文摘

自噬是一种细胞内降解系统确保一个动态循环所需的各种构件的自我更新、体内平衡、细胞的生存压力。我们使用原发性急性髓系白血病(AML)样本和人类AML细胞株研究自噬的调节机制及其在AML细胞分化中的作用。我们发现了一个显著的低表达关键自噬——(ATG)主要相关基因在AML相比健康的粒细胞,增加自噬活动期间反式维甲酸(ATRA)诱导中性粒细胞分化,和一个受损的AML分化抑制ATG3, ATG4D, ATG5。支持的概念中的自噬,我们发现ATRA-induced自噬是Beclin1-independent相比,饥饿或三氧化二砷(ATO)诱导自噬。此外,我们发现PU.1 ATG3积极转录监管机构,ATG4D, ATG5。低PU.1表达AML可能占低ATG基因表达在这个疾病。低表达的自噬发起者ULK1 AML可以部分归因于高ULK1-targeting microrna - 106 a的表达。我们的数据清楚地表明,粒细胞AML分化依赖于经典之中自噬通路,恢复自噬活动可能在分化治疗是有益的。

1。介绍

基底macroautophagy(此后称为自噬),分解细胞内循环系统,是维持细胞内环境稳态和生存的关键。此外,激活自噬允许延长细胞存活时接触到不同类型的压力如饥饿或细胞毒性药物。严格监管和动态过程的特点是新创自噬体的形成。自噬体吞噬cytoplasmatic组件和交付这些货物,例如,长寿蛋白质或受损的线粒体,溶酶体降解。在酵母的研究已经确定了一系列的自噬,(ATG)相关基因形成自噬机制。这些ATG在哺乳动物细胞基因是高度保守的,允许研究它们的功能也在高等真核生物(1- - - - - -4]。在自噬过程的主要步骤包括启动、成核、伸长,成熟的自噬小体的自噬小体的溶酶体融合。规范自噬的过程遵循hierarchical-ordered招聘autophagy-related (ATG)蛋白质phagophore大会网站(5]。autophagy-initiation复杂由ULK1、ATG13 FIP200, ATG101。ULK1蛋白质复杂的包括ULK1 ATG13, FIP200坐标自噬起始从不同的上游信号通路诱导自噬(6,7]。有趣的是,最近的数据显示函数ULK1不仅在自噬激活还在伸长和关闭autophagosomal膜通过绑定ATG8蛋白(8]。成核的控制下是VPS34-Beclin1第三类pi3激酶复合物导致隔离膜的形成(4]。随后,两个ubiquitin-like接合系统,ATG5 / ATG12和ATG8,包括LC3的哺乳动物的同系物,GABARAP, GATE-16,音乐会double-membraned的形成自噬体(9]。两个系统依靠ATG7 E1-like酶的激活。额外的蛋白质参与这些共轭系统包括ATG3 ATG4 ATG10, ATG16L1。在最后一步中,自噬体与溶酶体融合形成自吞噬泡退化的内容。

在自噬细胞内环境稳态和生存的重要性一直感激,它在肿瘤发生中的作用和癌症进展仍在发展中10,11]。自噬在肿瘤抑制功能,例如,保护蛋白质和细胞器内稳态。此外,基因组不稳定是由于受损的自噬和几个自噬与肿瘤抑制基因的功能(例如,BECN1,ATG5,ATG4C)被发现12- - - - - -14]。另一方面,肿瘤细胞显示自噬活动增加,以满足增加代谢需求,和自噬激活细胞毒性药物允许细胞生存15]。一般来说,自噬在肿瘤发展中的作用尚未完全理解和明确不同肿瘤类型和发展阶段的肿瘤之一。一方面,自噬可能为肿瘤细胞提供一种生存策略,表明自噬抑制治疗用途;另一方面,自噬可能诱导细胞死亡的,例如,针对抗凋亡蛋白,指示激活自噬作为小说的工具在癌症治疗16,17]。

几项研究表明自噬在哺乳动物发育和细胞分化的功能(18- - - - - -20.]。在骨髓形成,成熟的髓细胞经历细胞大小的减少相比常见的髓系祖细胞,获得全新的形态和功能21,22]。这样一个戏剧性的变化在细胞结构不仅意味着巨大的重建过程,还需要一个微妙的平衡在高分子合成和降解可能归因于自噬。因此,Atg5基因敲除小鼠表现出严重的发育缺陷(23- - - - - -25]。在骨髓开发中,尤其是在红细胞成熟,ATG-associated基因ULK1(ATG1),ATG7,女水妖(BNIPL3)是线粒体和核糖体的间隙的关键(26,27]。此外,FIP200组件的ULK1 autophagy-initiation复杂,对造血干细胞(HSC)维护很重要,和FIP200淘汰赛高碳钢显示增加扩散和骨髓扩张(28]。一般而言,自噬是HSC所需生存和成体干细胞的分化,包括骨髓祖细胞(6,20.,27]。此外,自噬是参与骨髓细胞特定功能,如由单核细胞和巨噬细胞吞噬作用29日,30.)以及由树突状细胞抗原表达(31日]。最后,自噬缺陷导致中性粒细胞脱颗粒缺陷和降低中性粒细胞炎症势32]。

