文摘

天然多酚羟基黄酮类Myricitrin,据报道具有抗炎作用。然而,myricitrin的确切分子机制对LPS-induced炎症的影响尚不清楚。在目前的研究中,myricitrin明显减轻小鼠急性肺损伤。Myricitrin也明显抑制生产的不,TNF-α,il - 6, MCP-1 RAW264.7细胞巨噬细胞。没有的抑制与减少伴随的蛋白质和mRNA水平的进气阀打开。木菠萝的磷酸化和STAT-1被myricitrin废除。此外,myricitrin抑制STAT1的核移植和DNA结合的活动。JAK-specific抑制剂ruxolitinib模拟myricitrin的抗炎效果。然而,myricitrin没有影响MAPK信号通路。Myricitrin减毒细胞内ROS的生成通过抑制gp91组件的装配phox和p47phox。抑制ROS生成使用NAC或apocynin或沉默gp91phox和p47phox所有证明减少ROS水平抑制LPS-induced炎症反应。总的来说,这些结果证实myricitrin表现出抗炎活动通过阻断木菠萝的激活和下游转录因子STAT1的差别可能源于对这些生产由myricitrin NOX2-dependent ROS。

1。介绍

急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征(ALI / ARDS)指的是各种条件的特点是急性,进步,低氧呼吸衰竭主要引起的炎症反应而不是心原性的因素。内毒素或有限合伙人,革兰氏阴性细菌的细胞壁的组成部分,是一个强烈的炎症反应诱导物。Endotoxaemia造成严重的革兰氏阴性细菌感染容易导致急性肺损伤。临床研究表明,死亡率从阿里和更严重的形式,ARDS,中国患者的变化从30%提高到67.7%,并积极与肺部炎症和胶体渗透压在体内(1- - - - - -3]。暴露的巨噬细胞迅速LPS诱导的分泌促炎介质,如没有,前列腺素E2 (PGE2)、ROS,促炎细胞因子,il - 6、TNF -α,MCP-1。这些细胞因子进一步加剧哮喘病理改变和肺部炎症反应(4]。

toll样受体4 (TLR4)是主要的病原体识别受体为有限合伙人。有限合伙人必然TLR4激活多种信号级联,如MAPK和Janus激酶信号传感器和转录(JAK-STAT)通路的激活5- - - - - -7]。一旦LPS结合TLR4、不同的木菠萝带进近和transphosphorylated。激活木菠萝提供对接网站和招募他们的主要基质,统计数据。统计数据是因此磷酸化,形成人类——或者形成。然后,他们把原子核和调节统计目标基因(8]。在巨噬细胞、STAT1和STAT3牵扯重要转录因子(9,10]。例如,在酪氨酸残基磷酸化STAT3 705对il - 1至关重要β和il - 6生产在LPS刺激后RAW264.7细胞(11]。先前的报道表明,有限合伙人通过TLR4,迅速激活STAT1和基因消融STAT1的防止LPS-induced杀伤力,这表明STAT1 LPS-induced炎症的一个关键的角色。STAT1的S727磷酸化网站选择性地调节TNF -α表达对来自多个刺激做出的反应通常(12]。与此同时,缺乏感应STAT1-deficient小鼠il - 6基因表达是观察到的13]。被木菠萝磷酸化后,数据可以调节急性期蛋白的基因表达如MCP-1和CD40 [14,15]。此外,它已被证明,LPS-induced interleukin-1β(il - 1β在巨噬细胞)生产,部分监管通过JAK216,17]。增殖蛋白激酶(MAPKs)分为三个亚科:细胞外signal-regulated激酶1/2 (ERK1/2), p38和c-Jun n端激酶(物)。MAPKs,另一个主要炎症信号通路,扮演了一个重要的角色在调节几种炎症基因的表达在不同的细胞类型(18]。促炎cytokine-mediated MAPK-mediated JAK / STAT磷酸化是重要的信号通路。

