(一个))。TEM结果表明自噬空泡的数量(AVs)从老鼠受到AMI,增加心脏组织缺血性心肌和AVs的数量是在SOD1进一步增加−−/老鼠老鼠相比,在WT(图2 (b))。LC3-II的积累会导致从几个不同的方面,如中断lysosome-mediated autophagosome-lysosome融合步骤和抑制的蛋白质水解。因此,自噬流量检测通过添加氯喹(CQ)提高溶酶体pH值,从而抑制lysosome-mediated蛋白水解作用。结果表明,LC3-II蛋白质含量增加了添加CQ(图2 (c))。这些结果表明,自噬被AMI调节,伴随着AMPK活化。此外,自噬增加进一步的缺血性心脏组织SOD1 KO小鼠。

AMI的炎症反应在活的有机体内是衡量通过流式细胞仪检测炎症细胞的浸润。这里,我们筛选不同类型的免疫细胞,如B细胞、T细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞和单核细胞/巨噬细胞在心脏组织和全血。我们发现浸润的巨噬细胞和中性粒细胞显著增加遭受AMI的心脏组织,而其他类型的免疫细胞中没有检测到心脏组织。有更多的浸润的巨噬细胞和中性粒细胞SOD1的心−−/老鼠比WT老鼠AMI后(数字3(一个)- - - - - -3 (c))。这是通过免疫组织化学方法证实CD11b(图3 (d))。此外,炎症细胞因子il - 6和TNF -α在组织和ELISA检测血液样本进行检测。il - 6和TNF水平α显著增加的缺血性心脏组织,他们进一步增加SOD1 KO小鼠受到AMI(数字3 (e)和3 (f))。血il - 6和TNF -的水平α在不同的组没有显著不同。在血浆il - 6的浓度大约是35±15 pg / mL,和TNF -α几乎是观察不到的。没有差异,血液中的中性粒细胞和单核细胞的百分比在不同组(数字3 (g)和3 (h))。这表明炎症反应在脑缺血心肌区域,没有系统性。上述结果表明,心脏损伤在AMI增强小鼠模型下过度氧化应激。

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图3
SOD1 KO小鼠受到AMI表明缺血性心肌严重的炎症反应。(一)代表流式细胞仪从心脏样本中炎性细胞计数的结果。(c)定量分析的中性粒细胞(b)和(c)在心脏组织中巨噬细胞。(d)的免疫组织化学CD11b(中性粒细胞和巨噬细胞的标志)。阳性染色棕色所示。规模 。(e-f)定量分析的炎性细胞因子il - 6 (e)和肿瘤坏死因子-α在心脏组织(f)。(g-h)定量分析的中性粒细胞(g)和单核细胞在血液样本(h)。值是 , 在每一个组。 , , 。NS:没有意义。
3.2。氧化应激诱导增强的自噬和凋亡心肌细胞

检测心肌细胞氧化应激的影响在体外、细胞凋亡和自噬水平在SOD1击倒基本医疗检查。在这里,葡萄糖剥夺(GD)被用来模拟在活的有机体内心肌缺血的条件。首先,过氧化物水平被她染色和流式细胞仪检测。SOD1击倒的过氧化物水平3个显著增加。GD诱导更高的过氧化物含量和LC3II / LC3I比率基本医疗保险相比,在控制条件(数据4(一)和4 (b))。此外,GD-induced LC3II / LC3I比率明显增加了SOD1击倒(图4 (b))。GD增加AMPK磷酸化,进一步增加了SOD1击倒。此外,S6K磷酸化水平显著抑制在GD,尤其是siSOD1-transfected基本医疗(图4 (b))。

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自噬和凋亡水平增加SOD1-knockdown新生大鼠心肌细胞葡萄糖剥夺。(一)过氧化物水平的定量分析在医疗保险。(b)代表印迹和定量分析LC3II / LC3I S6K磷酸化和AMPK磷酸化。(c)代表图像和定量分析自噬流量检测的荧光mCherry-GFP-LC3信号(原来的放大,×400)。黄色puncta代表自噬小体。免费的红色puncta代表自吞噬泡。(d)自噬流量glucose-deprived基本医疗保险是被10μM氯喹。代表印迹和定量分析LC3II / GAPDH显示。流式细胞仪(e)代表结果在24 h和定量分析细胞凋亡水平从6 - 48 h。值表示 三个独立的实验。 , , 。N:正常状态;GD:葡萄糖剥夺。