急性髓系白血病(AML)是一种体内,基因高度异构血液癌症亚型特点是骨髓爆炸的积累与改变自我更新细胞,增殖,分化功能(33]。急性早幼粒细胞白血病(APL),一个特定的AML亚型,特点是易位t(15日17)编码的oncogene-retinoic酸受体α(PML-RARA)融合蛋白(34]。PML-RARA防止有效RARA目标基因的转录对骨髓分化占主导地位的消极的方式很重要。此外,PML-RARA压制PU.1转录的转录目标绑定到重叠的DNA结合位点。自从PU.1控制一系列骨髓基因的转录,其抑制PML-RARA有助于受损分化在APL (35]。所有- - -反式维甲酸(ATRA)结合蒽环霉素或三氧化二砷(ATO)能够诱导完全缓解,90%的患者通过蛋白酶通过诱导PML-RARA降解或半胱天冬酶裂解(36,37]。此外,ATRA诱导Beclin1-independent自噬或aggrephagy有助于PML-RARA蛋白质的降解聚合物(38- - - - - -40]。此外,我们和其他报道,ATRA-mediated AML分化取决于积极自噬流量,抑制自噬通过药理和遗传方式减毒ATRA-induced中性粒细胞的分化APL和non-APL细胞株(40- - - - - -42]。这也表明,自噬是参与骨髓分化PML-RARA总量超出其在降解中的作用[38]。

尽管一些研究分析骨髓分化过程中自噬的功能(43- - - - - -48),骨髓噬途径活跃在这个过程中还没有完全的特点,和临床数据一般ATG表达式在初级AML是罕见的。在这项研究中,我们表明,ATG表达式经常压抑在初级AML患者AML细胞,中性粒细胞分化取决于功能自噬与规范化路径截然不同。我们确定了几个小说ATG基因转录的目标PU.1和推测低ATG AML基因表达是部分由于PU.1水平低。最后,AML分化的差别会导致对这些微rna - 106 a,允许其目标ULK1的表达。因此,初步数据显示,低ULK1表达式与mir - 106 a的表达增加有关在小群AML患者样本。

2。结果

2.1。ATRA-Mediated的AML细胞分化(HL60)和APL (NB4细胞)与增加,不在经典里的骨髓细胞自噬

迄今为止,激活自噬流量在ATRA-induced APL / AML分化主要研究在短时间接触ATRA和并未直接相比,饥饿或三氧化二砷(ATO)诱导自噬(38]。因此,我们更详细地研究ATRA如何激活自噬在non-APL HL60以及APL NB4细胞。我们发现明显诱导自噬中性粒细胞分化期间从第二天开始在两个细胞系的从LC3B-I LC3B-II(图发生了明显改变1(一))。作为第二自噬标记,LC3B mRNA分析了感应对ATRA治疗HL60 NB4以及在各自耐ATRA积累。LC3B mRNA显著调节两亲本细胞系对ATRA治疗但不耐的不同等级,除了明显但不显著增加在天6耐ATRA HL60线(图1 (b))。此外,GFP-LC3B重新从扩散模式强调模式HL60 NB4细胞中性粒细胞分化,进一步表明积极的自噬(图1 (c))。有趣的是,量化GFP-LC3点显示,饥饿,ATO-induced自噬在同一个细胞显然不同于ATRA-mediated诱导自噬(图1 (d)黑条)。不过,细胞的百分比GFP-LC3B puncta所有三个治疗(图相类似1 (d),白色的酒吧)。最后,确认诱导自噬流量对ATRA治疗,我们生成NB4细胞表达mCherry-EGFP-LC3B串联结构。自吞噬泡出现红色自低pH值在这些细胞器淬灭了EGFP的信号。mCherry比EGFP荧光是由流式细胞术如前所述49]。一个阈值被设置为识别细胞的百分比高自噬活动(高mCherry / EGFP比率)。我们找到了一个转向红色荧光NB4细胞ATRA处理(图1 (e)左面板)的显著增加细胞自噬活性高(图1 (e)右面板)。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
图1
AML细胞的自噬与中性粒细胞分化有关。(一)ATRA分化诱导LC3B lipidation衡量西方墨点法。HL60 AML和NB4 APL细胞治疗1μM ATRA 6天。GAPDH是用作加载控制。(b) qPCR LC3B mRNA分析HL60 NB4以及耐ATRA HL60-R NB4-R2细胞4和6天后ATRA治疗,分别。数据显示为 倍激活而未经处理的细胞在4和6天。(c) ATRA分化诱导GFP-LC3点的形成。NB4和HL60细胞稳定表达GFP-LC3服用1μM ATRA、渴望8小时或处理6 (NB4)和12μ三氧化二砷(M (HL60)2O3),分别。GFP-LC3 puncta使用共焦显微镜检测。比例尺10μm。(d) (c)治疗。结果表示为细胞的百分比显示不时GFP-LC3染色,平均每个细胞的puncta数量。计数意味着±s.e.m。 ;三个独立的实验。(e)流式细胞仪分析串联构造mCherry-EGFP-LC3B NB4细胞的表达。左面板:直方图mCherry-Height / EGFP-Height比率与车辆或ATRA治疗的细胞(1μ米)48 h。右面板:百分比代表高的细胞自噬活动基于一个阈值集控制细胞。Mann-WhitneyU测试中, 。

测试是否HL60 AML细胞自噬对中性粒细胞分化至关重要,我们阻止了自噬药物使用磷脂酰肌醇3-kinase (PI3K)抑制剂3-methyladenine (3-MA)或氯喹(CQ)。ATRA-induced自噬抑制导致中性粒细胞减少这些细胞的分化就是明证显著降低CD11b表面表达(补充图1)。为了排除,抑制自噬中性粒细胞分化仅仅通过增加细胞凋亡的影响,我们与pan-caspase抑制剂z-VAD-fmk cotreated这些细胞。阻断细胞凋亡在3-MA或CQ-mediated ATRA-induced抑制自噬中性粒细胞分化没有任何影响(补充数据1和b,和数据未显示)。我们的数据清楚地表明,诱导自噬是一个先决条件ATRA-induced中性粒细胞分化的AML细胞本身而在ATRA-induced细胞死亡的作用可以忽略不计。

