文摘
阿尔茨海默病(AD),最常见的神经退行性疾病,没有有效的治疗方法。Dauricine(道)、苄tetrahydroisoquinoline生物碱分离的根源Menispermum dauricum据报道,在脑缺血神经保护作用。在这里,我们调查的影响道N2a细胞稳定转染与瑞典突变淀粉样前体蛋白(N2a /应用),一个广告的细胞模型。ELISA和免疫印迹分析显示,道抑制应用处理和减少β积累。此外,通过PP2A道τhyperphosphorylation改善,p35/25, CDK5通路N2a / APP细胞。τhyperphosphorylation的改良道也验证在HEK293 /τ细胞,另一个与τhyperphosphorylation细胞系。蛋白质组学分析显示85个差异表达蛋白质的溶解产物之间的野生型N2a细胞(N2a / WT)和N2a /应用细胞道的存在与否;这些都是根据他们的功能分为6大类:内质网(ER)跟压力蛋白质,蛋白质氧化跟压力,细胞骨架蛋白,分子伴侣’线粒体呼吸代谢相关蛋白,信号蛋白。综上所述,我们证明了道治疗可以减少广告病理学,从而表明道在广告潜在的治疗效用。
1。介绍
阿尔茨海默病(AD)、进行性、不可逆的神经退行性疾病,导致个体发病率和死亡率和负担社会医疗体系1,2]。广告有复杂的神经病理特征,但神经原纤维缠结组成的异常磷酸化τ与神经炎的淀粉样变β(一个β)斑块特征的疾病。经批准的药物广告展示一致但温和的临床疗效3,4];相反,成百上千的试验与候选人广告药物终止,因为他们临床无效。延迟,药物可以预防或逆转疾病尚未被发现。
Bisbenzylisoquinolines形成类天然产物的治疗潜力神经退化(5]。Dauricine(道)是一个bisbenzylisoquinoline生物碱衍生物(图1(一))从根茎中提取的Menispermum dauricum直流,传统医学在中国药典上市。道的神经保护效应被广泛报道。道抑制细胞凋亡的瞬态局部脑缺血模型在一定程度上通过线粒体途径(6]。道皮质神经元免受缺血通过抑制细胞外钙的条目2 +和细胞内钙的释放2 +从内质网6]。道减少神经赤字,减少DNA碎片,bcl - 2表达,减少了伯灵顿表达式通过调制缺血性脑梗塞的bcl - 2家族蛋白(6]。道减毒τhyperphosphorylation通过促进血管舒缓激肽的释放,而提高细胞内神经元钙(7]。另一个bisbenzylisoquinoline生物碱,汉,据报道减弱空间记忆障碍和海马炎症抑制NF -κB激活广告诱导的大鼠模型β1-42(5]。然而,道的治疗潜力尚未评估在转基因模型的广告。
(一)
(b)
(c)
鉴于bisbenzylisoquinolines候选药物潜在的广告,我们对道的神经保护效应在小鼠神经母细胞瘤细胞系(N2a)稳定转染人类瑞典突变形式的淀粉样蛋白前体(应用)8]。通过使用这个研究细胞模型(9)过表达应用和hyperphosphorylatesτ,我们发现道不仅减毒τhyperphosphorylation水平也降低了β斑块的形成。伴随着这些变化,道改变了展开的蛋白质反应,线粒体功能,清除活性氧。
2。方法和材料
2.1。试剂
道(表示纯度≥98%)是购自上海阿拉丁生化科技有限公司(D115683 CAS: 524-17-4,上海,中国。道证实了高效液相色谱的纯度。道的原液(10毫米)准备在DMSO(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国),直接使用。在这项研究中使用的抗体是列在表中1。
2.2。细胞和细胞培养
野生型小鼠神经母细胞瘤细胞Neuro2a (N2a / WT)从细胞购买中国银行(代码:IFO50495、上海、中国)。瑞典N2a稳定转染细胞与人类应用突变(N2a /应用)和293年人类胚胎肾细胞稳定转染与τ蛋白(HEK293 /τ)礼物Jian-zhi王教授(中国武汉同济医学院)8- - - - - -10]。这些细胞被培养在以下媒介公司为5%2在37°C:最低基本培养基鹰(MEM)(美国纽约大岛屿)10%胎牛血清(美国纽约的边后卫,大岛)N2a / WT细胞;杜尔贝科修改鹰的介质(美国纽约DMEM,大岛)和10%的边后卫HEK293 /τ细胞;Opti-MEM DMEM培养基含有42%和50%,以8%的边后卫N2a /应用细胞作为补充。Geneticin (0.2 g / L)(美国纽约大岛屿)溶解在媒介选择转染N2a / APP和HEK293 /τ细胞。
2.3。细胞生存能力分析