ROS指一系列的高活性分子,包括自由基如羟基自由基、超氧化物,单线态氧,以及nonradical物种,例如,过氧化氢(19- - - - - -21]。而不是简单的有氧新陈代谢的副产品,ROS的重要性首先发现先天免疫在专业在激活吞噬细胞经历一场“呼吸爆发”。现在认识到特定的酶NOX和Duox(双氧化酶)enzymes-seem唯一函数生成活性氧的谨慎监管的方式(22]。此外,作为第二信使,ROS参与细胞生长、粘附、分化、衰老、凋亡以及修改各种信号分子(23,24]。然而,过度生产和活性氧积累有害的细胞和组织。一个不平衡的氧化还原状态起着关键作用的开发和发展各种炎性疾病(25]。

第一个发现氮氧化物在吞噬细胞参与先天免疫反应。当吞噬细胞暴露于细菌,氮氧化物组装多个蛋白质组件并生成快速增加活性氧的水平(26]。氮氧化物成员组成的催化亚基gp91膜结合蛋白phox和第22位phox和四个胞质蛋白p47phox,p67phox,p40phox,小GTPase Rac [27]。完整的NADPH氧化酶激活期间,至少有三个胞质子单元,p47phox,p67phox,p40phox,形成一个复杂的,把膜,与gp91集成phox第22位phox复杂。的gp91phox催化亚基p47phox调节亚基发挥关键作用在急性NADPH氧化酶的活化28]。的磷酸化p47phox打破了细胞内抑制组件和绑定到gp91phox第22位phox复杂,从而增加NADPH氧化酶激活(29日]。我们以前的研究表明,活性氧是上游信号分子诱导炎症反应期间RAW264.7细胞通过一种蛋白激酶和NF -κB通路(30.]。Apocynin、氮氧化物抑制剂对LPS-induced ALI大鼠有保护效应(31日]。在初选THP-1细胞和人类单核细胞,IRAK-dependent p67phox-NOX2交互引起LPS-mediated TLR4激活促进活性氧生成。消除细胞内ROS抑制il - 1β转录和处理(32]。此外,STAT1信号中扮演着一个关键的角色在细胞内氧化还原信号激活的巨噬细胞(33]。通过gp91 NOX2-dependent ROS调节巨噬细胞的免疫反应phox和p47phoxTLR3和交互激活STAT1磷酸化然后促进炎性介质释放(34]。

Myricitrin (3′, 4′, 5′, 5, 7-five hydroxyflavone-3-O -α-L-rhamnoside)(图1)是一种天然多酚羟基黄酮在月桂树的果实富含水果、树枝、树皮、树叶,以及在其他种类的植物35,36]。Myricitrin有多种有益的属性,如抗病毒、抗菌(37],antinociceptive [38),和抗癌的39,40)活动。特别是,myricitrin具有更强的抗氧化和自由基清除活性比其他黄酮醇rhamnosides或槲皮素(41]。此外,强效抗氧化活动myricitrin可能归因于其多羟的结构。先前的报道表明,myricitrin可以抑制acrylamide-induced细胞毒性通过抑制活性氧的生产(42]。髓过氧物酶产生多余的氧化剂,引起氧化应激和氧化组织损伤。Myricitrin不可逆转地可以灭活髓过氧化物酶活性(43]。Shimosaki等人证实,myricitrin抑制TNF -α生产RAW264.7巨噬细胞(44]。此外,myricitrin伊诺表达减少,其产品的生产,不,由有限合伙人(45]。


图1
化学结构的myricitrin (C21H20O12分子量= 464.3763)。

尽管研究表明myricitrin抗氧化活性和抗炎的潜力,只有少数的研究集中在myricitrin是否会影响信号通路参与LPS-activated巨噬细胞的炎症反应。细胞内的具体分子机制参与myricitrin清除LPS-induced ROS尚未完全阐明。在目前的研究中,LPS-induced阿里的小鼠模型是用来评估myricitrin的潜在的抗炎作用。探索的分子机制,我们也评估其影响MAPK和JAK / STAT激活。gp91的作用phox/ p47phox激活ROS生产和myricitrin的抗炎效应进一步调查。