2.2。ATG基因表达通常是减少在初级AML患者

我们以前公布,ATG基因等DRAM1,WIPI1/2,MAP1S明显下调在初级AML样本(42,50,51]。然而,更多的全球ATG基因表达谱在临床AML患者样本是失踪。因此,我们量化附加18 ATG基因的表达水平在114年一群AML患者样本与染色体畸变和比较他们相应的定义从健康的捐赠者表达水平在成熟的粒细胞( )(数据2(一)-2(d)和补充图2)。9/18 ATG基因的表达,手术在不同阶段的自噬小体的生物合成,显著抑制AML相比他们的表达在成熟,健康粒细胞:ULK1, FIP200、BECN1 ATG14、ATG5 ATG7, ATG3 ATG4B, ATG4D。我们的数据表明,低ATG基因表达与一个不成熟的AML爆炸表型相关。


图2
自噬(ATG)相关的基因表达是经常抑制AML在临床样本。使用聚蔗糖梯度主要AML爆炸分离;总RNA提取;和ATG基因mRNA水平自噬起始(a)期间,成核(b), ATG12 - (c), LC3 (d)接合阶段被qPCR量化。测量周期阈值(Ct)值代表log2表达水平。值被规范化的看家基因的表达水平hmb ABL1。Mann-WhitneyU测试中, , , , 。
2.3。粒细胞分化AML / APL细胞,主要人类APL细胞,人类CD34和健康+祖细胞由ATG基因表达增加平行

基于我们的研究结果在临床AML样本显示全球减少ATG基因转录与成熟粒细胞相比,我们问这些基因在白血病和正常中性粒细胞分化诱导。为此,我们首先分析了选择ATG基因的表达,ATG3, ATG4D,中性粒细胞分化期间ATG5 APL细胞系以及在初级APL患者接受ATRA治疗。由于有限的患者样本RNA,我们只能确定ATG5APL患者的表达式。我们发现这三个ATG基因研究ATRA治疗明显诱导后4天在父母而不是耐ATRA NB4细胞(NB4-R2)(图3(一个))。重要的是,标志着ATG5归纳主要APL患者对ATRA治疗在活的有机体内(图在短期和长期随访检查3 (b))。最后,测试如果ATG基因表达也诱导在正常粒细胞分化,分化我们人类CD34+祖细胞使用g - csf对中性粒细胞。类似于白血病中性粒细胞分化,所有三个ATG基因分析显示显著增加(图的表达水平3 (c))。在一起,中性粒细胞分化与ATG关键基因的表达增加呈正相关。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图3
感应的ATG3,ATG4D,ATG5基因表达在中性粒细胞正常和白血病前体细胞的分化。(一)ATG3,ATG4D,ATG5qPCR分析NB4及耐atra NB4-R2细胞在治疗1μM ATRA 4天。结果给出了 倍的变化与未经处理的SHC002看家基因控制细胞和规范化hmb。(b)的感应ATG5在ATRA治疗的急性骨髓性白血病患者在接受治疗。两个新诊断的APL患者t(15、17)处理口头管理维甲酸(ATRA)的剂量45毫克/米2日报。从爆炸细胞总RNA提取使用聚蔗糖梯度分离,和表达水平ATG5和被qPCR评估。被归一化值hmb和天0作为实验的起点(左面板)。一个类似的诱导ATG5信使rna 4 APL患者在诊断和完ATRA治疗(平均1.3个月;右面板)。相对表达式作为Ct值之间的差异ATG5信使rna和管家基因的水平hmb和ABL1(ΔCt)代表log2表达水平。正常CD34 (c)+祖细胞分化与g - csf表示天;和ATG3,ATG4D,ATG5qPCR mRNA表达测定。数据分析(一)Mann-WhitneyU测试中, , , 。
2.4。抑制的关键ATG基因ATG5显著减弱粒细胞分化和AML细胞的自噬