亚文化之后,N2a /应用细胞悬液放在96孔细胞培养板。每个板包含104细胞在100年μL细胞培养基。后16 h公司5%2在37°C,媒介被删除,取而代之的是200年μL细胞培养基与道或车辆(0.5% DMSO)(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)。另一个24小时后5%的股份有限公司2在37°C,媒介提供了,取而代之的是100年μ与10 L细胞培养基μL细胞计数kit-8解决方案(Dojindo实验室、熊本、日本)和孵化1 h。板是由一个盘子的读者阅读(TECAN Group Ltd .)圣何塞、钙、美国)在450海里。细胞生存能力计算的吸光度与细胞和细胞培养基-与细胞培养基。相对细胞生存能力的可行性是细胞治疗规范化的可行性控制(车辆)。
2.4。ELISA的β1-40和一个β1-42
的ELISA试剂盒β1-40和一个β1-42(研发系统,明尼阿波利斯,美国)使用根据制造商的协议。N2a / WT和N2a /应用细胞治疗道或车辆在25厘米2培养瓶24 h(美国纽约大岛)。细胞和培养基分别收集。200年细胞细胞溶解μL IP缓冲区(Beyotime,北京)蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒(美国热费希尔科学,罗克福德,IL)在18000年冰20分钟和离心机在4°C 20分钟。结果上层清液是40倍稀释试验之前,和细胞培养基是直接使用。的标准曲线β1-40或者一个β1-42,和一个β1-40或者一个β1-42样本计算和规范化的总蛋白质含量决定与皮尔斯™BCA蛋白质分析工具包(美国热费希尔科学,罗克福德,IL)。
2.5。免疫印迹分析
与道或车辆24小时处理后,细胞在200年被收集和细胞溶解μL IP缓冲与蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒在14000年冰20分钟和离心机在4°C 20分钟。上层清液用于测定蛋白质含量和sds - page分离。每个样本的总蛋白质含量测定与皮尔斯BCA蛋白质化验设备。在装货前在sds - page凝胶,样本与皮尔斯混合车道标记减少样品缓冲(美国热费希尔科学,罗克福德,IL)和变性(煮10分钟)。sds - page(10 - 12%)凝胶用于分离目标蛋白质,然后转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(默克密理博有限公司,默克公司,达姆施塔特,蒙古包)。膜被封锁与脱脂奶粉溶解在TBS-Tween 20缓冲2 h,然后孵化主要抗体(稀释的抗体是列在表中1一夜之间)在4°C。膜清洗和孵化anti-mouse, anti-rabbit或抗体免疫球蛋白结合辣根过氧化物酶(合)(1:3000)在室温下为1 h之前发展(RT)。增强化学发光的解决方案(美国热费希尔科学,罗克福德,IL)的发展应用。的微滴被ImageQuant 1 d软件(GE量化。美国医疗、匹兹堡、PA)。
2.6。比较蛋白质组学
2.6.1。蛋白质的制备和标记
与道或车辆24小时处理后,细胞在500年被收集和细胞溶解μL DIGE-specific裂解缓冲(7 M尿素,2 M硫脲,30毫米Tris-HCl, 4%的皮套裤,pH值8.5)在冰上30分钟。超声破碎法(费舍尔550声波Dismembrator,宾夕法尼亚州匹兹堡,美国)应用于协助细胞lysation。样本离心机,享年20000岁60分钟。对于每一个样本,200μL(裂解缓冲添加到上层清液,然后混合超滤器在离心过滤器(美国默克密理博有限公司,Billerica的)除去盐。蛋白质溶液收集,和蛋白质浓度量化是用二维定量工具(美国通用电气医疗集团,芝加哥,IL)根据制造商的指导方针。
15蛋白质样本用于蛋白质组学研究和对于每一个治疗组,并为每组三个生物学重复进行。每个蛋白质样本稀释溶解缓冲区的最终浓度5μ克/μl .蛋白质溶液(5μL)贴上Cy3(通用电气医疗集团,25-8008-61)或Cy5染料(通用电气医疗集团,25-8008-62)在黑暗中30分钟。Cy2彩色汇集来自15个蛋白研究的内部标准样品。蛋白质的反应通过添加1标签就熄了μ10毫米的L赖氨酸(Sigma-Aldrich L5626)和三个样品贴上Cy2, Cy3, Cy5涨跌互现。补液的混合物就解决缓冲区(7 M尿素,2 M硫脲,2%的皮套裤,德勤2.8%,0.5%缓冲(pH 3-11 NL)组和0.002%溴酚蓝)450年第四卷μL之前转移到固定化pH梯度带。
2.6.2。二维电泳
