文摘
本研究的目的是确定脑源性神经营养因子的前体的角色(pro-BDNF)心肌缺氧/复氧损伤(H / R)和解决潜在机制。为此,心肌微血管内皮细胞(MMECs)暴露于高浓度的葡萄糖(30毫米)48 h受到4 h的复氧缺氧后跟2 h。末端转移酶(TdT) dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色和flow-cytometric分析进行检测细胞凋亡。细胞划痕和capillary-like-structure形成化验了评估细胞的功能。apoptosis-related蛋白质的水平进行评估通过免疫印迹和免疫荧光检测。我们的研究结果表明,H / R损伤导致MMEC的TUNEL-positive显著增加细胞数量和减少MMEC迁移和capillary-like-structure形成加上pro-BDNF蛋白表达增加。此外,过度的pro-BDNF MMECs通过病毒载体导致增加pro-BDNF表达式,这upregulation诱导细胞凋亡。机械的实验表明,H / R没有影响BDNF,物,和半胱天冬酶3表达,但调节pro-BDNF,我NTR、sortilin phospho-JNK,裂解半胱天冬酶3蛋白质含量。相比之下,中和抗体明显减毒的内生pro-BDNF H / R-induced upregulation pro-BDNF的我NTR、sortilin p-JNK,裂解半胱天冬酶3蛋白质含量,表明我NTR-sortilin信号和激活物和半胱天冬酶3可能参与这些影响。总之,H / R-induced受伤可能由pro-BDNF,至少部分通过我的规定NTR-sortilin信号和激活物和半胱天冬酶3。
1。介绍
糖尿病(DM),一个强有力的和普遍的缺血性心脏病的风险因素,在全球范围内得到了越来越多的关注。心血管并发症是糖尿病患者发病率和死亡率的主要原因(1- - - - - -4]。此外,糖尿病增加心肌对缺血/再灌注(I / R)造成不可逆转的破坏,表现为缺乏氧气供应和随后的恢复血流(5- - - - - -8]。微血管干扰心肌再灌注损伤的重要特性(9]。心肌I / R与心肌细胞凋亡有关,由免疫细胞浸润炎症细胞因子释放,和血管生成10- - - - - -12]。心脏微血管内皮细胞,心肌微循环的一个基本组成部分,第一次被伤害之后再灌注损伤心肌细胞损伤后的修复心脏微循环,起到了至关重要的作用在再灌注后心肌细胞损伤的保护9,13]。此外,大量研究表明,内皮细胞(EC)功能障碍,几乎所有的重要活动形式的I / R损伤,确定I / R后细胞损伤的程度(14]。然而,潜在的机制负责造成的不利影响细胞凋亡和血管内皮损伤后内皮功能障碍引起的高血糖与I / R侮辱仍然是一个谜。
近年来,研究神经生长因子(神经生长因子)的家人一直集中在神经系统(15]。最近,大量的研究证实,这个家庭在心血管系统(也有一个重要的角色16]。脑源性神经营养因子(BDNF)、神经生长因子家族的一员,已被证明具有抗凋亡作用与肿瘤坏死因子的毒性α(肿瘤坏死因子-α)在人类微血管ECs (17]。Pro-BDNF,脑源性神经营养因子的前体,最初称为proapoptotic配体的神经系统。因此,相信pro-BDNF可能施加proapoptotic行动ECs (18,19]。
ECs和内皮祖细胞表达高亲和性受体称为Trk [20.]。神经生长因子、脑源性神经营养因子促进了ECs通过他们的生长和血管生成的高亲和性受体(TrkA和TrkB) (21]。此外,神经生长因子促进了心肌细胞的生存和功能恢复心肌I / R损伤后通过旁分泌途径(22]。我NTR神经营养因子的低亲和力受体,参与各种各样的细胞反应,包括细胞凋亡。Sortilin称为coreceptor我NTR据报道,和缺陷减少细胞凋亡(23]。pro-BDNF的行为是由受体介导的复杂的我NTR和sortilin24]。为我Pro-BDNF高亲和力NTR可能是深入参与心肌缺血/再灌注损伤(米里)。c-Jun n端激酶(物)是不可或缺的细胞增殖和细胞凋亡。然而,背后的分子机制的参与pro-BDNF I / R-induced内皮细胞凋亡过程中尚未完全阐明。
物,MAP激酶家族的成员之一,主要涉及死亡的感应receptor-initiated外生和线粒体凋亡后体内各种化学或生物制剂(25]。物激活凋亡信号通路transactivation特定的转录因子或调节线粒体的活性proapoptotic和凋亡蛋白质磷酸化直接通过不同事件,从而增加proapoptotic基因表达(26]。反过来,激活物磷酸化c-Jun和与细胞凋亡相关的蛋白质,如半胱天冬酶3 (27]。半胱天冬酶3活动是细胞凋亡的生化标志,和成像的活动分析的一部分apoptosis-targeted在癌症治疗反应28]。物的活动调节信号通路是至关重要的保护从I / R损伤心肌细胞(29日,30.]。