2。材料和方法

2.1。抗体和试剂

Myricitrin得到从阿拉丁工业公司(上海,中国)。cox - 2单克隆和多克隆抗体伊诺,物,phospho-JNK (Thr183 / Tyr185), p38, phospho-p38 (Thr180 / Tyr182), ERK1/2, phospho-ERK1/2 (Thr202 / Tyr204), JAK1, phospho-JAK1 (Tyr1022/1023) JAK2, phospho-JAK2 (Tyr1007/1008) STAT1, phospho-STAT1 (Tyr701), STAT3, phospho-STAT3 (Tyr705) phospho-STAT3 (Ser727),真沸点,gp91phox,钠/钾atp酶-α1,GAPDH是购买从细胞信号技术(美国贝弗利,MA)。抗体p47phox美国是来自圣克鲁斯生物技术(CA)。二次抗体用于免疫印迹都是购自LI-COR生物科学(美国东北林肯)。有限合伙人(从大肠杆菌0111:B4),南汽,DAPI获得Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。CCK-8购买从凯基生物生物技术(南京、JS、中国)。CM-H2DCFDA得到从英杰公司(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。Ruxolitinib和apocynin从Selleck购买化学品(美国休斯顿,德克萨斯州)。所有ELISA试剂盒购自研发系统中国有限公司(上海,中国)。

2.2。DNA结构和RNA干扰

对p47小发夹RNA(成分)构造phox由一个空斑形成单位- gw - 007成分向量(Ncf-1 GenBank_ID: NM_001286037),对gp91 shRNA构造phox由一个空斑形成单位- gw - 007成分向量(Cybb, GenBank_ID: NM_007807)和空斑形成单位- gw - 007是一种消极控制是由霁Kai基因化学技术(上海,中国)。所有的结构是由DNA测序验证。RAW264.7细胞转染shRNA或负控制使用表面(PEI)转染试剂(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)根据制造商的指示。干扰效率证实了免疫印迹分析72 h后使用p47转染phox和gp91phox抗体。

2.3。细胞培养和转染

RAW264.7细胞来源于小鼠巨噬细胞(写明ATCC数量:矿- 71)从昆明研究所细胞库,获得中国科学院(中国昆明,YN)。RAW264.7细胞培养在杜尔贝科修改鹰的介质(美国UT DMEM HyClone,洛根)含10%胎牛血清(美国HyClone,洛根,UT) 37°C公司5%2孵化器。瞬时转染了裴转染试剂(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)根据制造商的指示。在所有情况下,DNA被空规范化的总量控制质粒。

2.4。细胞生存能力分析

在1×10 RAW264.7细胞播种4细胞/ 96 -孔板在对待myricitrin不同浓度(0、10、50、100、150、200年,250年,300年,400年和500年μg / ml)。空白组,只有细胞培养基补充道。24小时后,培养基和10取代μl CCK-8试剂是补充道。然后,在37°C细胞孵化2 h和混合。吸光度(一个)在450纳米测量使用热Multiskan去通用标仪(美国沃尔瑟姆)。细胞生存能力是使用以下公式计算:

2.5。活性氧(ROS)检测

细胞内活性氧的积累,包括H2O2和其他过氧化物,是使用荧光探针CM-H2DCFA监控。在治疗结束时,细胞含有10μ在37°C M CM-H2DCFA孵化在黑暗中30分钟。细胞然后冲洗resuspended PBS。样本检测使用一个奥林巴斯IX51荧光显微镜(日本东京)。

2.6。细胞因子测定

RAW264.7细胞种子在2×105细胞/在12-well盘子被视为表示在图中传说。培养在10000 rpm中收集和离心5分钟。细胞因子水平(PGE2、il - 6、TNF -α文化和MCP-1)上层清液测定使用商用ELISA试剂盒(研发系统),根据制造商的协议。

2.7。亚硝酸盐分析

亚硝酸盐的积累,没有稳定的代谢物,在培养基作为生产的指标来衡量。文化媒体的亚硝酸盐水平测量使用商用格里斯分析工具包(凯基生物生物技术,南京、JS、中国)根据制造商的指示。在550纳米测量吸光度,亚硝酸盐浓度计算相比亚硝酸钠的标准解决方案。

2.8。分离亚细胞分数

细胞刺激被冰冷的PBS的终止。核,胞质膜蛋白提取准备使用核和胞质蛋白提取设备和膜和胞质蛋白分离设备(Beyotime、上海、中国)根据制造商的指示。进行了亚细胞分离的所有步骤4°C。分数纯度测试通过免疫印迹使用GAPDH细胞质标志,真沸点为核标记,钠/钾atp酶-α1作为膜标记。