第一条是水化然后isoelectric-focused (IEF) Ettan IPGphor等电点聚焦(IEF)系统(通用电气医疗集团)。能源论坛后合作,将被允许站在RT 10分钟。聚焦条立即平衡在15毫升减少平衡缓冲6 M尿素,30% ( 甘油,2% ( SDS, 75毫米Tris-HCl缓冲(pH值8.8)和1% ( )德勤(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)15分钟在RT摇床,随后reequilibrated在同一个缓冲区包含6 M尿素,75毫米Tris-HCl缓冲区(pH值8.8),30% ( 甘油,2% ( SDS和4.5% ( IAA (Sigma-Aldrich)。平衡条被加载在12.5% sds - page凝胶和覆盖0.5% ( )极低熔点琼脂糖封解决方案(25毫米三,192毫米甘氨酸,0.1% SDS, 0.5% ( 溴酚蓝)琼脂糖,0.02%)。蛋白质分离在第二维度雇佣一个Ettan DALTsix电泳系统(通用电气医疗集团)运行缓冲(25毫米三,192毫米甜菜碱,0.1% SDS, pH值8.3)12°C以下步骤:1 W /凝胶1 h,随后11 W /凝胶5 h在黑暗中。之后,凝胶是在台风三个变量的模式立即扫描成像仪(通用电气医疗集团)预扫描后在1000微米的分辨率来确定最优PMT电压为每个通道。图像采集是用100微米的分辨率。在凝胶来实现信号的变化,PMT将确保所有凝胶图像的最大像素强度保持在40000 - 60000范围内像素。
2.6.3。图像分析
分析了制造商的指令后,消化凝胶与DeCyder软件包(美国密尔沃基6.5版本通用电气医疗集团)。每个凝胶图像导入到软件,然后单独处理微分凝固态分析(DIA)和生物分析(BVA)模块来分析蛋白质斑点。每个蛋白质点的体积在Cy3或Cy5渠道规范化的体积相同Cy2位置。每个点的归一化体积比较在凝胶中复制组。差异表达蛋白质点( )入围识别。
2.6.4。凝固态胰蛋白酶的消化
1000年复制制备凝胶μ克N2a / WT和N2a /应用细胞蛋白质准备消化但是没有蛋白质标签。凝胶沉浸在染料(Coomassie蓝色溶液含有0.12%考马斯亮蓝g - 250、20%乙醇、10%磷酸和10%硫酸铵)。感兴趣的差异蛋白质斑点被Decyder软件分析手动切除的彩色凝胶。凝胶块在一夜之间使退色和消化37°C 0.01μ克/μL胰蛋白酶(美国WI Promega Corp .)所描述的罗宾逊et al。11]。胰蛋白酶的肽,被用于分析matrix-assisted激光解吸/电离飞行时间串联质谱(MALDI-TOF-MS / MS) (SCIEX TOF / TOF™5800系统,AB SCIEX弗雷明汉,妈,美国)。
2.6.5。质谱分析和数据库搜索
谱技术进行质量测量的力量Ultraflex三世MALDI-TOF / TOF质谱计(力量、Billerica的质量,美国)。对于每一个蛋白质样品,共计0.8μL肽提取用于MALDI-TOF-MS / MS分析,和肽提取与0.8共晶μL和10毫克/毫升α-cyano-4-hydroxycinnamic酸(CHCA) 0.1%的组织,50%乙腈(ACN)直接在目标上,和干在沿光谱外部校准。英国吉祥物(矩阵科学)是用于数据库搜索与SwissProt小鼠细胞蛋白质数据库。在执行搜索亩骶数据库,并进行质量测量的公差女士100 ppm的模式和Da 0.5 MS / MS模式。两个错过每肽被允许分裂。考虑到固定carbamidomethyl修改。蛋白质MW和π信息也被认为是评估蛋白质识别基于切除的位置点的二维凝胶。
2.6.6。免疫细胞化学
细胞种植在盖玻片在6-well板。后细胞附着在滑,他们对待道或车辆24 h。细胞在盖玻片固定在4%聚醛在RT 10分钟,permeabilized 0.3% Triton x - 100在PBS为30分钟,并与5% BSA PBST阻塞。阻塞后,盖玻片与anti-8-OHdG孵化(1:400)在一夜之间在4°C。洗后,盖玻片孵化与抗体IgG共轭合(1:200)(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国)在黑暗中1 h。盖玻片上的细胞被与DAPI染色(4′,6-diamidino-2-phenylindole) 5分钟和发达Fluo-Antifading介质(Beyotime,北京)。细胞被激光共焦显微镜检查。
2.6.7。生物信息学分析和统计数据
差异表达蛋白质的功能注释与数据库进行注释,可视化和综合发现资源(大卫,https://david.ncifcrf.gov)。基因本体论(去)的生物过程(BP),分子功能(MF)和图表和细胞组件(CC)得到默认统计参数。
结果表示为均值±SEM。单向方差分析是用来确定差异的统计学意义组和后Student-Newman-Keuls事后评估的方法(GraphPad Prism 7.0,http://www.graphpad.com/)。一个被认为具有统计显著性值小于0.05。
3所示。结果
3.1。道具有低细胞毒性N2a / WT和N2a /应用细胞
