文摘

本研究旨在评估的保护作用枸杞europaeum甲醇提取物(LEM)对顺铂引起的肝脏和肾脏损伤。植物化学的成分、抗氧化活性、肝肾损伤生物标志物。结果显示,LEM表现出显著的抗氧化活性在体外对DPPH自由基和H2O2清除化验。登月舱在动物研究中,治疗显著降低顺铂中毒的影响血清肝生物标志物和血清肾生物标志物。与此同时,LEM减少明显的顺铂对脂质过氧化水平的影响肝脏和肾脏组织。抗氧化酶的活动(减少谷胱甘肽,谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶)被增加组使用LEM和槲皮素。此外,肝脏和肾脏的正常组织学结构与登月舱在治疗后恢复。这清楚地表明,工作l . europaeum可能是有用的作为药物hepato-nephroprotective潜力。

1。介绍

枸杞茄科家族的成员,包括70种分布在温带和亚热带地区。枸杞在许多国家的传统医学引用。在突尼斯,干水果l . intricatum传统上用于保护从眼疾1]。在中国,l .摘要和l . barbarum用于长寿、不孕和头痛(2]。的花枸杞shawii被用作治疗糖尿病药(3)和叶子是用来防止胃疼;此外,注入从根源可以治疗溃疡和背部疼痛。此外,一些研究报道,从这个属植物表现出许多药理性能如抗衰老和神经保护作用[4,5[],王亚南活动6,抗肿瘤和免疫调节活动(7]。属的植物化学的研究表明,多糖广泛分布在水果(8,9]。此外,大量的显示工作枸杞富含酚酸、类胡萝卜素、单宁、黄酮、矿物质和维生素(9,10]。l . europaeum灌木散布在地中海地区(11,12]。在民间医学,这种植物的地上部分是用于治疗皮肤发炎。很少的研究l . europaeum进行了水果。发现获得80%的乙醇提取证明cytoprotective效应对人类肺癌和大鼠肾上腺髓质肿瘤细胞(13]。这些活动在本质上是与自由基清除能力,因为这已经证明在许多作品(13,14]。此外,水果提取物l . europaeum特点是类黄酮含量高、花青素、类胡萝卜素、番茄红素、丹宁酸13];这些选民表示潜在的生物活性。在先前的研究中,我们已经证明了l . europaeum叶提取物CCl antinociceptive和保护作用4全身的小鼠的肝脏和肾脏损伤(15]。在这项研究中,叶子的植物化学的成分l . europaeum甲醇提取物(LEM)评估。的抗氧化活性在体外和hepato-nephroprotective这种植物的影响也被研究。

2。材料和方法

2.1。化学物质

顺铂(cis-dichlorodiammine铂(II))、槲皮素、丁羟甲苯(二叔丁基对甲酚)、二甲亚砜(DMSO)、过氧化氢(H2O2),2-thiobarbituric酸、三氯乙酸、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)和2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH)从Sigma-Aldrich有限公司购买(σ,圣路易斯,美国)。标准(铁(Fe)、锌(锌),钙(Ca),钾(K)、(毫克),镁锰(Mn) cuivre(铜)和钠(Na))是来自默克(达姆施塔特,德国)。超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)测定包被从草毒死购买实验室有限公司甲醇从PanReac购买(西班牙巴塞罗那)。所有其他化学物质和溶剂均为分析纯,获得Sigma-Aldrich(σ,圣路易斯,美国)。

2.2。植物提取的材料和制备

的叶子枸杞europaeum从Redeyef采样(纬度:34°38 3 N,经度:8°18 03 E,高度:623米),西南突尼斯,2016年1月,把植物标本的科学教师,大学,加夫萨矿区的突尼斯。叶子(450克)在室温下用蒸馏水洗净,干(大约20%相对湿度和温度24°C) 48 h。然后样本地细粉使用搅拌机(Moulinex、法国)和24 h和甲醇提取三次为室温磁搅拌。使用1号绘画纸滤纸过滤后,溶剂完全蒸发真空在40°C下使用Buchi旋转蒸发器,获得干燥提取物(LEM)。登月舱的植物化学的成分包括咖啡酸、没食子酸、儿茶素、表儿茶素,芹黄素,香豆酸,毛地黄黄酮,柚苷配基、香草酸、芦丁、槲皮素和山柰酚(15]。