2.9。西方墨点法

冰冷的PBS和可溶性细胞冲洗两次里帕裂解缓冲(Beyotime、上海、中国)含有蛋白酶抑制剂(罗氏、巴塞尔、瑞士)30分钟在冰上。溶菌产物离心机(15000×g)在4°C 10分钟。等量的可溶性蛋白在SDS变性,在8 - 12% SDS - page凝胶电泳,转移到硝化纤维素膜(美国微孔,波士顿,MA)。转移蛋白抗体与相应的初级孵化一夜之间在4°C。经过广泛洗涤三次(各5分钟Tris-buffered盐水渐变20 (TBST)),蛋白质被孵化了IRDye 800 -共轭免疫球蛋白二次抗体(美国东北LI-COR生物科学,林肯)在室温下1 h。蛋白质是可视化使用LI-COR奥德赛红外成像系统(林肯,美国)。

2.10。定量实时逆转录聚合酶链反应(存在)和rt - pcr

从治疗细胞总RNA提取使用试剂盒试剂(表达载体、佩斯利、苏格兰)和用于合成cDNA使用热科学RevertAid合成第一链cDNA工具包(美国热)根据制造商的指示。执行qPCR使用热Maxima SYBR-Green /火箭qPCR大师混合(美国沃尔瑟姆)。引物序列如下:5′-GGGTCTTGTTCACTCCACGG-3′(向前)和5′-GCTCAGAACAGCACAAGGGG-3′(反向)伊诺和5′-CTGACCCCCAAGGCTCAAAT-3′(向前)和5′-GGGGATACACCTCTCCACCA-3′(反向)cox - 2。伊诺和cox - 2 mRNA物种的相对数量与GAPDH和计算使用2−△△Ct数据分析方法。每个Ct值用于计算平均为每个执行的三个实验的反应。信使rna表达是管家基因GAPDH规范化。使用的引物对PCR用于存在水平是一样的。PCR产品解决在1.5%琼脂糖凝胶,沾染了GoldView。利用rt - pcr验证的有效性和特异性引物。

2.11。电泳迁移率改变分析(emsa)

核蛋白质提取使用核和胞质蛋白提取工具包(Beyotime、上海、中国)根据制造商的指示。蛋白质是由BCA量化的方法(Beyotime、上海、中国)。提取都是储存在−80°C到使用。核提取物进行dna结合蛋白测定使用生物素probe-labelling EMSA工具包(Beyotime、上海、中国)根据制造商的指示。STAT1双链寡核苷酸探针序列用于本研究5′biotin-CATGTTATGCATATTCCTGTAAGTG-biotin3′,由GenScript合成(中国南京)。绑定的反应是在10μl混合物4μl nuclease-free水,2μl (EMSA / gel-shift绑定缓冲区,2μg核提取物,1μl表示探针。为了确保绑定的特异性,我们同时准备未标记的和突变体探针组随着supershift组。30分钟后在室温下孵化,1μl (EMSA / gel-shift加载缓冲区添加和样本通过nondenaturing 6.5%聚丙烯酰胺凝胶电泳在冰浴150 V 2 h。然后,样本转移到尼龙膜和交联15分钟在312 nm紫外线透照器。Biotin-labelled dna蛋白质复合物被检测到Vilber Quantum-ST5凝胶成像系统(中国,北京)和拍照。

2.12。免疫荧光染色法和共焦显微镜

研究信号分子的亚细胞分布顺序RAW264.7细胞应用,首先主要抗体p-STAT1, p47phox,或者gp91phox然后用适当的Alexa萤石555 -共轭或Alexa萤石488 -共轭二次抗体。短暂,RAW264.7细胞固定在4%多聚甲醛在PBS在室温下15分钟,permeabilized 0.1% Triton x - 100在PBS 5分钟,然后阻塞1 h在PBS包含3%牛血清白蛋白。细胞被孵化主要抗体1 h在室温下在阻止缓冲区。在PBS溶液冲洗3次后,样本孵化与适当的二次抗体。幻灯片和0.1复染色μ克/毫升DAPI。捕获图像徕卡TCS SP8共焦激光显微镜系统(德国海德堡)。