道是一个bisbenzylisoquinoline生物碱衍生物(图1(一))从根茎中提取的Menispermum dauricum直流,传统医学在中国药典上市。我们调查了道的细胞毒性N2a / WT和N2a /应用细胞使用的是一个24小时的细胞试验。CCK-8,水溶性四唑盐转化为水溶性甲瓒染料的活细胞线粒体是利用检查细胞生存能力。无显著抑制细胞生存能力在N2a / WT细胞接受不到20μ米道而vehicle-treated细胞(图1 (b))。我们没有观察到明显的减少细胞生存能力当N2a /应用细胞治疗10μ米到20μ米道(图1 (c))。因此,我们得出的结论是,没有明显的细胞毒性引起的24小时治疗道甚至在20的浓度μ米,道的最大浓度用于以下研究。
3.2。道抑制和一个应用程序处理β积累在N2a /应用细胞
然后我们调查了上道的影响β代与ELISA。的水平β1-42有毒的碎片明显高于N2a /应用细胞溶解产物(2538 pg / mL和646.5 pg / mL, )相比N2a / WT细胞溶解产物,和一个β1-42水平N2a /应用细胞治疗20μ米道低三倍(909.6 pg / mL和2538 pg / mL, )(图2(一个))。的平均水平β1-42在N2a /应用细胞培养基也高于N2a / WT细胞(89.21 pg / mL和48.71 pg / mL, )(图2 (b))。相反,没有无毒的淀粉样蛋白水平的显著差异β1-40在细胞溶解产物(278.5 pg / mL和270.8 pg / mL, )(图2 (c))或细胞培养基(18.26 pg / mL和13.58 pg / mL, )N2a / WT或N2a /应用细胞(图2 (d))。的比率β1-42/一个β1-40N2a /应用细胞溶解产物的3倍高于N2a / WT细胞(9.05和2.41, 观察),相对减少的比率β1-42/一个β1-40在N2a /应用细胞治疗20μ米道溶解产物与细胞的溶解产物处理车辆(3.54和9.05, )(图2 (e))。一个图的比例β1-42/一个β1-40(图2 (f))显示了一个类似的趋势,但两组之间没有差别。
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(d)
(e)
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(g)
(h)
道程序处理的影响进一步研究通过免疫印迹分析。N2a / APP细胞明显更高层次的磷酸化(淀粉样前体蛋白)应用和presenilin 1 (PS1)比N2a / WT细胞(数字2 (g)和2 (h))。的平均水平β分泌酶(BACE1)和不溶性β-secretase-cleaved淀粉样前体蛋白(酸式焦磷酸钠β)也被高N2a / APP细胞相比N2a / WT细胞。DAU-treated N2a / APP细胞显著减少的表达总应用,磷酸化的应用,BACE1。DAU-treated N2a /应用细胞也表现出酸式焦磷酸钠的平均水平降低β和PS1,而平均水平α-secretase-cleaved淀粉样前体蛋白(酸式焦磷酸钠α高)。DAU-induced改变应用程序处理似乎与变化β通过ELISA水平化验。
3.3。道减毒τ病理学通过PP2A和p35/25 N2a /应用细胞和HEK293 /τ
我们接下来用免疫印迹分析探讨影响道的τN2a /应用细胞的病理。Vehicle-treated N2a / APP细胞显著增加τ磷酸化丝氨酸396比N2a / WT细胞(数字3(一个)和3 (b))。在丝氨酸磷酸化τ的平均水平404年,262年丝氨酸,苏氨酸231网站高N2a / APP细胞N2a / WT细胞相比,当脱去磷酸τ(Tau-1)的平均水平低N2a / APP细胞与τ磷酸化丝氨酸396相比,404年丝氨酸,苏氨酸231网站。在丝氨酸磷酸化τ的水平,404年231年396年丝氨酸,苏氨酸显著降低在DAU-treated N2a / APP细胞相比vehicle-treated N2a / APP细胞。262年的平均水平在丝氨酸磷酸化τ减少DAU-treated N2a / APP细胞相比vehicle-treated N2a / APP细胞,同时意味着Tau-1增加水平DAU-treated N2a / APP细胞与vehicle-treated N2a / APP细胞。验证的结果N2a / WT和N2a /应用细胞,我们检查了道的影响治疗τHEK293 /τ的磷酸化细胞过表达τ。如数据所示3 (c)和3 (d),我们观察到类似的削减τ磷酸化(丝氨酸396、404丝氨酸和苏氨酸231)和类似Tau-1水平的增强。道没有改变总tau蛋白的表达。
(一)
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(c)
(d)
