银杏叶在链脲佐菌素诱导的糖尿病ApoE中，叶提取物通过减轻内质网应激保护心肌免受损伤^−−/老鼠

摘要

高脂日粮喂养ApoE可诱发糖尿病^−−/小剂量链脲佐菌素(STZ)连续给药5天。小鼠灌胃给予GBE(200或400 mg/kg)，连续12周。糖尿病组给予生理盐水，非糖尿病C57BL/6J小鼠作为对照组。real-time PCR检测І、ІІІ胶原mRNA表达。肿瘤坏死因子-α, il - 1βmRNA水平和NF-κ测定B的表达以分析心肌内炎症。Western blotting分析内质网应激(ERS-)相关凋亡通路的特征，包括磷酸化C - jun n -末端激酶(p-JNK)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、caspase-12和cleaved caspase-3。糖尿病ApoE^−−/心肌损伤与心肌细胞凋亡增加(p-JNK、CHOP、caspase-12和cleaved caspase-3表达增加)、间质纤维化(胶原І和ІІІ mRNA水平增加)和炎症(TNF- mRNA水平增加α和il - 1β，和NF-κB表达)。GBE 200和400 mg/kg/d通过抑制p-JNK、CHOP和caspase-12途径显著降低糖尿病小鼠心肌细胞凋亡、胶原沉积和炎症。血清促炎细胞因子(IL-6, IL-1)水平β和肿瘤坏死因子-α)，血糖和血脂水平也受GBE治疗的调节。GBE可能对糖尿病心肌损伤的治疗有帮助。

1.导言

糖尿病性心肌病(DCM)是糖尿病的主要心血管并发症之一，最终导致心力衰竭，增加糖尿病患者的死亡率。糖尿病性心肌损伤包括心肌细胞凋亡、心肌纤维化、心肌内炎症是DCM的重要病理特征。糖尿病诱导的心肌细胞凋亡常伴有间质胶原沉积和肌纤维紊乱[1]．此外，越来越多的证据表明，底物代谢改变、氧化应激和慢性炎症会导致DCM和糖尿病心肌损伤[2，3.]．

内质网应激(Endoplasmic reticulum stress, ERS)在糖尿病心肌损伤的发展中起着至关重要的作用，因为持续和未纠正的未折叠蛋白反应(UPR)可能导致细胞死亡[4]．UPR由三个途径介导，肌醇需要激酶1 (IRE1)、蛋白激酶r样内质激酶(PERK)和激活转录因子6 (ATF6)途径。ers介导的细胞死亡涉及c-Jun的激活N-末端激酶(JNK)、C/EBP同源蛋白(CHOP)和caspase-12，从而激活caspase-3。

IRE1和JNK的激活可能导致核因子κ b (NF-)的上调κB)通过IkB激酶(IKK)磷酸化表达[5，6].NF的上调-κB的表达导致促炎细胞因子的增加，如肿瘤坏死因子-α(肿瘤坏死因子-α), interleukin-1β(il - 1β)和IL-6，它们可导致心肌细胞凋亡和心肌纤维化[7]．

近年来，中药治疗糖尿病心肌损伤引起了人们的广泛关注。银杏叶在中国，叶子作为一种传统草药已经使用了数百年银杏叶叶提取物(GBE)包括两种活性物质，即萜类(包括银杏内酯和双叶内酯)和类黄酮(图1)GBE显示出抗氧化、自由基清除和膜稳定活性，这有助于其在糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注损伤中发挥有益作用[8]．此外，它在链脲佐菌素- (STZ-)诱导的糖尿病动物胰腺中显示了抗炎和抗氧化作用[9，10]．此外，GBE通过增加胰岛素诱导的Akt磷酸化和胰岛素受体底物1的表达来增强胰岛素敏感性和预防胰岛素抵抗[11]．GBE也被证明可以改善stz诱导的糖尿病大鼠的糖尿病肾病[12]．