为了测试ATRA-induced自噬取决于守恒的伸长过程中自噬,我们撞倒了ATG5在两个AML分化模型。我们首先分析了ATG5蛋白表达在中性粒细胞HL60 AML和APL NB4细胞的分化。我们发现一个依赖于时间的upregulation ATG5蛋白质含量在两个细胞系ATRA分化(图4(一)左面板)。排除ATG5感应完全的结果是压力反应ATRA治疗而不是在骨髓分化功能,我们分析了ATG5表达耐ATRA HL60-R NB4-R2不同等级。两个细胞系没有上调ATG5 ATRA治疗后比亲代细胞(图4(一)右面板),进一步表明upregulation ATG5与中性粒细胞分化有关。重要的是,击倒ATG5使用两个独立的shrna显著降低ATRA-induced自噬(数字4 (b)和4 (c))。在禁用ATRA-induced自吞噬的同时,AMLATG5可拆卸的细胞显示中性粒细胞分化(图受损4 (d))。此外,使用半胱天冬酶抑制剂抑制细胞凋亡减少中性粒细胞分化没有影响在ATG5抑制(数字4 (d)和4 (e)),这表明减少细胞分化并不是由于增加了细胞的死亡ATG5可拆卸的细胞。重要的是,ATRA结合药理自噬诱导everolimus或氯化锂导致显著增强中性粒细胞分化所评估的高架CD11b表面表达平行ATG5-ATG12增加复杂的形成(图4 (f))。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)
图4
ATG5感应对中性粒细胞分化AML细胞至关重要。(一)ATG5 HL60蛋白表达,NB4,耐atra NB4-R2和HL60-R ATRA-induced中性粒细胞分化。细胞治疗1μM ATRA 6天。在时间点表示,蛋白质是由西方墨点法提取和ATG5水平进行了分析。GAPDH是用作加载控制。(b)抑制ATG5排除了ATRA-induced自噬。细胞稳定表达争夺控制成分(Ctrl)或shRNA定位ATG5(shATG5_1和shATG5_2) ATRA治疗,疗程4天。西方墨点法ATG5和LC3B显示。GAPDH是用作加载控制。(c)抑制ATG5防止ATRA-induced自噬以GFP-LC3点的形成。NB4和HL60 GFP-LC3细胞表达争夺控制成分(shCtrl)或shRNA目标ATG5(shATG5_1和shATG5_2)被视为(b)的百分比。GFP-LC3 puncta-positive细胞数量和平均的puncta被共焦显微镜量化。计数意味着±s.e.m。 ;三个独立的实验。(d) ATG5损害抑制中性粒细胞的分化AML细胞。CD11b表达式的流式细胞仪分析细胞治疗(b)所示。阻断细胞凋亡z-VAD-fmk没有改变减少ATG5击倒细胞分化。数据均值±s.e.m。 。(e) HL60 NB4ATG5可拆卸的AML细胞显示对ATRA治疗细胞凋亡增加。细胞凋亡是由膜联蛋白V染色和半胱天冬酶活动的3/7。z-VAD-fmk治疗有效的减毒细胞凋亡诱导ATG5可拆卸的细胞在ATRA-induced分化。细胞治疗(b)。(f)药理激活自噬增强中性粒细胞的分化AML细胞。HL60细胞治疗1μ0.5 M ATRA单独或结合μM everolimus(左面板)或25毫米氯化锂(右面板)4天。联合治疗显著地增强中性粒细胞分化以CD11b归纳。ATG5感应被西方墨点法评估。数据均值±s.e.m。三个独立的实验。Mann-WhitneyU测试中, ;n。:not significant.

进一步验证早期的发现关于自噬激活ATRA的类型,我们撞倒了Beclin1在HL60 AML和NB4 APL细胞。如上所述,我们发现显著降低Beclin1水平在初级AML样品相比成熟的中性粒细胞。根据这些数据,我们观察到轻微增加Beclin1蛋白质在ATRA-induced中性粒细胞分化AML细胞株(补充图3)。重要的是,击倒Beclin1没有废除ATRA-induced自噬(补充数据3 b和c,左面板)。同时,抑制Beclin1显著减少饥饿和三氧化二砷(ATO)诱导HL60和NB4细胞自噬,确认的功能Beclin1击倒(补充图3 c,对面板)。符合其ATRA-induced自噬作用可以忽略不计,Beclin1可拆卸的AML细胞显示无显著降低中性粒细胞分化(补充图3 d)。因此,ATRA-induced自噬似乎显然different-less强烈和Beclin1-independent-from规范饥饿——或者ATO-induced自噬。

2.5。关键ATG基因的转录调控骨髓主监管机构PU.1

Ets家族转录因子PU.1,骨髓细胞发展的主调节器,在AML显著下调。我们之前发现autophagy-associated基因MAP1S和WIPI1PU.1转录目标以及我们发现击倒PU.1明显变弱ATRA-mediated自噬流量(42促使我们进一步研究如果额外ATG基因是由转录因子。首先,我们决定ATG3、ATG4D ATG5基因在两个独立的NB4表达式PU.1可拆卸的细胞系对ATRA治疗。感应所有三个基因的mRNA水平显著降低PU.1击倒(图5(一个))。核实PU.1-dependent这些ATG基因的表达,我们使用NB4细胞表达一种诱导PU.1-ER构造,可以激活它莫西芬治疗导致PU.1-ER易位核和转录活动。信使rna水平的三个基因都明显在PU.1-ER激活诱导NB4细胞(图5 (b))。然后我们分析3.5 kb基因组区域,和下游的转录开始网站的所有三个使用MatInspector ATG基因。我们确定了几个公认的PU.1结合位点(图5 (c)左面板)。PU.1染色质免疫沉淀反应显示绑定PU.1启动子区域ATG3,ATG4D,ATG5(图5 (c))。总之,我们确定了三个额外的ATG基因受PU.1 ATRA-induced期间中性粒细胞AML细胞的分化。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图5
PU.1-dependent的监管ATG3,ATG4D,ATG5在ATRA-mediated NB4细胞的分化。(一)ATG3,ATG4D,ATG5信使rna表达水平量化NB4 shPU。1细胞ATRA处理了4天。(b) NB4细胞转导诱导PU-1-ER表达向量,服用4-OHT诱导PU.1核易位。ATG3,ATG4D,ATG5信使rna表达水平量化(a)。(c)表示的示意图ATG3,ATG4D,ATG5近端启动子区域。假定的PU.1结合位点在这些启动子区域是黑色的圆圈表示。在活的有机体内绑定的PU.1表示PU.1绑定网站显示了使用PU.1抗体芯片NB4细胞。acetyl-histone H3抗体和免疫球蛋白作为积极的和消极的控制,分别。GAPDH放大显示在下拉菜单的负控制不同。Mann-WhitneyU测试中, 。
2.6。转录后的调控期间,mir - 106 a ULK1 AML分化