虽然τ的磷酸化可以源自许多催化激酶和磷酸酶的作用[12),我们调查DAU-induced变化在那些τ磷酸化途径证明是关键,即糖原合成酶激酶3β(GSK-3β),蛋白质phosphatase2A (PP2A), p35/25通路。道治疗降低了意味着磷酸化水平的糖原合成酶激酶3α(GSK-3α)和GSK-3βN2a /应用细胞超过N2a / WT(数字4(一)&4 (b))。的意思是磷酸化状态PP2A和p35/25的水平和细胞周期蛋白依赖性激酶5 (CDK5)增强N2a /应用细胞与N2a / WT相比。道GSK-3增强治疗的平均水平α和βN2a /应用细胞与vehicle-treated N2a / APP细胞。更重要的是,20μ米道显著降低PP2A和p35/25水平的磷酸化和CDK5 N2a /应用细胞与vehicle-treated N2a / APP细胞。补充验证,磷酸化PP2A和水平的p35/25 CDK5 HEK293 /τ细胞被道同样调制治疗。因此,道可以改善通过PP2Aτ病理学,p35/25,,而不是GSK-3 CDK5β。
(一)
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3.4。道改性蛋白质涉及氧化应激、线粒体功能,N2a /应用细胞ER应激
探索分子物种受到道治疗的影响,我们进行了一个比较蛋白质组学分析使用2 d-dige分离和鉴定女士。共有85个蛋白质2 d-dige凝胶明显不同于任何四个比较双(N2a /应用程序与N2a / WT, 1.25μ米道与N2a /应用程序,5μ米道与N2a /应用程序,或20μ米道与N2a /应用)(如图5)。六类蛋白质被道影响治疗:内质网(ER)跟压力蛋白质,蛋白质氧化跟压力,cytoskeleton-associated蛋白,分子伴侣’线粒体呼吸、蛋白质和代谢信号。此外,我们发现一些常见的蛋白质差异表达四个对比组(图S1A和表S1-4)。这些差异蛋白质包括信号蛋白高机动组蛋白B1 (HMGB1)神经突退化的中介通过病理的识别信号通路在广告13];分子伴侣’(热休克蛋白质同源71 kDa (HSP7C)),分子伴侣和热休克蛋白家族的一员,在应激反应中扮演不可或缺的角色14];翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)中的关键角色防御氧化和热应力15(如表所示S1);内质网(ER)跟压力蛋白质(蛋白质disulfide-isomerase A6 (PDIA6)), ER应激相关蛋白,在大多数生物过程中起着至关重要的作用16];氧化跟压力蛋白(D-3-phosphoglycerate脱氢酶(血清)),参与蛋白质代谢和中枢神经系统的发展17];cytoskeleton-associated蛋白(peripherin(妖精)),一个类型III中间丝状体(如果)蛋白质发挥贡献的作用在运动神经元病(18,19];分子伴侣(stress-induced-phosphoprotein 1 (STIP1)),媒介Hsp70 cochaperone一半寿命/交换客户参与朊病毒蛋白质和protein-mediated神经元信号(20.(如表所示S2);和cytoskeleton-associated蛋白质(tpi)(表所示S3)。我们发现两种蛋白质,即异柠檬酸脱氢酶(辅酶ii)细胞质(IDHC),在能源和生物合成代谢起重要作用[21)和真核翻译起始因子1 b (EIF1B),一种保护细胞凋亡蛋白独特的从Fas-induced细胞凋亡22),一般是各浓度的改变DAU-treated N2a / APP细胞相比vehicle-treated N2a / APP细胞(如图印地和表S8)。此外,一些常见的蛋白质差异表达三个DAU-treated组(如图印地和表S5-6);其中包括ER跟压力蛋白(远上游元件结合蛋白1 (FUBP1)),多功能DNA和rna结合蛋白(23];线粒体呼吸和新陈代谢(IDHC)(5细胞色素氧化酶亚基,线粒体(COX5A)),一个电子传递链——(等)相关的蛋白质(如表所示S5);ER跟压力的蛋白质(78 kDa glucose-regulated蛋白质(GRP78),压力- 70蛋白,和线粒体蛋白质(GRP75));分子伴侣’(热休克蛋白HSP 90 -β(HSP90B)),基本分子伴侣参与信号转导、细胞周期控制、压力管理、折叠、退化、运输的蛋白质(24];nucleophosmin (NMP),一个关键的角色激活自噬引起核仁的中断(25)、线粒体呼吸和新陈代谢(IDHC)(见表S6);ER跟压力的蛋白质(蛋白质disulfide-isomerase A3 (PDIA3)),主要参与ER应激(ERS)的规定和保护神经元免受ERS-induced细胞凋亡26];和线粒体呼吸和新陈代谢(IDHC)(见表S7)。