目前,没有证据表明pro-BDNF参与内皮I / R损伤的过程,和相应的分子机制尚不清楚。在目前的研究中,我们调查的角色pro-BDNF监管的缺氧/复氧(H / R)诱导内皮细胞凋亡,迁移,形成管和下一个检测蛋白的表达与细胞凋亡有关。这些发现将导致心肌I / R损伤的新治疗方法。
2。材料和方法
2.1。细胞培养
人类心肌微血管内皮细胞(MMEC)线从美国购买类型文化集合(写明ATCC,罗克维尔市,医学博士,美国)和维护在DMEM high-glucose完全培养基(美国Gibco沃尔瑟姆,MA),补充10%的胎牛血清(美国UT HyClone,洛根),100 U /毫升青霉素(σ,圣路易斯,密苏里州,美国),和100年μg / mL链霉素(σ)在湿润的气氛中含有5%的股份有限公司2在37°C。MMECs(文章3 - 5),其特点是典型的鹅卵石外观和积极CD31和CD34免疫染色(31日),被用于以下实验分析。
2.2。H / R损伤诱导
诱导H / R损伤如前所述[32),I / R模型通过MMECs成立。细胞被孵化high-glucose培养基(30毫米)48 h,然后暴露于低氧(5%的股份有限公司2,1%的人啊2,94% N2)为4 h 2 h的复氧(5%股份有限公司紧随其后2,21%的人啊2,94% N2)。
2.3。病毒载体转导MMECs和抗体中和
重组腺病毒表达人类pro-BDNF (Ad-GFP-pro-BDNF)或GFP基因控制(Ad-GFP)从GenePharma购买(中国上海)和用于感染ECs根据制造商的指示。转导效率验证了通过GFP表达和免疫印迹。中和抗体的重组prodomain BDNF (10μg / mL),特别是认识pro-BDNF但不成熟的BDNF或其他神经营养因子,添加到培养基诱导前H / R (33- - - - - -36]。
2.4。细胞凋亡检测
细胞凋亡被TUNEL检测试验(罗氏应用科学)和相应flow-cytometric分析根据制造商的指示。对于量化,TUNEL-positive细胞数在至少五个随机选择的视觉领域三个独立样本(总共500个计算细胞)。flow-cytometric分析被执行在BD FACSCalibur仪器(Becton, Dickinson和公司,富兰克林湖,新泽西,美国)。
2.5。免疫印迹分析
这个分析是确定蛋白表达和磷酸化水平。细胞蛋白提取与里帕裂解缓冲(Beyotime生物技术研究所)。蛋白(溶菌产物对应20μg蛋白质)被加载到一个凝胶每车道分开,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds - page)持续2 h在100 V缓冲区和被转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。阻塞后5%脱脂奶粉,抗体pro-BDNF (Alomone, 1: 400),脑源性神经营养因子(Abcam, 1: 500),我(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国;1:100),sortilin (Abcam, 1: 500)、物(圣克鲁斯生物技术,1:100),裂解半胱天冬酶3 (Asp175,细胞信号技术,1:1000),半胱天冬酶3,β肌动蛋白(圣克鲁斯生物技术)。抗体绑定被化学发光检测Tanon 5500成像系统(Tanon科技有限公司、上海、中国)和量化ImageJ软件(贝塞斯达国立卫生研究院,医学博士,美国)。
2.6。免疫荧光分析
细胞被固定为4%多聚甲醛在室温下(RT) 30分钟和permeabilized与否permeabilized Triton x - 100 (Sigma-Aldrich), 0.5%和5%的非特异性结合被孵化驴血清(杰克逊ImmunoResearch实验室)RT对30分钟。一夜之间,盖玻片被孵化在4°C以下主要抗体:兔子anti-BDNF (Abcam, 1: 500),兔子anti-pro-BDNF (Alomone实验室,1:400),anti-JNK(圣克鲁斯生物技术,1:100),anti-phosphorylated-JNK (p-JNK)(圣克鲁斯生物技术,1:100),兔子anti-p75NTR(圣克鲁斯生物技术,1:100),和山羊anti-sortilin (Abcam, 1: 500)抗体。二次抗体共轭Cy3或异硫氰酸荧光素被孵化2 h rt,细胞核被染了5分钟了。4 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)。细胞被洗了三次PBST每次孵化。照片拍摄使用共焦显微镜(510年卡尔蔡司,LSM)。
2.7。化验Capillary-Like-Structure形成和体外细胞划痕
我们进行了细胞划痕试验和capillary-like-structure形成实验评估的功能影响pro-BDNF MMECs在组织控制、H / R, H / R + anti-pro-BDNF, H / R +车辆。