考虑到广泛的异常的微rna (microRNA)在骨髓恶性肿瘤中表达,我们问AML的microRNA的表达可能有助于改变ATG基因镇压这种疾病。基于一个microrna的分析研究,确定了mir - 17和mir - 181家庭成员最表达下调microrna在NB4 APL细胞(中性粒细胞分化52),和我们的研究确定ULK1作为小说的目标mir - 17家人mir - 106在肺癌治疗(53),我们假设这也microrna的目标ULK1在AML。在第一步中,我们评估如果击倒ULK1类似于其他ATG基因分析将减弱中性粒细胞分化。事实上,使用两个独立的shrna针对ULK1,我们发现抑制ULK1导致显著降低CEBPE和CD11b水平(图6(一))。此外,mir - 106 a表达阻止ULK1诱导NB4 ATRA-induced分化后的受损被显著降低诱导中性粒细胞分化CEBPE信使rna相比控制转导细胞(数字6 (b)和6 (c))。已知mir - 106 a的表达目标p21CIP1期间,一个基因诱导中性粒细胞分化,被确定为一个积极控制mir - 106 a矢量的功能(图使用6(d))。mir - 106 a的异位表达NB4细胞如图6 (e)。因此,使用一个反- mir - 106 a构造,我们发现阻塞mir - 106 a导致蛋白表达增加ULK1 ATRA治疗期间而过度mir - 106 a导致显著降低ULK1表达式(图6 (f))。最后,我们的初步数据表明ULK1信使rna与mir - 106 a的表达呈现负相关的群主AML患者样本(图166 (g))。我们的研究清楚地表明,ULK1中性粒细胞AML细胞的分化和功能,它的目标是致癌mir - 106 a,提供一个可能的解释在AML ULK1表达水平低。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
(d)
(d)
(e)
(e)
(f)
(f)
(g)
(g)
图6
mir - 106 a的目标ULK1和变弱ATRA-induced AML分化。(一)抑制ULK1变弱嗜中性粒细胞APL细胞的分化。NB4细胞稳定表达争夺控制成分(Ctrl)或shRNA瞄准ULK1(shULK1 # 1和shULK1 # 2) ATRA治疗,疗程4天。qPCR为ULK1和CEBPECD11b以及流式细胞仪分析显示。数据均值±s.e.m。三个独立的实验。(b)ULK1,CEBPE,p21CIP1表达式被qPCR发现NB4细胞稳定转导炒控制(NB4)或慢病毒载体表达mir - 106 a前体(NB4 106 a)。细胞治疗1μM ATRA 4天。结果归一化hmb和显示为 倍变化相对于相应的未经处理的控制细胞系。mir - 106 (e) qPCR分析NB4控制表达式和mir - 106 a overexpressing NB4细胞。(f)的免疫印迹分析ULK1表达式控制,反- mir - 106 a, mir - 106 - a -表达NB4细胞对ATRA治疗4天。GAPDH是用作加载控制。(g)总RNA分离从16 AML患者,并确定执行qPCR mir - 106 - a和ULK1信使rna水平,分别。SNORA38B和5 s rRNA microRNA qPCR rna,用作参考hmb和ABL1作为信使rna qPCR参考mRNA。ΔCt值ULK1和mir - 106计算和绘制。线性回归和皮尔森 计算使用棱镜软件。Mann-WhitneyU测试中, , , 。

3所示。讨论

在这项研究中,我们确定了Beclin1-independent,低强度自噬中性粒细胞分化期间AML细胞。我们确定关键ATG基因的表达在不同的自噬阶段在一个大型面板的主要AML患者。总的来说,我们发现各种ATG基因的表达显著降低在初级AML相比正常粒细胞。恢复这些ATG基因的表达在AML细胞在诱导自噬的激活中性粒细胞分化平行的通量。此外,我们发现,Ets家族转录因子PU.1骨髓分化的主监管机构,积极调节几个atg的表达式。这些发现向列表添加atg PU.1-regulated基因对中性粒细胞分化很重要。因此,ATG基因表达下降可以部分归因于PU.1 AML患者的低表达。我们还表明,mir - 106 a目标重要的自噬基因在AML ULK1。在一起,我们首先提供解释低ATG AML细胞中表达。

自噬在细胞分化和哺乳动物发展中的作用[18一直感激,几项研究表明,自噬功能紊乱导致细胞分化块。例如,线粒体自噬需要消除红色细胞前体,和缺乏自噬基因损害红细胞成熟和导致小鼠贫血54]。在megakaryopoiesis和血栓形成,自噬是需要适当的细胞周期和线粒体功能,并使用Atg7-deficient老鼠的一项研究表明,自噬缺陷引起血小板的生产和功能受损(43]。因此,巨核细胞的分化的慢性粒细胞性白血病细胞系K562需要增加自噬功能(55]。monocyte-macrophage分化期间,自噬诱导在释放Beclin1 bcl - 2和促进不仅细胞分化,而且细胞生存(45]。另一项研究使用条件Atg5淘汰赛中骨髓祖细胞前体细胞的轻微扩张描述(56]。我们和其他人表明,自噬是至关重要的治疗导致中性粒细胞分化的AML细胞表明类似的依赖自噬中性粒细胞在健康个体发展38- - - - - -40,42]。是否有不同的功能ATG5或不在经典里的自噬一般在正常和白血病中性粒细胞分化仍在调查之中。