细胞的差异表达蛋白质DAU-treated N2a / APP和vehicle-treated N2a大卫/应用细胞特征分析和使用。在vehicle-treated N2a / APP细胞,DAVID-defined差异表达蛋白质的生物功能的主要集群是“蛋白质折叠,”“积极的催化活性调节,”和“细胞氧化还原体内平衡”(图6(一)),DAVID-defined蛋白质功能包括“保利(A) RNA绑定”“ATP绑定,”和“酶绑定”(图6 (b))。大卫认为DAU-affected细胞车厢“光滑的呃,”“信息附着结”,和“呃腔”(图6 (c))。相比之下,大卫的结果DAU-treated N2a / APP细胞是不同的:差异表达蛋白质的主要群体是“应对压力,”“ATP代谢过程,”和“蛋白质折叠,”根据蛋白质的生物过程(图分类6 (d));“保利(A) RNA结合”、“RNA绑定,“和”展开的蛋白质绑定,“当分类根据蛋白质的分子功能(图6 (e));和“细胞外外来体”,“黑素体,”和“线粒体”分类根据蛋白质的细胞组件(图6 (f))。
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补充和验证蛋白质组学分析的结果,我们用免疫印迹分析调查的表达peroxiredoxin-4 (PRDX4酶类家族中的一员,调节氧化还原状态的ER)(图7 (b),图S5A,B,C);disulfide-isomerase (PDIA1 PDI家族中的一员,调节氧化还原状态的ER)(图7 (c),图S4A,B,C);GRP75线粒体女伴,调节mitochondria-associated ER膜(图7 (d),图S3A,B,C);78 kDa glucose-regulated蛋白(GRP78,一个伴侣结合压力传感器)(图7 (e),图S2A,B,C,D);HMGB1(图8(一个),图S6A,B,C),一个中介通过识别神经变性的病理信号通路的广告;和14-3-3蛋白质ζ/δ(14-3-3-z女伴涉及线粒体呼吸)(图8 (b),图S7A,B,C)。PRDX4 N2a /应用细胞的平均水平明显高于N2a / WT细胞,和PRDX4的平均水平是减少DAU-treated N2a / APP细胞。PDIA1 N2a /应用细胞的平均水平明显高于N2a / WT细胞和减少DAU-treated N2a / APP细胞。类似的趋势观察GRP75, GRP78, HMGB1。相反的趋势是14-3-3-z观察。
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3.5。道减少氧化应激和ER应激N2a /应用细胞
鉴于氧化应激的调制和ER应激相关蛋白通过道,我们调查了道对活性氧(ROS)的影响和展开的蛋白质反应(UPR)。如图7(一),8-oxo-2的染色脱氧鸟苷(8-OHdG)、活性氧(ROS)的一个指标,在N2a /应用细胞明显高于N2a / WT细胞。N2a /应用细胞治疗与道三个浓度显示显著减少8-OHdG染色的价格相比vehicle-treated N2a / APP细胞。我们也调查了大部分涉及UPR标记的蛋白质表达,如GRP75(图7 (d)),GRP78(图7 (e)),磷酸化胰腺ER eIF2α激酶(p-PERK)(图7 (f)),磷酸化真核起始因子2α(p-eIF2 -α)、真核翻译起始因子2单元(eIF2α)(图7 (g)),激活转录4 (ATF-4)(图7 (h))和转录因子C / EBP同源蛋白质(切)(图7(我))。活跃和eIF2的磷酸化α明显高于N2a /应用细胞与N2a / WT细胞相比,和这些磷酸化蛋白显著减少DAU-treated N2a / APP细胞与vehicle-treated N2a / APP细胞。此外,GRP75的平均水平,GRP78, ATF-4,和切高N2a / APP细胞与N2a / WT细胞相比,和这些蛋白质的平均水平减少DAU-treated N2a / APP细胞与vehicle-treated N2a / APP细胞。
4所示。讨论
神经钙稳态失调的广告的发展中扮演着重要的角色,因此是一个潜在的治疗目标治疗这种疾病(27]。道已经报告给抑制细胞大量细胞外的Ca2 +并限制Ca的内质的版本2 +在不同的模型(28,29日]。干扰钙信号可能导致ER应激和激活UPR [30.]。实验显示道调节钙稳态的能力执行支持声称道促进神经细胞生存(6Ca)和纠正2 +在肌肉细胞介导的心律失常31日]。在目前的研究中,道压制和一个应用程序处理β生产的细胞模型。道减毒τ病理学N2a /应用细胞通过PP2A和p35/25通路;这是一个以前的报告符合道的影响在bradykinin-treated N2a细胞,这表明道阻止bradykinin-induced变更N2a细胞钙稳态和τhyperphosphorylation [7]。道也显著改变85的表达蛋白质与氧化应激有关,线粒体功能和新陈代谢,UPR和细胞骨架。
4.1。氧化应激