目前，很少有研究探讨GBE治疗糖尿病心肌损伤的潜在用途。本研究旨在探讨GBE是否具有预防糖尿病心肌损伤的作用，并阐明其作用机制。

2.材料和方法

2.1.药物

GBE粉和阿托伐他汀分别购自北京韩电药业有限公司和辉瑞制药有限公司。本研究中使用的GBE含有44.9%的银杏类黄酮、6.3%的萜类和< 1ppm的银杏酸。

２.２.实验动物

男性ApoE^−−/小鼠，6-7周龄，体重19-21 g (C57BL/6J本底，北京大学医学部实验动物科学系从美国Jackson实验室引进;质量认证号:SCXK (Beijing) 2016-0012)。饲养条件为2级。小鼠维持在受控条件下(室温，22-24°C;相对湿度50%;和灯;7:00 - 19:00)。实验方案经中国中医科学院西苑医院机构动物护理使用委员会批准。动物实验是按照美国国立卫生研究院出版的《实验室动物护理和使用指南》进行的。

2．3.试验协议

ApoE^−−/小鼠饲喂高脂饲料(基本饲料，78.85%;脂肪,21%;糖尿病发生前腹腔注射50 mg/kg/d的STZ (Sigma)，以枸橼酸缓冲液(pH 4.5;最终浓度，1%)连续5天，如之前的研究[13]．血糖水平为> 12 mmol/L的小鼠被认为是糖尿病小鼠，用于研究( ） ［13，14]．然后用阿托伐他汀治疗糖尿病小鼠[15，16] (10 mg/kg/d，灌胃(ig)， )、GBE低剂量(200 mg/kg/d， )或高剂量GBE (400mg /kg/天， ）.GBE的剂量是根据以前的研究选择的[17，18]．给予等量生理盐水治疗的糖尿病小鼠作为未治疗糖尿病组( ).所有ApoE^−−/小鼠维持高脂饮食，治疗12周后处死。C58BL / 6 j小鼠( )作为对照组。研究时间轴如图所示2．

2.4.体重和血糖变化

在首次GBE剂量前和之后每四周测量一次体重和空腹血糖水平。采用切尾法采集血浆样本，采用罗氏血糖仪测定血糖水平。

2．5．组织制备及组织学检查

所有动物安乐死，并采集心脏样本，然后灌注肝素盐水。横切标本，用4%多聚甲醛固定24 h。然后将它们包在石蜡中，切成5块μm厚切片检查苏木精/伊红和马森染色。对cleaved caspase-3进行免疫组化染色(rabbit polyclonal anti-cleaved caspase-3, CST, 1:200稀释)。采用Image-pro plus 6.0软件(Media Cybernetics Inc.， Rockville, MD, USA)对显微镜图像进行200倍放大的免疫组化半定量分析。cleaved caspase-3阳性表达用积分光密度(IOD)表示。

2.6。免疫印迹分析

将心脏组织从液氮中取出，称重，并在放射免疫沉淀分析(RIPA)裂解缓冲液中均质。采用双氰菊酯酸法测定蛋白质浓度。等量的蛋白质(40μg） 通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离每个样品并转移到硝化纤维素膜上。通过将膜与5%脱脂乳和0.2%吐温20在Tris缓冲盐水中培养2小时来阻断非特异性位点 洗涤后，将膜与以下主要抗体在4°C下孵育过夜：抗CHOP（CST2895S，1 : 2000），反JNK（CST9252S，1 : 2000），反p-JNK（CST9251S，1 : 1000），抗半胱天冬酶-12（CST22202S，1 : 抗切割半胱氨酸蛋白酶-3（CST9664S，1 : 1000）和抗NF-κB (Abcam 86299, 1: 2000)。用TBS-T洗涤膜，用辣根过氧化物酶(HRP-)结合的二抗孵育膜。然后，利用增强化学发光系统对膜进行检测。使用甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)以确保上样量相等。CHOP、caspase-12、cleaved caspase-3和NF-的表达水平κB组进行GAPDH调整，与未治疗的糖尿病组比较值归一化。在未治疗的糖尿病组中，p-JNK的表达水平被调整为JNK总量，然后趋于正常。