2.13。动物

雄性BALB / c小鼠(6 - 8周大,20 - 25 g)获得至关重要的河有限公司(中国,北京)是在无菌环境下保持我们的大学动物中心。老鼠被保存在一个温控房间标准12 h光/暗周期。食物和饮用水随意。在实验开始之前,老鼠接受了至少7天的驯化期。动物实验的所有程序批准的中国实验动物管理立法和执行严格按照指南皖南医学院动物保健和使用委员会。与水合氯醛麻醉下进行所有操作(3.5%的水合氯醛,0.35克/公斤,i.p)。所有的努力都是动物的痛苦降到最低。

2.14。建立急性肺损伤(ALI)模型

一个阿里模型成立于小鼠气管内的注入的有限合伙人。简单地说,老鼠犀牛和0.35克/公斤的水合氯醛,然后,他们收到一个气管内的100年滴注法μ50 g的有限合伙人μl使用3-gauge针的无菌生理盐水。然后,老鼠被放置在一个垂直的位置和旋转1分钟分发滴剂在肺部。四十雄性BALB / c小鼠随机分为4组( ):组、地塞米松组(0.5毫克/公斤),阿里集团和myricitrin(120毫克/公斤)治疗组。对照组的小鼠50只收到μl无菌生理盐水。地塞米松组(0.5毫克/公斤)和myricitrin(120毫克/公斤)治疗组小鼠接受地塞米松和myricitrin 4 h通过阴茎静脉注射前有限合伙人的挑战。12小时后,有限合伙人的挑战,老鼠牺牲进行进一步分析。

2.15。组织病理学分析

有限合伙人管理后12小时,老鼠犀牛和0.35克/公斤的水合氯醛斩首,流血的颈部,防止肺泡充血。启动后肺组织用4%多聚甲醛和捆绑气管开通,每个老鼠的肺组织在4%多聚甲醛固定,石蜡嵌入式,切成5μ米厚的部分。苏木精和伊红())根据常规染色法染色,肺组织的病理改变进行光学显微镜下有经验的观察者,然后,显微照片。

2.16。统计分析

值均值±SD。统计分析是由学生的t以及和单向方差分析。使用SPSS 13.0软件进行计算P值。每个值的 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。Myricitrin对炎性介质和细胞因子的生产

没有和PGE2是重要的炎症介质在网站生成的炎症。我们先前的研究显示,在LPS-stimulated RAW264.7细胞,没有和PGE2的水平大幅增加(30.]。评估myricitrin的抗炎作用,我们首先测量生产没有和PGE2的RAW264.7细胞LPS后治疗。我们的研究结果表明,有限合伙人触发一个明显的增加没有文化媒体和PGE2的水平。Myricitrin抑制浓度的方式生产,但没有影响PGE2(数字2(一个)和2 (b))。据报道,LPS诱导没有生产增加伊诺的表达,和cox - 2是PGE2的诱导酶(46- - - - - -48]。因此,我们发现了蛋白质和伊诺和cox - 2 mRNA水平。正如我们所料,myricitrin减少LPS-induced伊诺表达式。cox - 2水平表现出治疗后没有显著的变化,这与PGE2的结果(数据是相一致的2 (g)- - - - - -2 (j))。有限合伙人可以诱导RAW264.7细胞产生大量的促炎细胞因子(49,50]。因此,我们测量的释放il - 6、TNF -α,MCP-1。不同剂量myricitrin本身没有影响细胞因子的生产;然而,myricitrin明显抑制il - 6、TNF -α,LPS-stimulated集团(MCP-1生产数据2 (c)- - - - - -2 (e))。排除细胞毒性的可能性myricitrin活动抑制炎症反应引起的介质和细胞因子,我们测试了CCK-8测定细胞生存能力。结果表明,不同剂量的范围内使用,细胞生存能力是高于95%,这表明myricitrin没有细胞毒性RAW264.7细胞(图2 (f))。这些结果表明myricitrin抑制LPS-related RAW264.7细胞的炎症反应。

