文摘

目的。胰腺癌是一种全世界最迅速致命的癌症。新兴的研究已经开始证明线粒体在癌症治疗中起到至关重要的作用。进行Mfn2 Mitofusin2()在线粒体中扮演不可或缺的角色融合和调节功能。然而,的作用和潜在机制进行Mfn2胰腺癌细胞自噬的尚不清楚。我们的目的是探索的影响进行Mfn2在多个生物功能涉及细胞自噬在胰腺癌。方法。胰腺癌细胞系,Aspc-1对待Ad-Mfn2超表达。西方墨点法,caspase-3活动测量,CCK-8和活性氧(ROS)试验被用来检查在胰腺癌中进行Mfn2自噬的影响,细胞凋亡,细胞增殖,氧化应激和PI3K / Akt / mTOR信号。组织的表达进行Mfn2被免疫组织化学染色检测。生存分析的进行Mfn2被OncoLnc评估。结果。改进的表达中进行Mfn2 LC3-II和伯灵顿,表达下调P62和bcl - 2在胰腺癌细胞的表达。同时,进行Mfn2也显著地抑制p-PI3K的表达,p-Akt, p-mTOR蛋白在胰腺癌细胞。此外,进行Mfn2抑制胰腺癌细胞增殖和ROS生产。评估进行Mfn2 kaplan meier曲线显示−比进行Mfn2胰腺癌预后更差+胰腺癌。结论。我们的发现表明,诱导细胞自噬的胰腺癌中进行Mfn2通过抑制PI3K / Akt / mTOR信号通路。与此同时,进行Mfn2也影响胰腺癌细胞的多种生理功能。进行Mfn2可能在胰腺癌治疗作为治疗目标。

1。介绍

伴随着近100%的5年死亡率,胰腺癌是全世界最迅速致命的癌症之一(1]。虽然近年我们有一些惊人的改进发展的手术,放疗,化疗,胰腺癌仍有绝望的预后,主要是因为其侵略性的生物行为和晚期的症状为临床诊断(2]。特征,带来大量的困难治疗胰腺癌的治疗干预。之一,临床治疗胰腺癌的主要问题是,我们还不完全了解这种疾病的发病机理和发展。因此,深入探索胰腺癌的恶性本质是迫切需要新的治疗方法的发展。

线粒体发挥重要作用在高分子生物合成所需的中间体和ATP的生产(3]。线粒体还参与信号通路的激活。目前的证据表明,生物合成、信号和线粒体生物能疗法需要肿瘤发生[4]。新兴的研究已经开始证明线粒体在癌症治疗中起关键作用5]。与此同时,越来越多的证据表明,肿瘤抑制和关键致癌基因修改通过重要的信号通路和线粒体动力学函数和线粒体质量变量在不同肿瘤和个人(6,7]。

Mitofusin2(进行Mfn2)是线粒体外膜蛋白在线粒体中扮演不可或缺的角色融合、调整功能和线粒体形态(8]。研究报道,ER应激进行Mfn2 up-adjusted,和基因消融进行Mfn2增加细胞死亡在ER应激(9]。在骨骼肌进行Mfn2调节最优生物属性通过维持线粒体质量控制和高效的线粒体代谢(10]。进行Mfn2击倒的海拉细胞和人体平滑肌细胞系,自噬降解受损,减少ATP生产、抑制细胞糖酵解和线粒体耗氧率,抑制细胞增殖观察(11]。

近年来,进行Mfn2也做了新的阐述肿瘤的研究领域。几项研究已经发现的抗肿瘤效应进行Mfn2在不同的恶性肿瘤,包括胃肿瘤、乳腺癌、肝癌和膀胱癌症(12- - - - - -14]。的最新研究表明,胰腺癌,使细胞在凋亡中进行Mfn2中压力还存在与裂解。但细胞周期进行Mfn2的超表达没有明显改变。肿瘤细胞的迁移和入侵能力被抑制(15]。指出进行Mfn2的过度表达在胰腺癌可能成为一种有效的治疗策略。然而,自噬的作用和潜在机制进行Mfn2胰腺癌细胞仍不清楚。

在这项研究中,我们使用腺病毒进行Mfn2胰腺癌细胞,这样我们就可以评估进行Mfn2对自噬的影响。此外,我们发现机制Mfn2-induced胰腺癌细胞的自噬。同时,我们进一步深入探讨一些潜在的生物机制进行Mfn2的生物信息学分析。

2。材料和方法

2.1。细胞培养使

Aspc-1细胞株是一个礼物从细胞实验室的北京朝阳医院,首都医科大学。低温贮藏Aspc-1细胞解冻,然后培养在37°C和5%的公司2适当体积的10%胎牛血清的边后卫在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)从Gibco购买(美国)。细胞生长对数生长阶段使胰蛋白酶化,然后通过。