phosphoinositide-3-kinases (PI3K / AKT和mTOR信号通路目前针对临床试验治疗AML通过增加细胞死亡与化疗相结合(57]。因为我们的结果显示减少ATRA-mediated分化抑制自噬时,自噬调制在癌症治疗可能对中性粒细胞分化的潜在负面影响。一般来说,类我PI3K抑制自噬起始,而第三类酶刺激自噬活动。广谱的净效应PI3K抑制剂针对两类PI3K通常诱发自噬的块。这一块在自噬可能干扰分化治疗。然而,特定抑制剂类我PI3K没有影响ATRA APL细胞的分化,可能被认为是提高细胞死亡与化疗相结合(58]。关于我们的发现,我们有信心,减少ATRA-induced自噬和中性粒细胞分化cotreatment ATRA和3-MA /渥曼青霉素导致第三类酶的抑制导致自噬起始块。我们的假设是由早期的发现表明击倒PIK3C3导致一块相似的分化与3-MA看到治疗(42]。为什么抑制PIK3C3但不是Beclin1减弱嗜中性粒细胞的分化,尽管这两个蛋白的一部分autophagy-initiation复杂吗?Beclin1可能不是PIK3C3成核的限制因素复杂ATRA-induced自噬。支持这个解释,我们观察到ATG5-ATG12-conjugated蛋白质的增加抑制Beclin1(数据未显示),表明细胞补偿损失的Beclin1 upregulation其他autophagy-related蛋白质。同样,少量的Beclin1蛋白质,释放bcl - 2抑制的差别通过ATRA-mediated对这些基因bcl - 2 (59),可以充分激活和稳定PIK3C3复杂。此外,PIK3C3不仅参与自噬小体成核,也徒在几个步骤与自噬(相关的信号通路60]。因此,它似乎是可能的PIK3C3击倒在中性粒细胞分化表型代表阻断自噬在后期的后果。

我们的发现在HL60细胞non-APL表明AML分化需要功能退化的自噬不仅PML-RARA APL。例如,阻断自噬干扰分化与细胞周期阻滞(数据未显示),并导致细胞死亡。自噬可以保护恶性肝星状细胞在正常压力下自噬机械或癌细胞。然而,自噬对维护正常的肝星状细胞(也很重要61年,62年]。抑制自噬的Bafilomycin A1没有对分化的影响,并引发自噬导致Beclin1-dependent VitD3细胞死亡。符合之前的发现,抑制自噬的结果在参与细胞凋亡的细胞分化[63年),我们现在显示cotreatment ATRA和自噬诱导产生的有利影响。这种differentiation-enhancing效应结合激活的分化和自噬可能具有临床意义。相当数量的APL患者呈现分化治疗期间主要并发症(例如,ATRA综合症或APL分化综合症,10 - 15%)(64年];从而减少ATRA结合自噬活化剂浓度可能对这些患者是有益的。一般来说,提高自噬与fda批准的药物可能代表一个可能的新战略甚至变得敏感,治疗急性骨髓性白血病患者在接受额外的AML亚型ATRA治疗。承诺使用结合ATRA autophagy-enhancing化合物包括rapalogs(西罗莫司、temsirolimus everolimus)和Ca2 +通道阻滞剂(维拉帕米、洛派丁胺和哌咪清)(65年]。

总之,我们的研究表明,增加ATG基因表达与正常中性粒细胞分化,分化的AML细胞包括经典之中自噬通路,Beclin1-independent。ATG4D ATG3水平增加,健康CD34 ATG5 mRNA在中性粒细胞的分化+造血祖细胞和其高表达在成熟中性粒细胞指向一个更一般的自噬的作用不仅在白血病还在正常中性粒细胞分化。自噬关键基因等ULK1,ATG3,ATG4D,或ATG5在初级AML患者样本明显下调,表达式可以恢复在APL患者和AML细胞株ATRA治疗。这些基因的低表达部分是由于抑制他们的积极的监管机构PU.1,或在ULK1的情况下,通过增加表达的负监管机构mir - 106 a。显然,ATRA-induced骨髓自噬不同于饥饿——或者chemotherapeutic-induced自噬,和进一步的调查需要澄清其功能和说明所涉及的信号通路。这是一个重要的任务,因为知道确切的经典之中自噬途径将有助于开发更具体的和改进的自噬的药物。最后,临床应用计划抑制自噬以减少细胞生存可能需要考虑对骨髓分化产生不利影响。

4所示。材料和方法

4.1。主要患者样本,CD34+细胞和细胞系

主要AML患者cDNA样本来自一群AML患者样本HOVON SAKK /(比利时-荷兰Hematology-Oncology /瑞士组临床癌症研究合作组)协议04,04,29岁,42(可用http://www.hovon.nl1987年和2006年之间)。所有的病人提供书面知情同意按照《赫尔辛基宣言》。病人数据代表log2表达水平和规范化2看家基因的表达水平hmb和ABL。CD34+动员外周血细胞健康的捐赠者扩展,培养和分化。人类急性骨髓性白血病细胞株NB4及其耐atra克隆NB4-R2 AML和M2细胞系HL-60及其耐atra克隆HL60-R维护rpmi - 1640 (Sigma-Aldrich),补充10%胎牛血清的边后卫,50 U /毫升青霉素,50μg / ml链霉素(Sigma-Aldrich),包含5%的湿润孵化器有限公司2在37°C。人类胚胎肾293 t细胞在DMEM培养(Sigma-Aldrich)补充5%的边后卫,1%青霉素和链霉素,1%玫瑰(Sigma-Aldrich)和保持在湿润的气氛中含7.5%有限公司2在37°C。

中性粒细胞分化、AML父母和可拆卸的细胞系被播种密度 /毫升和治疗1μM ATRA (Sigma-Aldrich) 2 - 6天。中性粒细胞分化评估增加CCAAT /增强子结合蛋白ε(CEBPE) mRNA表达和CD11b流式细胞仪分析。三氧化二砷(2O3;σ)溶解在1 M氢氧化钠和使用6 - 12μm . 3-Methyladenine (3-MA;σ)溶解在H2O和使用5毫米。氯喹二磷酸盐(CQ;σ)溶解在H2O和用于25μm . Bafilomycin A1在DMSO溶液溶解,使用200 nM,添加2小时前分析。