2.7。定量实时聚合酶链反应

实时聚合酶链反应(Real-time polymerase chain reaction, PCR)检测I、III型胶原、TNF- mRNA表达α, il - 1β．采用GAPDH作为内部控制。引物序列如下:collagen I, 5-TGGAAACCCGAGGTATGCTT-3(向前)和5-CATTGCATTGCACGTCATCG-3(反向);胶原蛋白三世,5-ACTGGTGAACGTGGCTCTAA-3(向前)和5-AACCTGGAGGACCTGGATTG-3(反向);肿瘤坏死因子-α， 5-CTCATGCACCACCATCAAGG-3(向前)和5-ACCTGACCACTCTCCCTTTG-3(反向);il - 1β， 5-GAAGAAGAGCCCATCCTCTG-3(向前)和5-TCATCTCGGAGCCTGTAGTG-3（反面）；和GAPDH，5-TGCCCCCATGTTTGTGATG-3(向前)和5-TGTGGTCATGAGCCCTTCC-3(反向)。相对mRNA水平在未治疗的糖尿病组正常化。所有实验至少重复三次。

2.8.血脂谱和血糖分析

12周结束时，所有小鼠禁食过夜后处死，取血3000 rpm离心10 min。使用自动化系统测定血清葡萄糖、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)水平。

2.9。血清炎症细胞因子水平的测定

血清炎症因子(IL-6、IL-1)水平β和肿瘤坏死因子-α)采用市售ELISA试剂盒(分别为fu - x050、FU-X0840和FU-X1059)，试剂盒购自北京方成嘉红科技有限公司。如前所述收集血清。根据制造商的说明书制备了五种标准品的系列稀释剂。分别设置空白孔和样品孔。样品稀释剂(40μ五十） 添加到预涂ELISA板中的样品孔中，然后添加样品（10 μL)。用封板膜封板后，37℃孵育30 min。HRP-conjugated试剂(50μL)添加到除空白孔外的所有孔中。37℃孵育后，取出孔中的液体，用洗涤液清洗。显色剂溶液A (50μL)和显色原溶液B (50μL)加到每口井中。37℃黑暗孵育15分钟。空白孔视为零，加入终止液后15分钟内，在450nm处测量每孔的吸光度。

2.10。统计分析

采用SPSS 17.0进行统计学分析。数据以均数±标准差( ).单因素方差分析（ANOVA）用于组间均值比较，最小显著性差异（LSD）检验用于未治疗糖尿病组与其他组间的多重比较。 被认为具有统计学意义。采用GraphPad Prism 5.0软件进行图形表示。

3.结果

３．１．体重和血糖水平

与对照组相比，STZ导致血糖水平显著升高(14.8±2.2 vs 5.3±0.8 mmol/L， ）.12周灌胃结束时，与对照组相比，未处理的糖尿病小鼠出现严重的高血糖(23.4±6.4 vs 7.5±1.0 mmol/L， ）.200和400 mg/kg/d的GBE治疗可抑制血糖水平;但只有高剂量GBE组与未治疗组差异有统计学意义(18.8±6.5 mmol/L vs 23.4±6.4 mmol/L)。 ；GBE高剂量组与未治疗组，15.3±7.1 mmol/L与23.4±6.4 mmol/L， ）.