此外,我们利用mCherry-GFP-LC3腺病毒监控自噬流量。结果表明,GD显著增加自噬小体的数量(黄色puncta)和自吞噬泡(免费红色puncta)在两个siNC——或者siSOD1-treated基本医疗保险。SOD1降价刺激进一步增加在自噬体和自吞噬泡在GD(图中4 (c))。自噬流量也测量通过添加10μM CQ抑制lysosome-mediated蛋白水解作用。结果表明,LC3-II蛋白质含量增加siNC——和siSOD1-treated基本医疗CQ的存在。LC3-II SOD1-knockdown进一步增加医疗保险的CQ GD(图下4 (d))。这些结果表明,新型诱导的氧化应激SOD1击倒GD下自噬流量增加。此外,细胞凋亡水平GD测量下医疗保险。siNC结果表明,没有区别,siSOD1-treated医疗保险在正常情况下从6至48 h。然而,凋亡细胞的数量显著增加在siSOD1-treated医疗保险相比,在siNC-treated医疗保险在GD从24到48 h(图4 (e))。这表明,氧化应激在医疗保险增加了细胞凋亡和自噬在体外在GD。

探讨自噬和凋亡过度氧化应激之间的关系,我们使用Atg5 siRNA封锁自噬。结果表明,Atg5显著地抑制自噬的击倒,但增强的细胞凋亡,在siNC——或者siSOD1-treated GD下医疗保险。SOD1击倒没有影响自噬和凋亡Atg5击倒在GD(图35)。这表明自噬保护细胞不受氧化应激下凋亡细胞死亡。

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图5
自噬和凋亡水平在Atg5-knockdown基本医疗葡萄糖剥夺。(一)代表印迹和定量分析LC3II / LC3I ATG5。(b)定量分析细胞凋亡水平在不同群体中24小时在GD。值表示 三个独立的实验。 和 。NS:没有意义。
3.3。硫氢化钠缓解GD-Induced细胞凋亡和自噬在医疗过度氧化应激在体外

H2S是一个生物活性小分子的还原性和在调节心血管疾病中扮演重要角色。在这项研究中,50μ硫氢化钠是用于治疗SOD1-knockdown基本医疗保险。如图6(一),过氧化物水平显著增加siSOD1-treated GD下医疗保险,但30分钟的预处理与硫氢化钠显著降低过氧化物水平siSOD1-treated GD下医疗保险。硫氢化钠预处理显著降低的细胞凋亡水平siSOD1-treated GD(图下医疗保险6 (b))。此外,LC3II / LC3I减少SOD1-knockdown医疗用硫氢化钠预处理在GD(图中6 (c))。数据显示硫氢化钠治疗部分抑制AMPK和激活mTOR活动siSOD1-treated GD(图下医疗保险6 (c))。通过监测mCherry-GFP-LC3腺病毒的自噬过程,我们发现,硫氢化钠预处理的自噬小体数量减少,自吞噬泡在GD SOD1-knockdown医疗保险(图6 (d))。这表明硫氢化钠预处理可以降低细胞凋亡和自噬水平siSOD1-treated GD下医疗保险。

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图6
硫氢化钠治疗降低了自噬和凋亡诱导葡萄糖剥夺SOD1-knockdown新生大鼠心肌细胞。(a)定量分析中的过氧化物含量SOD1-knockdown医疗保险在正常情况下或GD 50有或没有μ硫氢化钠治疗。(b)的定量分析细胞凋亡水平SOD1-knockdown医疗保险有或没有硫氢化钠治疗24小时。(c)代表印迹和定量分析LC3II / LC3I S6K磷酸化和AMPK磷酸化SOD1击倒后医疗保险有或没有硫氢化钠治疗。(d)代表图像和定量分析自噬流量检测的荧光mCherry-GFP-LC3信号(原来的放大,×400)。黄色puncta代表自噬小体。免费的红色puncta代表自吞噬泡。值表示 三个独立的实验。 , , 。
3.4。硫氢化钠缓解氧化应激下的AMI-Induced心脏损伤在活的有机体内

确定硫氢化钠保护SOD1−−/老鼠AMI后,SOD1−−/老鼠用生理盐水或硫氢化钠治疗术前30分钟。硫氢化钠预处理明显减少缺血性心肌超氧化物水平相比,盐水预处理(图7(一))。TTC染色表明,硫氢化钠预处理降低SOD1的梗塞大小−−/老鼠(图7 (b))。TUNEL分析表明,硫氢化钠预处理明显减少凋亡细胞的比例在梗死区(图7 (c))。此外,硫氢化钠预处理减少伯灵顿的表达、Bcl2的表达增加,并减少了LC3II / LC3I比率,在SOD1缺血性心肌−−/老鼠(图7 (d))。形态研究表明,硫氢化钠预处理降低了自噬空泡在SOD1缺血性心肌−−/老鼠(图7 (e))。这表明硫氢化钠预处理可以降低缺血性心脏组织在SOD1的自噬水平−−/老鼠。