4.2。慢病毒载体、慢病毒制备和转导的细胞系

pLKO。1lentiviral vectors expressing small hairpin (sh) RNAs targeting PU.1, ATG5, or Beclin1 and a nontargeting shRNA control (SHC002) were purchased from Sigma-Aldrich. These vectors contain a puromycin antibiotic-resistant gene for selection of transduced mammalian cells. PU.1-ER construct was generated by subcloning PU.1-ER fragment into pLV-EF1a-MCS-IRES-Hyg vector containing hygromycin antibiotic-resistant gene using the In-Fusion HD cloning kit (Takara) according to the manufacturer’s instruction. Lentivirus production and transduction were done as described [66年]。转导AML细胞株人口被选为1.5μg / ml嘌呤霉素4天或250μg / ml潮霉素为10天。可拆卸的效率是通过免疫印迹和/或qPCR分析评估。mCherry-EGFP-LC3-expressing慢病毒载体是善良的玛丽亚s Soengas博士提供的(CNIO、分子病理学计划,马德里,西班牙)。

4.3。RNA提取和定量rt - pcr (qPCR)

总mRNA孤立使用miRCURY™RNA隔离包(Exiqon)根据制造商的指示。总RNA是反向转录,ATG基因表达在AML患者量化使用rt - pcr低密度阵列量化ATG基因表达如前所述[67年]。量化的ATG3,ATG4D,ATG5,CEBPE表达细胞系实验,TaqMan®基因表达分析Hs00223937_m1, Hs00262792_m1, Hs00169468_m1,分别和Hs00357657_m1。特定的引物和探针hmb和PU.1有被描述66年]。microrna的表达是评估使用miScript SYBR绿色PCR工具包和引物测定hsa - mir - 106 a(试剂盒)。我们使用hsa - mir - snora - 73作为microrna的正常化的看家基因。 倍的变化计算使用ΔΔCt相对量化的方法。数据代表均值±s.e.m。至少一式三份的实验。

4.4。免疫印迹分析

完整的细胞提取物在冰冷的PBS和细胞溶解使用尿素溶解洗缓冲区组成的8 M尿素和0.5% Triton x - 100补充蛋白质抑制剂鸡尾酒(罗氏诊断)。溶菌产物都用了3 s,然后离心机在13000 rpm 15分钟在4°C。布拉德福德与BSA作为标准分析用于确定蛋白的浓度的内容。40μ分析了g总蛋白质的电泳在预制凝胶(Biorad)。墨迹是初级抗体孵育anti-LC3B (nb600 - 1384;罗福斯生物制剂)在TBS 0.05或anti-PU Tween-20/5%牛奶。1in TBS 0.05 Tween-20/3% BSA overnight at 4°C and then incubated with secondary antirabbit DyLight 650 for 1 hour at room temperature. Additional antibodies used were anti-Beclin1 (Cell Signaling, #3738), anti-ATG5 (Sigma, A2856), and mouse monoclonal anti-GAPDH (Sigma). Blots were imaged using the ChemiDoc (Biorad) and Image Lab software.

4.5。免疫细胞化学、共焦显微镜和图像分析

我们跟着Wampfler等的方法。68年]。短暂,NB4细胞固定在2%多聚甲醛在PBS和permeabilized PBS或固定和permeabilized Triton X 0.1%甲醇cytospin后(−20°C)。细胞被洗在PBS和孵化主要LC3B抗体(猫。3686号;细胞信号技术)在室温下1 h。然后,细胞被洗两次PBS-Tween一旦与PBS,其次是孵化与二级抗体(FITC-conjugated antirabbit;猫。111-096-045号;杰克逊ImmunoResearch)在室温下1小时。Fluorescence-labeled电池使用共焦激光扫描显微镜进行了分析,并使用ImageJ LC3B点进行的量化。

4.6。自噬和凋亡检测

自噬是评估LC3 lipidation和GFP-LC3再分配。GFP-LC3点形成稳定GFP-LC3-expressing AML细胞cytospun,在RT和4%多聚甲醛固定20分钟,用PBS洗净,覆盖着荧光安装解决方案(Dako)之前的分析共焦显微镜(LSM510,卡尔蔡司)。量化GFP-LC3点,至少100个细胞每张幻灯片在三个独立的实验评估,也就是说,与强调染色GFP-LC3-positive细胞的百分比;和每个单元的离散puncta数量统计。

串联mCherry-EGFP-LC3B-expressing细胞治疗2天1μM ATRA。数据获得在流式细胞仪LSR-II (BD)与FlowJo使用BD FACSDiva软件和分析软件。一门基于亲代细胞用于估计的百分比高自噬活动如前所述[49]。

膜联蛋白V染色, 细胞被洗冷PBS / 5% BSA, resuspended在70年μl绑定缓冲,贴上藻红蛋白(PE)标记抗体膜联蛋白V根据制造商的协议(BioVision)。半胱天冬酶激活测量使用3/7 Caspase-Glo™3/7分析根据制造商的协议(美国麦迪逊Promega公司)。

4.7。统计分析和生物信息学

每个值代表报道均值±SD至少有三个独立的实验。 倍的变化计算使用−ΔΔCt相对量化的方法。非参数Mann-WhitneyU测试是用于比较两组之间的差异使用程序软件(GraphPad)棱镜。 值< 0.05被认为是具有统计学意义。启动子和基因序列都从在线数据库检索http://www.ncbi.nlm.nih.gov和http://www.ensembl.org/index.html。假定的PU.1转录因子结合位点预测通过MatInspector 8.0软件(http://www.genomatix.de)。

4.8。染色质免疫沉淀反应试验(芯片)