与对照组相比，糖尿病小鼠的体重显著减轻(22.37±11.67 vs 26.58±11.56 g， ）.体重减轻与高血糖和多尿有关。研究结束时，糖尿病治疗组小鼠体重显著低于对照组(30.01±1.35 vs 26.38±22.72 g)。 ）.阿托伐他汀和GBE治疗对糖尿病小鼠体重无影响。

3.2.银杏叶提取物对血脂和血糖的影响

处死小鼠前测定血脂和血糖水平。与对照组相比，未治疗糖尿病组LDL-c、TC、TG和血糖水平明显升高。阿托伐他汀和GBE(200和400 mg/kg/d)显著降低LDL-c、TC和TG水平( ,数据3(一个)- - - - - -3 (c)）.与未治疗的糖尿病组相比，200mg /kg/天GBE降低了血糖水平( ,图3 (e)）.对照组、未治疗糖尿病组、阿托伐他汀组、GBE低剂量组和GBE高剂量组之间的HDL-c水平无显著差异(图)3 (d)）.

３．３．GBE对血清炎症细胞因子水平的影响

血清炎症因子的水平，包括IL-6, IL-1β和肿瘤坏死因子-α，与对照组小鼠相比，糖尿病小鼠中明显增加。GBE(200和400 mg/kg/d)显著降低血清IL-1水平β肿瘤坏死因子-α和IL-6水平。此外，高剂量GBE (400 mg/kg/天)与低剂量GBE ( ,数据4(一)- - - - - -4 (c)）.

3．4．GBE对糖尿病心脏组织形态学的影响

与Ahmed等人的研究结果相似[19]， H&E染色示心肌弥漫性破坏，DCM呈碎片状、羽毛状外观。成纤维细胞和炎症细胞浸润未治疗的糖尿病心肌，而阿托伐他汀和GBE治疗减轻了它们的浸润(图)5(一个)）.此外，Masson染色显示，GBE处理使心脏总胶原含量钝化(图)5 (b)）.

免疫染色显示，与对照组相比，未经治疗的糖尿病小鼠中切割的caspase-3表达显著增加，而阿托伐他汀和GBE分别在200和400 mg/kg/天显著降低切割的caspase-3的表达( ,数据5 (c)和5 (d)）.低剂量与高剂量GBE差异无统计学意义。

3．5．GBE对I型和III型胶原mRNA水平的影响

未处理的糖尿病小鼠的I型和III型胶原mRNA水平升高。阿托伐他汀和GBE(200和400 mg/kg/天)治疗导致I型和III型胶原mRNA水平显著下降( ,数据6(一)和6 (b)）.低剂量与高剂量GBE无显著性差异。

3.6。GBE对心肌内炎症的影响

NF -κB在DCM发展过程中心肌内炎症的调节中起着至关重要的作用。未处理的糖尿病小鼠NF-表达增加κB.阿托伐他汀和GBE显著降低NF-的表达κB( ,数据7(一)和7 (b)）.肿瘤坏死因子-α和il - 1β未处理的糖尿病小鼠mRNA水平升高;然而，GBE 200和400 mg/kg/天的剂量显著抑制了stz诱导的TNF-的增加α和il - 1β信使rna水平( ,数据7 (c)和7 (d)).低剂量和高剂量GBE的结果之间的差异无统计学意义。

3.7。GBE对ers相关凋亡特征的影响

Western blot分析显示，与正常对照组相比，糖尿病小鼠心肌中ers相关凋亡标志物p-JNK、CHOP、caspase-12、cleaved caspase-3的表达明显增加。提示糖尿病心肌中p-JNK、CHOP和caspase-12级联反应被激活。阿托伐他汀和GBE(200和400 mg/kg/d)显著降低了p-JNK、CHOP、caspase-12和cleaved caspase-3的表达( ,数据8(一个)- - - - - -8（h））.低剂量与高剂量GBE无统计学差异。