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图2
Noncytotoxic myricitrin水平抑制LPS-induced inflammatory-associated细胞因子和中介生产。RAW264.7细胞治疗myricitrin(100、200和400μ为2 h g / ml)或车辆。接下来,细胞被刺激与有限合伙人(100 ng / ml) 16 h。(一)上层清液,和大量的没有被格里斯试剂测量。(中)PGE2的水平,TNF -α、il - 6和MCP-1测定培养基的ELISA试剂盒。(f) RAW264.7细胞治疗表示浓度myricitrin 24 h。细胞生存能力评估使用CCK-8化验,结果表示为对照组存活细胞的比例。RAW264.7细胞孵化与100、200和400μ克/毫升myricitrin或车辆2 h,然后与LPS刺激(100 ng / ml)。(g-h) 16 h孵化后,细胞溶解产物都是受到西方墨点法利用anti-iNOS和anti-COX-2抗体。GAPDH是内部控制。孵化后8 h,总RNA被隔离起来,伊诺和cox - 2 mRNA rt - pcr测定(我)和存在(j)。每个竖条代表三个独立实验的平均数±标准差。 和 与LPS-stimulated组。
3.2。Myricitrin对LPS-Induced JAK / STAT1和MAPK磷酸化

最近的研究提供了证据表明LPS激活MAPK (ERK1/2, p38和JNK1/2)和JAK / STAT信号通路,从而导致细胞内炎症(51,52]。阐明机制myricitrin的抗炎作用,我们检查了myricitrin是否影响MAPK和JAK / STAT信号激活。图3(一个)显示的磷酸化MAPKs由有限合伙人在30分钟达到顶峰,持续到60分钟。然而,预处理与myricitrin没有明显影响LPS-triggered激活MAPK信号分子(图3 (b))。然后,我们评估了角色myricitrin-mediated STAT信号激活的抗炎效果。见(图3 (d)),STAT1和STAT3激活启动在0.5 h,达到4 h,并削弱了6 h。因此,在后续的实验中,我们使用了4 h点随着刺激时间的统计数据。Myricitrin治疗显著抑制LPS-stimulated STAT1磷酸化。然而,没有明显的变化p-STAT3 myricitrin治疗后(图3 (f))。磷酸化STAT蛋白形成二聚体,把原子核,绑定到特定DNA元素,从而调节成千上万的基因的转录53]。我们提取的细胞质和核蛋白质。免疫印迹结果显示,治疗后核STAT1的蛋白表达增加与有限合伙人和这种反应被抑制在所有myricitrin组。正如所料,LPS促进STAT3易位到细胞核,但myricitrin无法逆转的变化(图4 (c))。共焦显微镜进行进一步观察STAT1的核本地化。如图4 (d),仅在控制和myricitrin团体,STAT1(红色)是分散在细胞质中。有限合伙人的治疗组,STAT1进入细胞核和合并(粉红色)和DAPI(蓝色)。Myricitrin预处理抑制STAT1核易位。测量STAT1的转录监管活动,我们进行了与相应biotin-labelled EMSA STAT1的共识序列。我们发现绑定活动增加STAT1的核提取物治疗组有限合伙人的准备。增强亲和力显著地抑制了myricitrin(图4 (e))。