氧化应激相关蛋白是一类蛋白质被道改变治疗。氧化应激是由钙涌入的结果N-methyl-D-aspartate受体在AD病理32,33]。我们的蛋白质组学分析表明,一些细胞氧化应激相关蛋白在N2a /应用摄动和N2a / WT细胞。尽管蛋白质微扰并不一定与功能蛋白质的损失,我们发现DAU-treated N2a / APP细胞保留的表达peroxiredoxin-2 (PRDX2) PRDX4,血清中看到N2a / WT细胞(图5)。另外,我们观察到的水平8-OHdG在DAU-treated细胞的三组被压抑了,但和8-OHdG 5的水平μM DAU-treated细胞一样N2a / WT细胞(如图7(一))。这意味着道抑制氧化应激,这与先前的报道是一致的的抗氧化活动道(34]。道的抗氧化作用也可能由于其抑制Ca2 +涌入(7]。
4.2。线粒体蛋白质
线粒体功能障碍与氧化应激密切相关病理衰老和广告(35),和线粒体蛋白质形成另一个集群的蛋白质被道治疗。在这项研究中,我们观察到抑制ATP合酶亚基三角洲,线粒体(ATPD) COX5A, dihydrolipoyllysine-residue乙酰转移酶组成部分p (ODP2)和增强醛脱氢酶、线粒体(ALDH2)、ATP合酶亚基啊,线粒体(ATPO),电子转移黄素蛋白亚基α,线粒体(ETFA) IDHC,和过渡内质网腺苷三磷酸酶(拉)N2a / APP细胞,而蛋白质表达ACON, ATPD, COX5A, ETFA, IDHC, ODP2保留在DAU-treated细胞。这个观察报告可能与道增强线粒体atp酶的活性在脑缺血小鼠模型(36];然而,更多的功能分析,如线粒体ATP酶的ATP水平和活动,在未来研究中应包括验证这种相关性。道对线粒体功能的影响可能与钙稳态的调制这异喹啉生物碱。
4.3。展开的蛋白质反应
展开的蛋白质反应(UPR),一个ER应激反应的干扰蛋白质折叠,是与神经退行性疾病(37),包括积累τ发起UPR的可能性(37]。UPR-related蛋白质形成最大的一类蛋白质由道调制治疗。在蛋白质组学研究中,我们发现calreticulin (CALR)和Ca2 +/ calmodulin-dependent蛋白质磷酸酶有较高表达DAU-treated N2a / APP细胞与vehicle-treated N2a / APP细胞,表明钙止血被儿媳调制功能的研究中,我们发现ER应激标记(图7)增强在DAU-treated N2a /应用细胞和抑制细胞。钙稳态也至关重要的ER和线粒体的功能有以下原因:(1)2 +主要是存储在Ca的ER和流入2 +从ER线粒体可以引发的ER应激(38),和(2)钙损耗在急诊室被认为启动慢性Ca2 +过载的线粒体和bcl - 2相关的细胞凋亡39]道抑制ER应激可能与道调制钙稳态。
虽然我们分类DAU-modulated蛋白质氧化压力,压力,和线粒体功能障碍,密集的研究揭示出这些过程是密切相关的。ER的氧化环境由二硫键的形成和维持谷胱甘肽的浓度,两者都是由PDI和酶类的家庭(40,41]。不平衡的氧化还原状态或氧化应激导致ER应激和激活了UPR [30.]。在UPR三类ER压力传感器(即ATF6、活跃和IRE1),以及sensor-bound监护人(即。GRP78)被激活(42- - - - - -44]。UPR也导致ER应激反应基因(44和proapoptotic转录因子就像砍43]。在广告中,A的积累β和hyperphosphorylationτ增加活性氧的生产,从而导致进步的线粒体损伤和ER应激通过Ca的干扰2 +体内平衡(45,46]。虽然我们没有监控Ca2 +流N2a /应用细胞,我们调查的大多数提到的蛋白质的水平,这暗示Ca的结果2 +体内平衡可能干扰N2a / APP细胞。更详细的研究需要照亮道改善线粒体功能障碍的机制,ER应激和氧化应激调节钙稳态。道治疗也修改蛋白质在其他类别,包括细胞骨架蛋白分子伴侣蛋白,和信号。进一步调查这些蛋白质的功能可能照亮道的新颖的药理作用。
4.4。毒性
道需要解决的潜在毒性。道称的毒理学研究甲基异喹啉生物碱是醌biotransformed中间CYP3A家族蛋白质,和积累的中间可以耗尽谷胱甘肽(GSH)和诱导细胞凋亡47,48]。除此之外,部分1、2、3,4-tetrahydroisoquinolines声称是温和的复杂我活动和线粒体呼吸抑制剂49]。然而,N2a / APP细胞可以容忍超过20μ米道没有重大损失的细胞生存能力(图1 (c)),N2a / APP细胞似乎容忍道浓度高于N2a / WT细胞(我们观察到显著的生存能力损失N2a / WT细胞处理> 10μ米道)(图1 (b))。进一步调查CYP家族蛋白的表达在N2a /应用细胞是必要的理解明显道N2a公差/ APP细胞。然而,更重要的是,是,道是保护当N2a /应用细胞治疗浓度低至1.25μ米,在这一集中,潜在的有毒道可能是边际。在以后的临床前研究道,剂量应选用谨慎地避免不良事件,包括谷胱甘肽和线粒体的变化复杂的状态。