4.讨论

糖尿病是一种世界性的代谢性疾病，其发病率和死亡率均较高。糖尿病患者患心血管疾病的风险很高，例如动脉粥样硬化和DCM，这是糖尿病的合并症[20.]．由于STZ对胰腺的毒性作用，常被用于在实验动物中诱发糖尿病β-细胞及其诱导氧化应激的潜力[21]．因此，在本研究中，我们建立了糖尿病心肌损伤ApoE^−−/STZ注射结合高脂饮食的小鼠模型，如前所述[22，23]．虽然GBE不能区分高脂血症和糖尿病引起的心肌损伤，但本研究旨在研究GBE是否减轻糖尿病心肌损伤中的载脂蛋白e^−−/为DCM合并动脉粥样硬化的糖尿病患者的治疗提供了潜在的依据。我们发现糖尿病小鼠中I和III型胶原mRNA表达升高。肿瘤坏死因子-α和il - 1β在糖尿病心脏中，由于NF-的增加，代表心肌内炎症的mRNA水平增加κB激活。此外，糖尿病心脏中ERS相关凋亡的标志物，包括p-JNK、CHOP、caspase-12和裂解的caspase-3上调。这表明间质胶原沉积、ERS相关凋亡和NF-κ糖尿病ApoE可诱导b介导的炎症反应^−−/老鼠。与以前的研究结果一致[15，16，19，24]，阿托伐他汀治疗可通过抑制NF-而改善心肌细胞的组织学异常、纤维化和凋亡κb诱导的炎症和切割caspase-3介导的糖尿病心脏凋亡。据我们所知，本研究首次表明中药GBE对糖尿病心肌损伤具有保护作用，特别是对细胞凋亡、心肌纤维化和NF-的保护作用κb通过抑制ers相关细胞凋亡介导炎症反应，p-JNK、caspase-12和cleaved caspase-3的表达降低证明了这一点。此外，GBE还能调节血脂和血糖水平。

高血糖引起的细胞死亡，包括坏死和凋亡，已被定义为糖尿病心肌损伤的重要病理生理特征之一[1]．心肌细胞丧失、心肌纤维化和炎症导致心肌重塑，导致心脏功能受损。与前人研究结果一致，本研究表明高血糖可触发心肌细胞凋亡。普遍定期审议是一个自适应的过程，以恢复正常的ER功能。然而，在高血糖条件下，过量和延长的UPR会诱导心肌细胞凋亡。三种促凋亡途径与ERS相关[4]．第一个凋亡通路涉及ire -1肿瘤坏死因子受体相关因子2- (TRAF2-)凋亡信号调节激酶1 (ASK1)复合物激活JNK。第二个凋亡途径是鼠类中的caspase-12通路。caspase-12在内质网膜的聚集可能是由激活的IRE-1和PERK招募TRAF2所致[25]活化的半胱氨酸蛋白酶-12从内质网转运到胞质溶胶，在胞质溶胶中分解前半胱氨酸蛋白酶9，随后激活下游效应子半胱氨酸蛋白酶-3。CHOP由IRE1、ATF6，尤其是PERK调节，是与内质网相关的第三条促凋亡途径。半胱氨酸蛋白酶-12和CHOP被认为是与内质网相关的特异性凋亡途径ERS[26]．本研究表明，未处理的糖尿病ApoE中与ERS相关的三个促凋亡通路均上调^−−/小鼠，伴有cleaved caspase-3 (caspase-12的效应器)的表达增加。我们的发现与Zhang等人的结果一致[4]who的研究表明，在STZ诱导的糖尿病大鼠中，caspase-12和CHOP的mRNA和蛋白水平均上调。总之，ERS在糖尿病心肌损伤中起着重要作用[27]．

早期由Fitzl等人进行的研究[28结果表明，标准GBE EGb761能减轻肌原纤维体积分数的降低。根据乔等人[17]， GBE可通过抑制线粒体释放细胞色素c和阻断caspase-3的激活来减轻缺血/再灌注诱导的心肌细胞凋亡。本研究发现，GBE下调了p-JNK、CHOP、caspase-12和cleaved caspase-3的表达，表明GBE通过减弱ERS具有抗凋亡作用。