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Noncytotoxic myricitrin水平抑制LPS-induced木菠萝和统计激活,但没有对MAPKs磷酸化的影响。RAW264.7细胞与LPS刺激(a) 0, 5、10、15、20、25、30、35岁,40岁,45岁,50和60分钟;(c) 0、2、5、10、15、30分钟;和(d) 0、0.5、1, 2, 4, 6 h。此外,RAW264.7细胞使用myricitrin在100年,200年和400年μg / ml 2 h,然后用LPS刺激30分钟(b), 15分钟(e)和4 h (f)。总蛋白受到10% sds - page其次是西方墨点法使用特定抗体phospho-ERK, phospho-JNK,和phospho-P38 (a, b);phospho-JAK1和phospho-JAK2 (c、e);和phospho-STAT1 phospho-STAT3 (d, f)。Nonphosphorylated抗体是内部控制。每个值表示均值±SD,代表三个独立实验的结果。 与LPS-stimulated组。
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图4
Noncytotoxic myricitrin水平抑制LPS-induced木菠萝激活,这是需要LPS-induced STAT磷酸化和核易位以及炎症相关的物质。(一)RAW264.7细胞处理有限合伙人(100 ng / ml) 6 h 10的存在与否μM ruxolitinib 2 h。STAT1和STAT3磷酸化的蛋白免疫印迹分析使用特定抗体。(b) RAW264.7细胞使用10μM ruxolitinib或20μM NAC 2 h和100 ng / ml LPS刺激16 h。伊诺和cox - 2蛋白的表达水平是由免疫印迹。RAW264.7细胞使用的myricitrin表示浓度2 h在孵化有限合伙人(100 ng / ml) 6 h。(c)核和胞浆蛋白提取。等量的蛋白质和抗体进行免疫印迹分析STAT1和STAT3。GAPDH是用作细胞质内部控制,真沸点是用作原子核内部控制。(d)进行免疫染色与STAT1(红色)和原子核与DAPI染色(蓝色)。规模的酒吧:10μm。核易位STAT1的荧光显微镜下观察。(e)核提取物进行分析EMSA STAT1活动的存在与否过多冷探测器,突变体探针或STAT1抗体。(f)与ruxolitinib RAW264.7细胞治疗(10μ为2 h M)。接下来,细胞被刺激与有限合伙人(100 ng / ml) 16 h。水平的肿瘤坏死因子-α、il - 6、MCP-1, PGE2文化上层清液由ELISA测定。大量的没有被格里斯试剂测量。从三个不同的领域获得的数据意味着±SD。的一个代表数据来自三个单独的实验了。 和 与LPS组比较。

JAK1和JAK2上游激酶的统计数据。LPS诱导激活JAK1和JAK2从2分钟到30分钟,并激活达到5分钟(图3 (c))。这个响应的JAK2大大被myricitrin治疗剂量依赖性的方式。改变p-JAK1水平低于那些p-JAK2 myricitrin治疗后(图3 (e))。进一步确定抗炎作用由myricitrin通过抑制木菠萝/ STAT1的信号通路,我们探索JAK-specific抑制剂ruxolitinib是否可以模拟myricitrin的抗炎效果。我们发现,10μM ruxolitinib可以有效地抑制磷酸化的下游信号分子STAT1和STAT3(图4(一))。结果表明,ruxolitinib能显著抑制伊诺表达和弱抑制cox - 2的表达(图4 (b))。此外,生产的炎性细胞因子il - 6、TNF -α,MCP-1以及炎性介质不,明显抑制了ruxolitinib(图4 (f))。一般来说,myricitrin发挥抗炎作用通过抑制JAK / STAT1激活,防止STAT1的磷酸化,从而避免了进入细胞核,减少STAT1的转录活动。

3.3。Myricitrin LPS-Induced ROS生产的影响

过多的活性氧水平RAW264.7细胞可以诱导炎症反应通过激活的转录因子,包括NF -κB和统计数据(30.,54]。确定的ROS作用LPS-triggered炎症和ROS和myricitrin之间的关系,我们测量使用荧光探针CM-H2DCFA ROS生产。见图5(一个),LPS刺激产生大量的活性氧,减毒myricitrin治疗后。此外,预处理RAW264.7细胞N-acetyl-L-cysteine (NAC)、活性氧清除剂,显著抑制LPS-induced伊诺和cox - 2蛋白表达(图4 (b))。如图5 (b),南京也降低il - 6, TNF -α,MCP-1,没有生产,而显示出疲软影响PGE2的生产。因此,myricitrin可能抑制LPS-associated炎症反应通过阻止细胞内ROS生成在LPS-stimulated RAW264.7细胞。

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图5
Noncytotoxic myricitrin水平抑制NOX2-derived ROS生成所需的ROS LPS-induced JAK / STAT1激活炎性细胞因子和中介生产。(一)RAW264.7细胞使用myricitrin 2 h,然后接触到有限合伙人(100 ng / ml)为5分钟。治疗后,细胞被洗PBS和流式细胞仪测得的荧光强度是描述的材料和方法。(b) RAW264.7细胞孵化有或没有NAC (20μ米2 h,然后用LPS刺激(100 ng / ml) 16 h。文化媒体化验没有生产格里斯反应和肿瘤坏死因子-αil - 6, MCP-1,产生PGE2 ELISA。(c) RAW264.7细胞使用apocynin (500μ米)2 h,然后接触到有限合伙人(100 ng / ml)为5分钟。细胞治疗是一样的(a)。RAW264.7细胞与apocynin孵化(500μM)为2 h,然后用100 ng / ml LPS刺激16 h (d), 4 h (e)和15分钟(f),细胞收获和等量的整个细胞溶解产物进行了分析通过免疫印迹anti-iNOS或anti-COX-2抗体(d), p-STAT1或p-STAT3抗体(e), p-JAK1或p-JAK2抗体(f)。免疫印迹检测GAPDH或nonphosphorylated抗体估计protein-loading控制每个车道。数据均值±SD值三个独立的实验。 和 与LPS-treated组。
3.4。Myricitrin对LPS-Stimulated NADPH氧化酶活性的影响