2.2。腺病毒

进行Mfn2腺病毒编码的开放阅读框(Ad-Mfn2)和控制腺病毒是由霁KAI基因技术有限公司(中国,北京)。Aspc-1细胞被培养为24小时同步,然后孵化与腺病毒感染复数(MOI) 100微升的每个细胞在37°C 4 h。

2.3。细胞生存能力分析

细胞生存能力分析是由细胞计数检测Kit-8(中国Beyotime CCK-8)遵循指令。细胞生存能力计算如下:

2.4。Caspase-3活动测量

的活动caspase-3测试使用caspase-3活动分析工具包(Beyotime C1115,中国)。吸光度(A405)使用ELISA测定读者(美国BioTek)。

2.5。活性氧(ROS)测量

细胞内ROS水平变化检测的氧化转化cell-permeable 2 ,7 二乙酸二氯荧光素(DCFH-DA)荧光二氯荧光素(DCF)。Aspc-1细胞孵化与Ad-Mfn2或控制媒体。DCF荧光测量使用FACScan流式细胞分析仪(正)。

2.6。免疫印迹分析

西方墨点法进行,上面描述的(16]。主要的抗体和二级抗体补充表中列出S1网上。蛋白质乐队可视化使用西方SuperSignal Pico化学发光底物(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)。平均强度分析是用来量化蛋白质表达。和每个标准蛋白带的平均强度量化使用Photoshop CS5(奥多比公司),并使用GAPDH这些结果归一化。结果被GraphPad column-plotted棱镜7软件。

2.7。免疫组织化学染色

免疫组织化学染色(包含IHC)测试中描述之前的研究(17]。进行Mfn2部分被孵化与鼠单克隆抗体(美国Abcam ab56889)主要在一个晚上在4°C。然后,部分被孵化用辣根过氧化物酶共轭抗体,而使用的色原3 2%,3 -diaminobenzidine (DAB)。至于组织学和免疫组织化学评估,进行Mfn2分析表达式,根据阳性细胞的数量,免疫组织化学结果分类如下:+ + +,正面(> 70%);+ +,积极(50 - 70%);+,正面(30 - 50%);±,弱阳性(10 - 30%);−,负(< 10%)。盲目的表达进行Mfn2评估和两个独立的调查。

2.8。PPI网络建设和识别

Cytoscape应用程序可以构建复合基因基因功能交互网络。边缘带注释的结果来自出版物或公共数据库(18]。潜在的Mfn2-regulated基因通过GeneMANIA Cytoscape应用。

2.9。Mfn2-Regulated基因的功能富集分析

从ExoCarta FunRich(功能富集分析工具)(http://www.exocarta.org/)被用来执行分析。FunRich是一个独立的软件仪器主要用于交互网络分析和功能丰富的蛋白质和基因。截止的标准是 。

基因本体论(去)主要包含分子功能(MF)、生物过程(BP)和细胞组件(CC) [19]。数据库的注释,可视化和综合发现(大卫,http://david.abcc.ncifcrf.gov/)是一个功能注释工具来理解生物意义(20.]。基因和基因组的京都百科全书(KEGG) [21提供关于分子或基因网络的信息。GO-CC, GO-BP和GO-MF条件筛选 值< 0.05。重要的丰富KEGG通路被认同 值< 0.05。

2.10。在人类胰腺癌中进行Mfn2生存分析

OncoLnc (http://www.oncolnc.org)是一个工具交互发现生存的相关性。OncoLnc有8647病人生存收集的数据来自21个癌症研究的癌症基因组图谱(TCGA)。分析了胰腺癌患者的总生存一个kaplan meier阴谋。胰腺癌患者被分为两组的基础上高或低表达特定基因。

2.11。统计分析

统计分析是利用SPSS 16.0(美国SPSS,芝加哥,IL)。 值< 0.05被认为是具有统计学意义。单向方差分析和双尾的学生t以及进行组间比较的方差。

3所示。结果

3.1。进行Mfn2抑制胰腺癌细胞增殖

进一步测试进行Mfn2对胰腺癌细胞增殖的影响,CCK-8化验。与对照组相比,超表达中进行Mfn2 Aspc-1扩散细胞被抑制(图1)。


图1
CCK-8试验是用于验证Aspc-1细胞增殖( ; )。
3.2。进行Mfn2触发器在胰腺癌细胞凋亡

评估在胰腺癌细胞细胞凋亡进行Mfn2过度,bcl - 2、Bax的表达用免疫印迹分析测量。Caspase-3活动也执行。

伯灵顿水平在Ad-Mfn2组显著增加。此外,进行Mfn2显著降低bcl - 2 Aspc-1水平与对照组相比。与控制相比,增加caspase-3活动也是Ad-Mfn2组(图中观察到2)。