2.3。矿物成分

矿产资源评价根据Kachiguma描述的方法等。16)与少量修改,用原子吸收分光光度计(AAS)系列(泽尼特)。校准曲线建立了使用标准的股票的解决方案的1000 mg / L稀释不同浓度的标准工作,选择和校准范围根据预期的浓度感兴趣的元素。标准、空白和样品的解决方案然后读AAS以下波长:248.2纳米铁、766.5 nm钾、镁285.2,257.2纳米锰、317.9 nm钙、327.3 nm铜、589.5 nm钠、锌和213.2海里。

2.4。测定脂溶性色素

脂溶性色素估计使用亚嫩河的方法(17]。干叶提取物(100毫克)与acetone-hexane提取解决方案(4:6)。滤液的吸光度测量使用紫外可见分光光度计在400 - 700海里。

叶绿素含量通过以下公式计算,然后表示为μg / g(干重:

2.5。过氧化氢(H2O2)清除活动

的影响l . europaeum提取在清除H2O2确定了基于鲁赫描述的协议等。18)做了一些调整。简单地说,1.6毫升的磷酸盐缓冲剂的混合物(0.1米,pH值7.4)和H2O2解决方案(0.4毫升,40毫米)加入1毫升的LEM用不同浓度(10年,20年,30、50、100和150μg / mL)。管涡,在室温下孵化了10分钟。二叔丁基对甲酚作为比较的标准。吸光度测量230海里。

2.6。DPPH自由基清除活性

提取物对DPPH自由基的影响确定方法报道后Bounatirou et al。19]。提取足够的解决方案(5、10、20、30、50、80和100μg / mL)准备获得最后一卷1毫升和混合2毫升的刚做好的DPPH的解决方案(0.1毫米,在甲醇)。经过30分钟的在黑暗中孵化,吸光度测定紫外可见分光光度计在517海里。集成电路50值(量的样本提供50%的清除DPPH)决心从线性回归方程获得样品的浓度和抑制的百分比。

2.7。抗氧化活性的登月舱在活的有机体内
2.7.1。实验动物

男性瑞士老鼠,大约20 - 24 g体重(bw),随着年龄的增长约7周得到从中央药房(突尼斯),维持两周的适应时期。动物是美联储15%的蛋白质食物颗粒(系统网络体系结构(SNA)、斯法克斯、突尼斯)和自来水随意根据突尼斯守则,关心动物保健和使用用于科学目的和欧洲公约保护脊椎动物用于实验和其他科学(欧洲委员会123号,斯特拉斯堡,1985)。

2.7.2。治疗

动物( 被分成五组,每组6只老鼠。肝肾毒性就可以诱导小鼠腹腔内注射顺铂的溶解在玉米油13毫克的剂量每公斤体重(bw) [20.]。治疗然后进行如下:集团(我)控制。玉米油是口服药物(订单)为10天。组(2)登月舱,150毫克/公斤体重(15]。动物治疗10天登月舱与溶解在玉米油以每公斤150毫克剂量订单。组(3)顺铂。玉米油为10天,口服单剂量腹腔内(i.p)顺铂(13毫克/公斤,i.p。)管理的第五天。集团(IV)登月舱+顺铂。老鼠接受LEM bw剂量(150毫克/公斤订单。)口服10天,单剂量顺铂(13毫克/公斤,i.p。)溶解在玉米油是管理的第五天,1 h后LEM剂量。集团(V)槲皮素+顺铂。动物服用槲皮素溶解在DMSO溶液(0.5%v/v)以每公斤50毫克剂量订单。21)口服10天,单剂量顺铂(13毫克/公斤,i.p。) 5天,1 h后槲皮素的剂量。

所有的动物都被斩首后24小时持续治疗。血液样本收集到肝素化或EDTA管把漏斗颈下的小鼠后颈斩首,以避免压力。血液在1500转离心10分钟为了获得血清生化分析。肾脏和肝脏被立即删除,重器官重量比计算。

2.7.3。血清生化分析

血清肝生物标志物(丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH))从Biomaghreb化验使用商业试剂盒(突尼斯)。肾损伤的生化标记(尿素、肌酐、尿酸、血尿素氮(BUN)测定)估计使用商业试剂盒(Sigma-Aldrich)根据制造商的协议。

第2.7.4。组织匀浆的制备

大约1 g的每个器官都切成小块,沉浸到一个2毫升冰冷的溶解缓冲区(tris-buffered盐水,pH值7.4)使用Ultra-Turrax均质器15分钟,然后过滤和离心(9000 rpm, 30分钟,4°C)。上层清液储存在−80°C到使用。