capillary-like-structure形成的测定体外进行如前所述[37]。简单地说,ECs (105/)在24-well培养板涂上了200μ基底膜基质的L (356234;BD生物科学)。Capillary-like-structure形成12 h后成像在五个随机显微视觉领域的一个倒置相差显微镜。细胞划痕实验检测进行的迁移MMECs [38]。划痕试验,MMECs培养直到融合。血清饥饿24小时后,伤口是由一个线性抓盘子的底部用吸管小费。伤口的图片被抓获后24 h抓使用Motic AE31测光和尺寸显微镜(美国马弥尔顿)。
2.8。统计分析
所有的值了 平均误差(SEM)。统计分析是由单向方差分析比较多个组和学生的以及比较两组。数据与 被认为是具有统计学意义。统计分析了SPSS统计软件(版本16.0)。
3所示。结果
3.1。H / R与凋亡的Pro-BDNF Upregulation MMECs暴露于高浓度的葡萄糖
我们首先研究了H / R的影响在MMECs暴露在高浓度的葡萄糖(HG)。代表被拍了照片,和TUNEL积极性进行定量分析评价proapoptotic效果。暴露于汞后,H / R造成显著增加的比例TUNEL-positive细胞相比MMECs不受到H / R(对照组),表明H / R MMEC诱导细胞凋亡(数字1(一)- - - - - -1 (c))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
接下来,我们研究了H / R pro-BDNF蛋白水平的影响。的表达pro-BDNF衡量观察疣状细胞质和MMECs的质膜。值得注意的是,风险敞口的H / R造成重叠信号pro-BDNF染色和TUNEL染色MMECs(数字1 (d)和1 (e)),加上高水平的pro-BDNF以免疫印迹分析与控制(数据相比1 (f)和1 (g))。这些结果表明,H / R施加proapoptotic效应和调节pro-BDNF蛋白。
3.2。Pro-BDNF超表达促进MMEC细胞凋亡
测试是否增加pro-BDNF水平施加proapoptotic行动MMECs HG的条件下,我们与Ad-pro-BDNF或转染MMECs Ad-GFP作为阴性对照组(非)。的TUNEL分析adenovirus-infected MMECs HG条件下被执行(数字2(一个)- - - - - -2 (e))。pro-BDNF的蛋白表达显著增加与Ad-pro-BDNF转导后由免疫染色和免疫印迹分析,相比之下,在Ad-GFP-transfected细胞(非)。此外,Ad-pro-BDNF-transfected MMECs显示TUNEL-positive细胞数量显著增加(数据2 (f)- - - - - -2 (h))。简而言之,MMEC pro-BDNF引起的细胞凋亡。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(g)
(h)
3.3。需要Pro-BDNF H / R-Induced凋亡和功能障碍
H / R的proapoptotic作用似乎至少部分由upregulation pro-BDNF介导的。我们下一个评估pro-BDNF和H / R-induced细胞凋亡之间的关系(数据3(一)和3(d))。暴露的MMECs H / R导致相对细胞凋亡水平显著增加。这些影响被外源性废除anti-pro-BDNF抗体。这些结果表明,H / R可以通过移植诱导MMEC凋亡pro-BDNF。
(一)
(b)
(c)
(d)
解决的功能影响pro-BDNF MMECs, capillary-like-structure形成实验(图3(b))和细胞划痕实验(图3(c))。暴露MMECs到H / R减少capillary-like-structure形成和EC迁移;然而,外生anti-pro-BDNF抗体显著提高H / R-induced迁移MMECs(和capillary-like-structure形成)。综上所述,这些数据表明pro-BDNF所需H / R影响MMECs暴露于汞。
3.4。Proapoptotic蛋白参与的规定Pro-BDNF MMECs H / R损伤后表达
阐明背后的分子机制的作用pro-BDNF HG和H / R条件下,实验进行几个标记细胞凋亡的疣状(图4(一))和免疫印迹(数字4 (b)- - - - - -4 (e))。Colocalization的我NTR观察和sortilin细胞膜在所有组。H / R导致增加p-JNK核易位。暴露MMECs H / R的表达水平明显高于pro-BDNF引起的,我NTR、sortilin p-JNK,裂解半胱天冬酶3与MMECs相比保持在正常情况下( )。相比之下,在脑源性神经营养因子没有明显差异,物,半胱天冬酶3 H / R后表达水平。值得注意的是,治疗anti-pro-BDNF抗体显著逆转pro-BDNF的蛋白表达增加,我NTR,sortilin和抑制物的活性和半胱天冬酶3在MMECs接触汞和H / R。综上所述,这些数据表明我NTRsortilin和激活物和半胱天冬酶3相关的H / R-induced细胞损伤。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