(一)
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(b)
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(e)
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图2
(一)量化的西方墨迹的表达式中进行Mfn2 Ad-Mfn2组相对于对照组( ; )。(b)量化的西方墨迹Ad-Mfn2伯灵顿表达式的组与对照组相比。( ; )。(c)量化的西方墨迹的bcl - 2表达Ad-Mfn2组相对于对照组( ; )。(d)西方墨点法用于检测bcl - 2、Bax的表达来验证在胰腺癌细胞细胞凋亡。(e) Caspase-3活动测量( ; )。
3.3。进行Mfn2对活性氧(ROS)在胰腺癌

ROS水平进行了流式细胞术DCFH-DA荧光探针。有显著减少ROS-positive Ad-Mfn2组的细胞相比,控制。在对照组,DCF-positive细胞的平均汇率为93.12±2.28%,而71.79±2.42% Ad-Mfn2组导致细胞内ROS生产( )(图3)。


图3
ROS水平被DCFH-DA使用流式细胞仪检测荧光探针。之间有显著差异进行Mfn2超表达组和对照组ROS水平的胰腺癌( ; )。
3.4。进行Mfn2增强细胞自噬在胰腺癌

免疫印迹分析表明,的表达进行Mfn2 LC3-II / LC3-I增加超表达组。也有减少的表达式中P62 Ad-Mfn2组(图4)。

(一)
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(b)
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图4
(一)量化的西方墨迹的表达式中进行Mfn2 Ad-Mfn2组相对于对照组( ; )。(b)量化的西方墨迹中P62表达式Ad-Mfn2组相对于对照组( ; )。(c)量化的西方墨迹LC3 II / LC3我表情Ad-Mfn2组相对于对照组( ; )。(d)西方墨点法用于检测LC3的表达和P62验证细胞自噬在胰腺癌细胞。
3.5。进行Mfn2增强细胞自噬通过抑制PI3K / AKT / mTOR信号通路

接下来,免疫印迹分析表明,显著减少的表达中进行Mfn2 phosphorylated-PI3K (p-PI3K) phosphorylated-Akt (p-Akt)和phosphorylated-mTOR (p-mTOR)(图5)。p-PI3K的表达、p-Akt p-mTOR超表达中进行Mfn2组明显减少。作为一个PI3K / AKT信号通路的激活,igf - 1给出了执行救援实验。添加Ad-Mfn2组igf - 1之后,p-PI3K的表达,p-Akt, p-mTOR超表达中进行Mfn2集团的价格相比显著增加。我们认为进行Mfn2诱导胰腺癌细胞自噬通过抑制PI3K / AKT / mTOR信号通路。

(一)
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图5
进行Mfn2促进细胞自噬通过抑制PI3K / AKT / mTOR信号通路。(a)量化的西方墨迹Ad-Mfn2 p-PI3K表达式的组比对照组和Ad-Mfn2+igf - 1组( ; )。(b)量化的西方墨迹Ad-Mfn2 p-AKT表达式的组比对照组和Ad-Mfn2+igf - 1组( ; )。(c)量化的西方墨迹Ad-Mfn2 p-mTOR表达式的组比对照组和Ad-Mfn2+igf - 1组( ; )。(d)西方墨点法用于检测p-PI3K的表达,p-Akt, p-mTOR胰腺癌细胞。
3.6。进行Mfn2表达和临床病理因素之间的联系

IHC结果表明Mfn2-positive蛋白主要位于胞浆,染成黄色或黄色颗粒在细胞质中(图6)。进行Mfn2表达在正常胰腺和胰腺癌组织。进行Mfn2表达和临床病理因素之间的关系,包括性别、年龄、分化等级、和TNM阶段,如表所示1。

(一)
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(b)
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图6
胰腺手术切除标本显示了胰腺癌细胞块进行Mfn2与布朗细胞质染色(免疫组织化学;原始的放大,×400)。这些细胞(b)几乎完全是沥青质+染色。(b)沥青质−染色细胞可以在这里找到。
表1
进行Mfn2表达和临床病理因素之间的关系。
3.7。之间的关系进行Mfn2 Immunosubtype在胰腺癌和生存

评估进行Mfn2 kaplan meier曲线显示−比进行Mfn2胰腺癌预后更差+胰腺癌。一个Mfn2-positive表达式有一个大大延长患者生存时间比一个Mfn2-negative表达式( ,生存率较)(图7)。


图7
胰腺癌患者的总体生存曲线。根据kaplan meier表达式中进行Mfn2曲线计算方法。红线是高表达组( ),蓝线是低表达或不组( )。

根据上面的数据我们发现,进行Mfn2 immunophenotype胰腺癌的恶性行为密切相关。进行Mfn2−胰腺癌是一种积极的亚型,在进行Mfn2旁边+胰腺癌,较慢的一种亚型。