2.7.5。蛋白质定量的肝脏和肾脏

蛋白质含量匀浆测定使用Folin反应通过洛瑞的方法等。22)使用牛血清白蛋白作为标准在660海里。

2.7.6。脂质过氧化水平的评价

估计脂质过氧化的程度,100年μL的匀浆是添加到100年μL(三氯乙酸(TCA, 5%)和混合物在4000×离心机 10分钟。100年之后,μ上层清液和200 LμL(硫代巴比土酸试剂(稍后通知,0.67%)孵化15分钟在沸水浴。脂质过氧化水平测定硫代巴比土酸活性物质(TBARS),是表示为丙二醛(MDA)的形成,按照德雷伯和哈德利的方法23),表示在nmol /毫克的组织。

2.7.7。抗氧化剂酶化验

超氧化物歧化酶(SOD)活性估计的方法Durak et al。24),表示为单位/毫克的蛋白质。过氧化氢酶(CAT)活性测定使用Aebi技术[25),表示为μ摩尔H2O2摧毁/分钟/毫克的蛋白质。谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活动决心使用Flohe和Gunzler[描述的协议26),表示为U /毫克的蛋白质。

2.7.8。组织病理学研究

肝脏和肾脏部分是用福尔马林固定的解决方案(10%)。然后组织在70%的酒精洗,脱水通过一系列提升比例乙醇冲洗直到达成100%的乙醇,清除在二甲苯中,渗透与软石蜡(熔点= 60°C),最后嵌入到熔化的石蜡。石蜡部分在二甲苯脱蜡,然后患者通过一系列的下降比例乙醇洗最后嵌入到熔化的石蜡。结果石蜡块4 - 6毫米厚度被削减时使用一个旋转切片机与苏木精和伊红染色,在显微镜下观察到。

2.8。统计分析

使用SPSS 18.0版软件进行统计分析。所有的数据进行了分析使用方差分析图基测试紧随其后。所有值给出平均值和标准偏差。差异被认为是重要的 。

3所示。结果与讨论

3.1。植物化学的成分和在体外抗氧化效果l . europaeum

矿物质在人体重要的角色在许多活动。例如,饮食补充钾和钙起着重要的作用在调节血压27,28]。

叶子的营养成分枸杞和矿物的信息内容是有限的。micromineral(铁、铜、锰和锌)和macromineral(钙、镁、钠和K)的概要l . europaeum详细表1。结果表明,K(1528.32毫克/ 100克)是最重要的常量营养元素在叶样品。根据金等。29日和结束等。30.),K是集中矿产的叶子l .摘要和l . barbarum。此外,结果表明,叶含有较高的铁水平相比其他微量元素。各地的矿物成分枸杞大于或等于其他绿叶蔬菜31日]。

表1
矿物含量枸杞europaeum。

关于从树叶中提取的色素含量l . europaeum、表2表明大量的叶绿素(382.19μg / g干重),紧随其后的是β胡萝卜素(68.02μg / g干重),番茄红素(40.38μg / g干重)。脂溶性色素如叶绿素,β-胡萝卜素和番茄红素,发挥重要的人类健康(32]。β胡萝卜素和叶绿素已知有抗氧化作用,能够抑制脂质氧化(33]。他们表现出的能力,减少自由基引起的慢性疾病的风险。番茄红素已被证明,以防止各种疾病如癌症和心血管疾病32]。有价值的存在大量的营养物质(膳食矿物质)和脂溶性生物活性颜料像叶绿素,β-胡萝卜素和番茄红素,使叶子l . europaeum人类营养的特殊组件。

表2
和抗氧化活性的植物化学的内容枸杞europaeum。

抗氧化剂化验显示的能力l . europaeum甲醇提取物清除DPPH和H2O2激进分子(表2)。欧共体50值DPPH, H2O2清除活动分别为23.02和28.83μ分别g / mL。这个伟大的抗氧化活性的生物活性化合物的存在可以解释叶子类胡萝卜素、番茄红素等。的成果l . europaeum已经被证明是富含抗氧化化合物(花青素、类胡萝卜素、番茄红素、丹宁酸)(13]。最近,罗莎et al。12已经展现出了强大的抗氧化活性l . europaeum果油abt和DPPH清除测试。此外,我们最近的研究发现的叶子l . europaeum组成的具有生物活性的化合物,包括咖啡酸没食子酸,柚苷配基,和另一个9的化合物,可以防止三地4全身的肝脏和肾脏损伤的老鼠,在活的有机体内据HPLC-DAD分析(15]。