总之,我们发现道治疗减毒hyperphosphorylationτ和生产的βN2a /应用细胞。道也减少了分子赤字N2a / APP细胞,如涉及氧化应激、ER应激信号蛋白,分子伴侣’(总结在图9)。尽管N2a /应用细胞容忍更高浓度的道,我们建议关注最低有效浓度和剂量的道,以避免不良事件在细胞培养和动物实验,分别。
缩写
| 广告: | 阿尔茨海默病 |
| 道: | Dauricine |
| 2 d-dige: | 二维荧光差异凝胶电泳 |
| 应用: | 淀粉样前体蛋白 |
| 酸式焦磷酸钠β: | β-Secretase-cleaved淀粉样前体蛋白 |
| 酸式焦磷酸钠α: | α-Secretase-cleaved淀粉样前体蛋白 |
| BACE1: | β网站应用裂开酶1 |
| GSK-3α: | 糖原合成酶激酶3α |
| GSK-3β: | 糖原合成酶激酶3β |
| CDK5: | 细胞周期蛋白依赖性激酶5 |
| N2a / WT: | 野生型小鼠神经母细胞瘤 |
| N2a /程序: | 小鼠神经母细胞瘤细胞N2a稳定转染与瑞典淀粉样前体蛋白的突变体 |
| PP2A: | 蛋白质phosphatase2A |
| HEK293 /τ: | 293年人类胚胎肾细胞与tau蛋白的稳定性 |
| ER压力: | 内质网应激 |
| 一个β1-42: | 淀粉样蛋白-β1-42 |
| 一个β1-40: | 淀粉样蛋白-β1-40 |
| 走: | 基因本体论 |
| 英国石油公司: | 生物过程 |
| MF: | 分子功能 |
| 答: | 蜂窝组件 |
| PS1: | Presenilin 1 |
| HMGB1: | 高机动组蛋白B1 |
| HSP7C: | 热休克蛋白质同源71 kDa |
| TCTP: | 翻译控制肿瘤蛋白 |
| PDIA6: | 蛋白质disulfide-isomerase A6 |
| 血清: | D-3-Phosphoglycerate脱氢酶 |
| 仙女: | Peripherin |
| STIP1: | 应激磷蛋白质1 |
| IDHC: | 异柠檬酸脱氢酶(辅酶ii)胞质 |
| EIF1B: | 真核翻译起始因子1 b |
| FUBP1: | 目前上游元件结合蛋白1 |
| COX5A: | 线粒体细胞色素c氧化酶亚基5 |
| GRP78: | 78 kDa glucose-regulated蛋白质 |
| GRP75: | 压力- 70蛋白、线粒体蛋白质 |
| HSP90B: | 热休克蛋白HSP90-beta |
| NMP: | Nucleophosmin |
| PDIA3: | 蛋白质disulfide-isomerase A3 |
| PRDX4: | Peroxiredoxin-4 |
| PDIA1: | Disulfide-isomerase |
| 14-3-3-z: | 14-3-3蛋白ζ/δ |
| ROS: | 活性氧 |
| UPR: | 展开的蛋白质反应 |
| 8-OHdG: | 8-Oxo-2脱氧鸟苷 |
| ATF-4: | 激活转录4 |
| 切: | 转录因子C / EBP同源蛋白质 |
| p-eIF2α: | 磷酸化真核起始因子2α |
| p-PERK: | 胰腺ER eIF2α激酶 |
| UPR: | 展开的蛋白质反应 |
| PRDX2: | Peroxiredoxin-2 |
| ATPD: | 线粒体ATP合酶亚基三角洲 |
| ODP2: | p Dihydrolipoyllysine-residue乙酰转移酶的组成部分 |
| ALDH2: | 醛脱氢酶、线粒体 |
| ATPO: | 线粒体ATP合酶亚基啊 |
| ETFA: | 电子转移黄素蛋白亚基α,线粒体 |
| 拉: | 过渡内质网腺苷三磷酸酶。 |
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突的披露。
作者的贡献
锅,小陈,Haizhe周贡献同样这项工作。
确认
这项工作是由中国国家自然科学基金(81673134,81673134),广东省自然科学基金(2014 a030313715 2016 a030313051)、广东省科技计划(Xifei杨),深圳战略性新兴产业发展专项资金项目(JCYJ20160428143433768、JCYJ20150529164656093 JCYJ20150529153646078, JCYJ20160422143433757,和JCYJ20150529112551484),医学和三明项目在深圳(SZSM201611090)。
补充材料
图S1:常见的不同对比组中差异表达的蛋白质。图S2-S7: MALDI-TOF-MS GRP78地图(图S2), GRP75(图S3), PDIA1(图S4), PRDX4(图S5), HMGB1(图S6),和14-3-3-z(图七)。表S1-S8:列出常见的不同对比组中差异表达的蛋白质。(补充材料)