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图7
硫氢化钠治疗减轻缺血性心肌细胞凋亡和自噬SOD1 KO小鼠。(一)代表图像和定量分析中的过氧化物含量SOD1 KO小鼠AMI手术后50有或没有μ摩尔/公斤硫氢化钠治疗。规模 。(b)代表图像和梗塞大小的定量分析有或没有硫氢化钠治疗。白色区域代表INF。LV:左心室;正:梗塞面积。(c)代表图像和定量分析心肌凋亡细胞的SOD1 KO小鼠有或没有硫氢化钠治疗AMI后手术。TUNEL染色显示为红色。细胞核蓝色所示。规模 。(d)代表印迹和定量分析LC3II / LC3I,伯灵顿,Bcl2。(e)代表TEM结果显示的图像。红色箭头指示自噬空泡。规模 。值是 , 在每一个组。 , , 。

测试的影响硫氢化钠治疗区域SOD1心脏组织的炎症反应−−/老鼠,渗透到免疫细胞被流式细胞仪检测。数据表明,硫氢化钠(预处理后30分钟,坚持2 d AMI)减少了大量巨噬细胞和中性粒细胞在SOD1缺血性心肌−−/老鼠比盐水控件(数字8(一个)和8 (b))。这是通过免疫组织化学方法证实CD11b(图8 (c))。此外,ELISA检测表明,硫氢化钠可以减少炎症细胞因子il - 6和TNF -α在SOD1缺血性心脏组织−−/老鼠(图8 (d)和8 (e))。这表明,硫氢化钠缓解区域AMI心在氧化条件下组织炎症反应在活的有机体内。此外,硫氢化钠预处理并不影响SOD1的大量血液单核细胞和中性粒细胞−−/老鼠(图8 (f)和8 (g))或水平的il - 6和TNF -α在等离子体(数据没有显示)。综上所述,这些数据表明,硫氢化钠预处理减轻过度氧化应激下的AMI-induced心脏损伤在活的有机体内。

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图8
外生H2年代缓解炎症反应从SOD1 KO小鼠缺血性心肌。(a - b)定量分析中性粒细胞巨噬细胞(a)和(b)从SOD1 KO心样本。(c)免疫组织化学的CD11b SOD1 KO小鼠。阳性染色棕色所示。规模 。(d e)定量分析的炎性细胞因子il - 6 (d)和肿瘤坏死因子-α在心脏组织(e)。(做减法)定量分析的中性粒细胞(f)和单核细胞(g)在SOD1 KO小鼠的血液样本。值是 , 在每一个组。 。NS:没有意义。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们调查的影响对心脏的过度氧化应激损伤在AMI和H的角色2在一个年代在调节这一过程在活的有机体内在一个AMI模型在体外GD-mimic心肌梗死模型。实验证明了以下重要的发现:(1)自噬和凋亡水平明显增加心肌缺血期间下过度氧化应激在体外和在活的有机体内;(2)区域炎症反应是在SOD1更严重−−/AMI后小鼠;(3)硫氢化钠预处理下自噬和凋亡减少缺血性心肌氧化应激在活的有机体内和在体外;和(4)H2年代缓解炎症反应在缺血性心脏组织氧化应激在活的有机体内。

越来越多的证据表明,过量的活性氧产生在心肌缺血,从而导致氧化应激在心脏46,47]。然而,目前尚不清楚ROS水平高的人容易AMI。在这项研究中,我们使用SOD1−−/老鼠研究对心脏的过度氧化应激损伤的影响在AMI和外生H的角色2在这个过程中。我们发现高活性氧(过氧化物)水平组织通常与大的梗塞大小有关。此外,过度的氧化应激水平显著提高了细胞凋亡在AMI缺血性心肌细胞。我们的研究结果表明,自噬水平显著增加AMI心脏组织,特别是在SOD1 KO小鼠,保护细胞的凋亡细胞死亡。过度氧化应激显著增加缺血性心脏组织的炎症反应,表明SOD1−−/老鼠更容易AMI。