3.2。的影响l . europaeum在体重和器官重量

顺铂是一种化疗药物用于治疗一些肿瘤。不幸的是,许多严重的副作用的药物已报告神经毒性、肝毒性、肾毒性(34]。近年来,植物化学物质从植物显示保护作用对顺铂引起的肝脏和肾脏损伤政府(35,36]。

的影响l . europaeum、槲皮素、顺铂的体重以及肾脏和肝脏相对重量见表3。在实验期间,所有的研究团体幸存了下来。虽然,显著减少身体生长和增加肝脏和肾脏重量被记录在cisplatin-treated组,而控制。减少体重可能归因于食品消费或减少这种有毒药物在胃肠道的影响(37]。许多研究已经证明,顺铂政府可以诱导肾脏重量的上升35,38]。当槲皮素或l . europaeum被加入到治疗动物,顺铂的不利影响这些参数被逆转。

表3
的影响枸杞europaeum、槲皮素、顺铂在BW和肝脏和肾脏指数。
3.3。的影响l . europaeum在血清肝脏和肾脏生物标志物水平

大量的研究已经证明了肝肾毒性的顺铂35,39]。有害的顺铂对肝功能的影响可能改变显示的肝酶生物标志物包括AST和ALT。事实上,肝细胞的损伤会导致膜透性的变化,导致酶的逃避细胞(40]。同样,LDH水平是细胞凋亡的一个强大的指标,因为它被释放,细胞在细胞凋亡的一个条件(41]。在这项研究中,AST的活动,血清中ALT, LDH显著增加( )与顺铂相比,对照组(表4)。

表4
的影响枸杞europaeum和槲皮素cisplatin-treated小鼠血清生化参数。

探讨顺铂对肾功能的影响,肾损伤的生物标志物如尿素、肌酐、尿酸、包进行了分析。表4表明尿素、肌酐、尿酸,和包子cisplatin-treated动物显著增加到68.01μ96.01 mol / L,μ30.58 mol / L,μ8.99 mol / L, L与对照组相比更易为35.51μ52.29 mol / L,μ20.39 mol / L,μ4.63 mol / L,更易与L,分别。这些结果与先前的报告相一致20.,35,42]。的管理l . europaeum甲醇提取显示,这些肾功能生化参数归一化。提取的效果类似于槲皮素的抗氧化化合物的标准。王亚南renoprotective活动l . europaeum由于其抗氧化作用。研究Domitrovićet al。20.]表明cisplatin-mediated肾脏损伤小鼠有显著改善通过减少核factor-kappa——小檗碱β易位和抑制肿瘤坏死因子-α和cyclooxygenase-2表达式。最近的研究Sanchez-Gonzalez et al。43]表明,槲皮素的nephroprotective效果可以归因于其抗氧化,抗炎,血管的潜力。

3.4。的影响l . europaeum甲醇提取SOD,猫,GPX水平在肝脏和肾脏

抗氧化防御系统包括三个酶(SOD, CAT,谷胱甘肽),扮演着重要的角色在预防细胞活性氧和有害的影响。然而,长期使用化疗药物顺铂诱导急性肝和肾损伤,使他们对氧化损伤更敏感39]。顺铂和LEM预处理的影响肝脏和肾脏氧化应激参数见图1。这显然是非凡的,顺铂政府产生了显著降低( )的SOD水平,猫,谷胱甘肽在肝脏和肾脏与对照组相比。这些结果符合的早期发现Kumar et al。35)说,上述抗氧化酶的活动减少了,顺铂后大鼠的肝脏和肾脏组织中管理。相比之下,登月舱治疗剂量为7.5毫克/公斤体重显著抑制above-elevated参数相比cisplatin-treated组( )。登月舱的预防效果是类似于quercetin-treated老鼠(50毫克/公斤体重)。很明显,我们的结果表明,甲醇提取物l . europaeum防止酶的抗氧化剂的疲惫和保护cisplatin-induced氧化损伤。

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图1
脂质过氧化和抗氧化酶活动与顺铂治疗组小鼠的肝脏和肾脏组织。值表示为均值±SD ( )。 显著差异在 和 显著差异在 :顺铂组和对照组。 显著差异在 和 显著差异在 :枸杞+顺铂和槲皮素+顺铂组与顺铂组。
3.5。的影响l . europaeum甲醇提取物对脂质过氧化的抑制活性