3.8。PPI网络建设

基于数据从GeneMANIA, PPI网络组成的基因进行Mfn2监管由Cytoscape软件(补充图S1在线1)。网络由节点和112的链接。112的链接包括物理交互(67.64%)、coexpression(13.50%)、预测(6.35%),途径(4.35%)、colocalization(6.17%)、遗传相互作用(1.40%),蛋白质和共享域(0.59%)。进行Mfn2监管基因的完整列表补充表所示S2。

3.9。去分析进行Mfn2监管基因

去分析后进行Mfn2监管基因,重要的条款包括细胞组件,生物过程,收集和分子功能。线粒体的组成和生物转化是最重要的生物过程的浓缩( );线粒体是细胞的最高浓缩组件( );和GTPase活性分子的最高浓缩功能( 所示),补充数据S2,S3,S4在线)。

3.10。TFs功能富集分析

的TFs coexpressed度在CTCF大大丰富,OTX1 ELF1和PITX1(所有 )。所有转录因子浓缩分析CTCF是11.8%。所有TFs coexpressed度补充图所示S5网上。

3.11。KEGG浓缩进行Mfn2监管基因的途径

KEGG浓缩后进行Mfn2分析监管基因,重大KEGG收集。相关的通路富集主要是由DAIVD病毒致癌作用( )(BAK1,伯灵顿,UBR4)。

4所示。讨论

最近,已成为一颗冉冉升起的新星在肿瘤研究中进行Mfn2 [12- - - - - -14]。在这项研究中,我们首次提出,可以增加细胞自噬中进行Mfn2 mTOR / PI3K / Akt信号通路的胰腺癌。被认为执行抗增殖和proapoptotic函数中进行Mfn2胰腺癌。同时,进行Mfn2与胰腺癌的生存率。最重要的是,它是进行Mfn2表示,可能是一个潜在的临床治疗目标在胰腺癌。

自噬在胰腺癌的发展有一个复杂的角色,促进建立肿瘤生长的抑制肿瘤发生的早期阶段。确切的路径控制的双重角色,自噬在胰腺癌的发病机制,和自噬是否有效或有缺陷,仍有待阐明(22]。重要的机制,可以链接异常自噬在胰腺炎和胰腺癌包括炎症p62积累和线粒体功能障碍,导致增加活性氧的水平(23]。在这项研究中,进行Mfn2被发现增加了细胞自噬的PI3K / Akt / mTOR信号通路在胰腺癌。胰腺癌的自噬活性氧的生产下降。自噬的影响在胰腺癌proapoptotic的潜在机制和抗增殖功能进行Mfn2的胰腺癌。

线粒体是高度动态的细胞器,应对细胞压力的变化联系,整体质量,和亚细胞定位24,25]。线粒体整体质量的变化反映了mitophagy率之间的平衡和线粒体生物起源26,27]。进行Mfn2线粒体动态的裂变中扮演一个重要的角色。在这项研究中,进行Mfn2与胰腺癌的生存率。这项研究还表明,线粒体动力学可能治疗癌症的一个关键方面。

在这项研究中,我们还利用生物信息学方法分析潜在的监管进行Mfn2基因,旨在为进一步提供有价值的信息进行Mfn2生物机制说明并提供为胰腺癌的治疗目标识别奠定基础。相关的通路富集主要是由DAIVD病毒致癌作用,这表明进行Mfn2癌症的发病机制密切相关。本研究也有一些局限性。进一步研究有关的体内效应进行Mfn2胰腺癌的仍然是必需的。

5。结论

我们的发现表明,诱导细胞自噬的胰腺癌中进行Mfn2通过抑制PI3K / Akt / mTOR信号通路。与此同时,进行Mfn2也影响胰腺癌细胞的多种生理功能。进行Mfn2可以作为治疗胰腺癌的治疗目标。

数据可用性

所有数据用于支持本研究的结果都包含在本文和补充信息文件。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

补充材料

补充1。补充图S1:在线(1)PPI网络的Mfn2-regulated基因。行代表的蛋白质相互作用关系对应的基因。

补充2。补充图S2:(在线)去分析后进行Mfn2监管基因,重要的方面去收集生物过程。

补充3。补充图S3:(在线)去分析后进行Mfn2监管基因,重要的方面去收集细胞组件。

补充4。补充图S4:(在线)去分析后进行Mfn2监管基因,重要的方面去收集分子功能。

补充5。补充图S5(在线):功能富集分析转录因子(TFs)。转录因子(TF)浓缩Mfn2-regulated基因分析。

补充6。补充表S1:(在线)抗体和条件用于免疫印迹分析。

补充7。补充表S2:进行Mfn2监管GeneMANIA获得的基因。