此外,我们的研究结果表明,AMPK活化而mTOR活动期间没有降低AMI。这是在协议与以前的报告,松井等。26]。此外,我们的研究结果表明,AMPK活性的增加进一步受到过度的氧化应激。这表明过度氧化应激可能通过激活AMPK诱导自噬增强。松井等人报道,自噬增加缺血期间保护(26]。我们发现击倒的基本自噬蛋白ATG5 siNC——或者siSOD1-treated医疗保险在GD显著增加细胞凋亡水平。这表明自噬增强保护在GD。人们普遍认为,自噬是通常prosurvival;它允许细胞生存长期饥饿、受伤和其他压力(48]。我们的结果表明,击倒Atg5阻止进一步增加细胞凋亡水平siSOD1对待医疗保险在GD。受损的心脏组织细胞触发炎症反应(49]。增强炎症反应可能导致增加分泌炎性细胞因子,如肿瘤坏死因子-α和il - 6。建议高水平的肿瘤坏死因子-α或il - 6可能促进心肌细胞凋亡(50,51]。最后,过度的氧化应激导致心脏损伤加重。之间的相互作用的确切机制自噬,细胞凋亡,在氧化应激和炎症反应仍需要进一步的研究。

之前的研究使用GD培养心肌细胞模拟心肌缺血在活的有机体内(26,52]。在这项研究中,我们通过SOD1击倒诱导氧化应激在心肌细胞,增加细胞凋亡和自噬。这与我们的结果是一致的在活的有机体内。自噬是调制和mTOR的AMPK各种机制(53]。我们的研究结果表明,GD刺激激活AMPK mTOR的失活和诱导自噬,符合以前的报告,松井et al。26]。此外,我们发现过度氧化应激增强的自噬水平调节AMPK-mTOR通路。据报道,ROS能调节自噬影响autophagy-related基因4 (ATG4) [54]。唐家璇等报道,ROS能诱导自噬通过瞄准高机动组框1 (HMGB1) [55]。然而,氧化应激的确切机制调节通过调节自噬AMPK-mTOR通路需要进一步研究。

越来越多的证据证实,H2S是一个gasotransmitter在各种生理过程中扮演重要角色,尤其是在心血管系统。据报道,H2年代保护从心肌缺血再灌注损伤心肌细胞42,56- - - - - -59]。我们观察到H2从AMI伤害减少自噬活动年代保护心肌细胞和细胞凋亡水平,与先前的报道一致。有趣的是,我们这里首次报道,H2可以减少自噬和凋亡水平在AMI加剧背景氧化应激(SOD1击倒医疗保险和SOD1−−/老鼠)。然而,精确的机制2年代减少氧化应激下通过调节自噬水平AMPK-mTOR通路需要进一步调查。

最近的研究表明,H2年代发挥了至关重要的作用在各种疾病的炎症反应(60]。在这项研究中,我们表明,H2年代区域炎性细胞浸润减少对心脏梗塞的地区组织。我们还发现,炎症反应在梗塞的心脏地区,但没有系统性。硫氢化钠治疗可以减轻炎症反应在氧化应激。我们的研究扩展了知识,H2年代作为抗炎分子在心血管系统。然而,确切的机制2年代,减轻炎症反应,减少免疫细胞的渗透和炎性细胞因子的水平仍然是未知的。综上所述,我们的研究提供证据表明,外生H2年代从AMI可以保护心肌细胞损伤,减少过度凋亡在SOD1氧化应激和炎症反应−−/老鼠。

5。结论

总之,我们目前的研究结果支持这样的设想,即ROS水平高的人容易AMI。自噬和凋亡水平升高,缺血性心脏组织的炎症反应是氧化应激在AMI增加加剧了背景。增加细胞凋亡和自噬水平逆转了H2补充。外生H2年代发挥了至关重要的作用在保护心肌细胞从AMI损伤减轻缺血性心脏组织过度炎症反应。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项研究得到了国家自然科学基金(国家自然科学基金委)(31471088和31471088号Yi-chun朱和81670248 Ming-jie王)和上海市教育委员会重点实验室项目(ZDSYS14005 Yi-chun朱镕基)。

补充材料

补充材料和方法:小干扰rna序列设计SOD1-targeting 5 -GCATGGGTTCCATGTCCATCA-3 (siSOD1-1)和5 -GGTGGTCCACGAGAAACAAGA-3 (siSOD1-2)。两个小干扰rna序列和目标负控制核(siNC)合成了Biotend(上海,中国)。培养48 h后,医疗保险被转染每6-well 40 pmol siRNA板使用Lipofectamine RNAiMAX(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)制造商的指示。可拆卸的效率被免疫印迹检测转染后48 h。补充结果:为了避免脱靶效应,两个SOD1-targeting siRNAs测试。免疫印迹结果表明,这两个SOD1-targeting siRNAs都有效,与大约70%击倒效率(补充图S1)。因此,两个SOD1-targeting siRNAs之一是用于以下实验(siSOD1-2)和siSOD1命名。补充图S1:代表印迹和siRNA击倒后SOD1表达的定量分析。价值观代表三个独立实验的均值±SE。 。(补充材料)