MDA,脂质过氧化作用的最终产品,在生产过剩的自由基生成和被认为是一种标记的细胞损伤和细胞毒性44]。

肝脏和肾脏中的MDA含量如图1 (d)。显著增加肝脏MDA水平被发现在接受顺铂(2.85 nmol /毫克蛋白)相比,对照组(0.85 nmol /毫克蛋白),( )。MDA含量的增加顺铂后暴露可能归因于活性氧的生产过剩,这可能与肝细胞酶泄漏和线粒体酶活性的抑制45]。肾脏MDA水平也显著增加顺铂治疗组(4.55 nmol /毫克蛋白),比未经处理的对照组(2.13 nmol /毫克蛋白)( )。相反,登月舱预处理与防止肝脏和肾组织MDA含量的增加。与此同时,槲皮素治疗显示出良好的防护效果相比cisplatin-treated组( )。

可能的机制之一,肝和肾的保护措施l . europaeum是通过antiperoxidative属性和防御自由基的潜在作用。

3.6。的影响l . europaeum甲醇提取肝脏和肾脏的形态

登月舱的肝肾保护电位和槲皮素经组织病理学检查(图2)。对照组(图2(一个)登月舱)和组织(图2 (b)显示正常的肝脏的组织学结构。相比之下,cisplatin-treated组显示显著的形态变化在肝脏部分(图2 (c))。这些改变是被膜细胞退化;投下观察到在某些小管,多个病灶出血和主要血管堵塞可能授予顺铂的毒性ROS的生成,造成损害肝细胞的不同膜成分。登月舱的管理(图2 (d))和槲皮素(图2 (e))抑制上述变化和肝脏部分建筑近与对照组没有血管或炎性改变的迹象。另一方面,对照组(图的肾脏3(一个)登月舱)和组织(图3 (b)显示正常的组织学结构。然而,cisplatin-treated老鼠显示明显的病理变化,包括肾小球萎缩,炎症细胞的浸润,退化管状结构(图3 (c))。显著改善了这些肾损伤治疗LEM和槲皮素(数字3 (d)和3 (e))。这些结果表明,l . europaeum有一定的保护作用对顺铂中毒与抗氧化酶和生化结果是一致的。

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图2
叶的甲醇提取的影响枸杞europaeumCCl (LEM)在肝组织学4喝醉了的老鼠。肝脏切片和沾hematoxylin-eosin ())。代表照片(200 x)与对照组(a), 150毫克/公斤体重LEM组(b), cisplatin-treated集团(c) 150毫克/公斤体重LEM +顺铂组(d),和50毫克/公斤BW quercetin-positive对照组(e),医学博士:膜细胞退化;IL:炎症性白细胞渗透;简历:中央静脉。
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图3
叶的甲醇提取的影响枸杞europaeum(LEM)肾脏组织学cisplatin-intoxicated老鼠。肾脏切片和沾hematoxylin-eosin ())。代表照片(200 x)与对照组(a), 150毫克/公斤体重LEM组(b);cisplatin-treated集团(c) 150毫克/公斤体重LEM +顺铂组(d),和50毫克/公斤BW quercetin-positive对照组(e), GA:肾小球萎缩;DL:管状扩张;G:团伞花序;D:远曲小管;P:近曲小管;C:海岸。

4所示。结论

本研究的数据显示,首次甲醇提取物的抗氧化活性和植物化学的内容枸杞europaeum。结果表明,LEM富含生物活性化合物。登月舱应当发现强肝肾保护作用对cisplatin-induced在小鼠肝脏和肾脏损伤。这种有益的效应可能与强大的抗氧化活性和自由基清除能力的植物。我们的结果证明,l . europaeum是一种新型的天然抗氧化剂来源,鼓励其使用,防止肝脏和肾脏障碍。

数据可用性

所有的数据支持结果摘要所示,可以提供相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Ilhem Rjeibi进行了实验和草案写道。Anouar Feriani Anouar本萨阿德,Jazia Sdayria参与协议开发、实验研究和数据分析。伊萨姆说,Sana Ncib,萨米Souid参与实验设计并提供试剂。Ilhem Rjeibi Mohamed Salah Allagui,吉达市Hfaiedh写了初稿的手稿。所有作者审查和编辑手稿和批准的最终版本的手稿。

确认

作者表达自己的感谢中国高等教育和科学研究。