4所示。讨论
高血糖,共同特征的1型和2型糖尿病是一个关键因素,有助于dm相关血管疾病的发展,尤其是微血管病(39]。电子商务功能障碍和细胞凋亡在米里的发展发挥了重要作用[40]。在目前的研究中,没有细胞迁移和capillary-like-structure形成发生的变化,和没有诱导细胞凋亡MMECs在DMEM培养high-glucose完全培养基。然而,在应对HG和H / R, MMECs显示增加的细胞凋亡水平和减少移民和capillary-like-structure形成,表明H / R导致MMEC受伤。值得注意的是,pro-BDNF蛋白表达增加H / R-treated MMECs。基于这些结果,我们假设pro-BDNF可能参与H / R-induced EC障碍和细胞凋亡。
一个研究小组(41)报道,BDNF保护心肌梗死后心脏功能障碍。其他研究人员(17)发现,BDNF保护人类血管ECs从细胞凋亡。在目前的研究中,超表达的pro-BDNF MMECs proapoptotic影响,但中和抗体pro-BDNF显著减毒细胞凋亡和EC迁移和减少capillary-like-structure形成后由MMECs接触汞和H / R。与其他地方的结果一致(42- - - - - -44),这些数据证明pro-BDNF有助于H / R-induced细胞损伤。
Pro-BDNF显示的高亲和性结合sortilin并执行其生物功能作用于受体:我NTR和sortilin45]。一些研究表明,物途径有助于growth-inhibitory效应和ECs的细胞凋亡,抑制物激活保护从I / R损伤心肌细胞46- - - - - -49]。Pro-NGF / p75NTR sortilin信号增加物信号(50]。此外,cleavage-resistant pro-BDNF突变(CR-pro-BDNF)治疗导致快速磷酸化的物参与p75NTR-induced凋亡和早期出现小脑颗粒神经元的激活半胱天冬酶3 (51]。Pro-BDNF也被证明是对交感神经元和proapoptotic配体可能通过激活受体诱导神经细胞凋亡的复杂p75NTR和sortilin24]。在目前的研究中,数据MMECs透露,H / R,增强pro-BDNF蛋白表达,诱导我NTR和sortilin蛋白质表达和激活物和半胱天冬酶3增加。相比之下,anti-pro-BDNF抗体显著逆转这些影响。总的来说,我们的数据表明,pro-BDNF施加proapoptotic效应对心肌I / R损伤至少部分通过我的规定NTR-sortilin信号和激活物和半胱天冬酶3。
糖尿病肾病是糖尿病的严重的微血管并发症;H / R促进氧化应激在NRK-52E细胞暴露于汞伴随着Nrf2和HO-1蛋白质表达水平上升(32,46]。高葡萄糖也被证明是提高心脏微血管内皮细胞的通透性。因此,是否其他分子机制造成的影响pro-BDNF H / R是一个有趣的和值得进一步调查。
5。结论
总之,我们的研究的主要发现是,抑制pro-BDNF可能表现出有益的影响对H / R通过促进MMEC迁移和capillary-like-structure形成。此外,这些影响是至少部分通过我MMEC减少细胞凋亡有关NTR-sortilin-mediated激活物和半胱天冬酶3。我们的结果可能促进未来研究pro-BDNF在米里的治疗治疗的影响。
缩写
| 脑源性神经营养因子: | 脑源性神经营养因子 |
| MMECs: | 心肌微血管内皮细胞 |
| H / R: | 缺氧/复氧 |
| 糖尿病: | 糖尿病 |
| CMECs: | 心脏微血管内皮细胞 |
| 神经生长因子: | 神经生长因子 |
| 肿瘤坏死因子-α: | 肿瘤坏死因子α |
| 物: | c-Jun n端激酶 |
| 美里: | 心肌缺血/再灌注损伤。 |
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
伦理批准
实验和程序都是经伦理委员会批准的中南大学,长沙,湖南410011,中国。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
范和徐Junmei设计研究。范Yu和Yuezhu刘进行实验,收集数据。范Yu和刘Yuezhu分析和解释实验数据。范Yu和Junmei徐准备手稿。
确认
这项工作是由中国国家自然科学基金(批准号81370254)。作者感谢李人技术援助。