据报道，IRE1αUPR的PERK通路可触发NF-κIKK磷酸化介导的b介导的炎症途径;此外，ATF6通路与NF-连接κB激活，提示UPR的三条途径可以激活这种炎症级联[5，6，29].核转录因子的核转位-κB导致下游促炎细胞因子的表达增加，包括IL-6, IL-1β和肿瘤坏死因子-α．il - 1β和肿瘤坏死因子-α进一步激活ERS(一个正循环)，导致更强的炎症反应、心肌间质纤维化和心肌细胞凋亡。肿瘤坏死因子-α促进活性氧(ROS)的产生及发炎[30.并介导JNK活化导致caspase-3活化和心肌细胞凋亡[14]因此，炎症也可诱发内质网[31)(图9）.在本研究中，通过Masson染色显示，GBE降低了I型和III型胶原mRNA水平和间质胶原沉积。TNF-的增加α和il - 1βGBE在200和400 mg/kg/d时抑制糖尿病心脏的mRNA水平。这与还原的NF-有关κB的表达。总的来说，我们的研究结果表明，GBE通过抑制炎症和ERS，以及其直接清除自由基的活性和抑制mPTP通道打开的能力，从而减轻间质纤维化[32]．虽然尚不能确定GBE是否直接减弱ERS或通过调节炎症作用，但可以肯定的是，GBE通过衰减ERS阻断了ERS和炎症的正回路(图)9）.

在本研究中，我们观察到GBE 200和400 mg/kg/d在研究期结束时降低了血糖水平。GBE 200 mg/kg/d可降低小鼠处死前的血糖水平;此外，GBE 400 mg/kg/d可降低血糖水平;但未达到统计学意义。Cheng等[9结果表明，GBE能恢复stz诱导的糖尿病大鼠肝脏和胰腺中SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶的活性。其他研究表明，GBE可以通过抑制胰腺炎症和IL-1等促炎细胞因子的表达来减轻stz诱导的小鼠胰腺损伤β肿瘤坏死因子-α，和IL-6[10，33]．血清IL-6、IL-1水平下降β和肿瘤坏死因子-α在我们的研究中发现，GBE治疗的降糖作用部分归因于炎症的抑制。

在本研究中，stz诱导糖尿病ApoE^−−/小鼠表现出严重的高脂血症，以血清LDL-c、TC和TG水平升高为特征，GBE可逆转这一情况，表明GBE可降低糖尿病患者的血脂水平。Zhang等[34]据报道，银杏叶提取物在大鼠体内表现出多方向的降脂作用，包括降低胆固醇吸收、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-COA）失活以及对必需多不饱和脂肪酸谱的有利调节。姚等人[35结果显示，GBE剂量48和96 mg/kg/d可使乙醇诱导的大鼠脂质异常正常。根据Cheng等人的研究[9，其降脂效果可能与胰岛素抵抗改善有关。

总之，GBE减轻了糖尿病心肌损伤，包括ApoE心肌细胞凋亡、间质纤维化和心肌内炎症^−−/糖尿病小鼠通过抑制ERS。有趣的是，在本研究中，GBE对糖尿病患者的心脏保护作用并不是剂量依赖性的，这可能是因为GBE在200-400 mg/kg/d剂量时，其抗炎和抗凋亡作用达到了一个平台期。

利益冲突

作者声明本文的发表不存在利益冲突。

作者的贡献

刘悦和吕树正共同构思课题，共同起草论文，为通讯作者。田金帆查阅文献，与刘燕飞共同撰写手稿。陈克基帮助起草了手稿。所有作者阅读并批准了最终的手稿。

致谢

作者非常感谢北京新星项目(no. 2)的资助。北京市自然科学基金(批准号:Z171100001117027)基金资助:国家科技支撑计划“十二五”重点项目(no. 7162170);北京心血管精准医学实验室(PXM2017_014226_000037)。

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