芯片进行使用芯片表达染色质免疫沉淀反应工具包(活动主题)根据制造商的建议。染色质的 NB4细胞是支离破碎的平均大小为500 bp使用提供的酶剪切鸡尾酒。免疫沉淀反应,我们使用anti-PU。1 (sc - 352;圣克鲁斯生物技术)抗体。免疫沉淀反应与免疫球蛋白(PP64B;北部)或一个anti-acetyl-histone H3抗体(Stratagene)被用作正面和负面的控制,分别。基因组区域包含假定PU.1结合位点被使用以下引物PCR扩增:ATG3网站;前5 3 :AGCATCAATCCACTCAGCATTC和反向5 3 :CTGGATGGCAGTGGAAAAGAC;ATG3site B;前5 3 :TCAGGGGTAAACTTGGAGCG和反向5 3 :TTGGGATCGCAGTCACAACT;ATG4D网站;前5 3 :CTGGAGCACTTCATTCATCCCT和反向5 3 :TGAGACTGACTGCGCACC;ATG4Dsite B;前5 3 :CGTTTTTGCCCCTCTCTGTA和反向5 3 :CGGCTTTTAACCACCCAACC;和ATG5;前5 3 :CAGCGTTGCCGGTTGTATTC和反向5 3 :CTCCAGGCAACTACTCACCC。此外,一个无关序列GAPDH基因被作为消极的控制。

的利益冲突

作者声明没有竞争的经济利益。

作者的贡献

精金,Adrian Britschgi Magali亨伯特,安娜·m·Schlafli设计并进行了实验研究,分析了数据,并起草了这篇文章。茉莉花Batliner认为ULK1 mir - 106 - AML差异化的目标。马里昂恩斯特,埃琳娜·a·Federzoni和黛博拉Shan-Krauer ATG执行和分析基因表达在初级AML患者样本和CD34在粒细胞分化+祖细胞。布鲁斯·e·Torbett和师大Yousefi煽动实验设计,提供了必要的试剂以及初步结果,修订起草文章。Hans-Uwe西蒙和马里奥·p·Tschan设计项目,分析数据,写论文,给最终批准提交的手稿。精金和Adrian Britschgi同样这项工作。Hans-Uwe西蒙和马里奥·p·Tschan分享相应的作者。

确认

作者欣然承认博士P.J.M. Valk b . Lowenberg博士和HOVON(比利时-荷兰Hematology-Oncology)合作集团提供主要的AML患者样本。作者感谢现任的有价值的试剂和π水岛mCherry-EGFP-LC3构造。

这项工作是支持由瑞士国家科学基金会(31003 a_143739和31003 a_173219马里奥·p·Tschan和PBBEP3_146108 Elena Federzoni),瑞士癌症研究(kf - 3409 - 02 - 2014马里奥·p·Tschan),沃纳和七喜Berger-Janser癌症研究的基础(马里奥·p·Tschan),“Stiftung毛皮klinisch-experimentelle Tumorforschung”(马里奥·p·Tschan),和美国国立卫生研究院(1 r01hl116221-01布鲁斯·e·Torbett)。

补充材料

补充1。补充图1:减毒对药物抑制自噬中性粒细胞分化不是由于细胞凋亡增加。(一)3-MA或CQ-mediated抑制自噬损害ATRA HL60细胞的分化。细胞治疗与1 4天μM ATRA单独或结合5毫米3-MA或25μM CQ。CD11b,流式细胞术测定中性粒细胞分化的标志。此外,细胞凋亡受阻使用pan-caspase抑制剂z-VAD-fmk在相同的设置。CD11b平均荧光强度(小额信贷机构)数据均值±s.e.m。 。(b) 3-MA——CQ-mediated抑制自噬导致细胞凋亡增加ATRA-treated HL60细胞。细胞凋亡是由膜联蛋白V染色和半胱天冬酶活动的3/7。细胞治疗在(a)。数据代表均值±s.e.m。三个独立的实验。Mann-WhitneyU测试中, 。

补充2。补充图2:ATG AML患者亚型的基因表达。ATG基因mRNA表达水平自噬起始(a)期间,成核(b), ATG12 (c)和LC3 (d)接合阶段被qPCR量化。分析如图2所示。Mann-WhitneyU测试中, , , 。

补充3。补充图3:ATRA-induced Beclin1-independent AML细胞自噬和嗜中性粒细胞分化。(一个)小Beclin1蛋白质诱导NB4 ATRA分化期间,HL60, HT93 AML细胞。西方滴Beclin1和GAPDH是显示。(b)抑制Beclin1没有废除ATRA-induced自噬以LC3B lipidation。细胞稳定表达争夺控制成分(shCtrl)或shRNA针对Beclin1 (shBeclin1) ATRA治疗,疗程4天。GAPDH是用作加载控制。(c)抑制Beclin1并不妨碍ATRA-induced GFP-LC3 puncta形成。左面板:HL60和NB4 GFP-LC3细胞稳定表达争夺控制成分(shCtrl)或shRNA针对Beclin1 (shBeclin1) ATRA治疗,疗程4天。的百分比GFP-LC3 puncta-positive细胞数量和平均的puncta被共焦显微镜量化。计数意味着±s.e.m。 ;三个独立的实验;n。:not significant. Right panels: starvation- and arsenic trioxide- (As2O3)诱导自噬被推倒Beclin1抑制。细胞被饿死或处理2O3和自噬活动被共焦显微镜评估。计数意味着±s.e.m。 ;三个独立的实验。(d)击倒Beclin1并不影响AML细胞中性粒细胞分化由CD11b表达式。数据均值±s.e.m。; 。Mann-WhitneyU测试中, 。n。:not significant.