NADPH氧化酶类细胞活性氧的主要来源,生成的外源性物质,细胞因子、细菌入侵(55,56]。图5 (c)表明NADPH oxidase-specific抑制剂apocynin明显阻塞LPS-induced ROS生成。此外,预处理apocynin显著降低伊诺和cox - 2表达(图5 (d))和抑制激酶的磷酸化,STAT1(数字5 (e)和5 (f))。结果促使我们评估是否NADPH氧化酶类的目标myricitrin抑制炎症反应。首先,我们探讨了NADPH氧化酶类有限合伙人治疗前后的变化。的p47phox调节亚基膜催化亚基gp91phox在激活NADPH氧化酶类(扮演关键角色57]。然而,有限合伙人治疗期间,p47的蛋白质含量phox和gp91phox表现出没有明显变化(图6(一))。先前的研究已经证实,在细胞活化,p47的胞质组件phox磷酸化并迁移到质膜,它与gp91同事吗phox激活NADPH氧化酶类,产生超氧化物阴离子(57,58]。因此,我们观察到p47的亚细胞定位phox和gp91phox。我们的研究结果表明,p47 LPS诱导减少phox在细胞质溶解产物水平,myricitrin逆转这一趋势。同时,膜溶解产物,有限合伙人治疗导致p47增加phox,myricitrin减少了p47phox内容在这些分数。gp91phox存在于细胞膜溶解产物从每个实验组(图6 (b))。这些结果暗示可能促使p47有限合伙人治疗phox从细胞质膜。接下来,我们进一步发现NADPH氧化酶亚基的位置用激光共聚焦显微镜。如图6 (c)在静息状态,p47phox分散在细胞质中,gp91吗phox分布在膜。他们之间没有重叠。LPS刺激后,p47phox迁至膜,与gp91吗phox,这是用黄色突出显示。Myricitrin预处理完全推翻了这种变化。结果表明,激活p47phox转移到质膜和与gp91相关phox亚基组装成一个活跃的酶复杂。

(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图6
Noncytotoxic myricitrin抑制p47水平phox转移到膜,抑制p47之间的互动phox和gp91phox。(一)RAW264.7细胞治疗与有限合伙人(100 ng / ml)表示时间点。细胞溶解产物制备和使用p47受到西方墨点法phox和gp91phox。400 (b) RAW264.7细胞被使用μ为2 h g / ml myricitrin然后被孵化有限合伙人(100 ng / ml),持续15分钟。分析了胞质和膜分数p47的检测phox和gp91phox通过免疫印迹分析。(c) RAW264.7细胞(b)被视为类似。双免疫染色和anti-gp91执行phox(绿色)和anti-p47phox(红色);核与DAPI染色(蓝色)。规模的酒吧:10μm。结果表示为均值±SD三个独立的实验。 与LPS-treated组。

进一步澄清的作用NAPDH氧化酶类LPS-initiated炎症和确定ROS的上游目标分子myricitrin调节胞内炎症,我们构造的三个成分组织p47干扰质粒phox和gp91phox并发现了干扰效率。图7(一)表明p47phoxshRNA2有效抑制p47phox表达式。在4μg p47phoxshRNA2转染组,抑制率达到80%。与此同时,gp91phox内生gp91 shRNA1撞倒了phox表达式。转染4μg gp91phoxshRNA1质粒成RAW264.7细胞抑制gp91的大约70%phox表达式。在随后的实验中,我们选择上述干涉条件。正如所料,在有限合伙人测试组,ROS水平有限合伙人治疗后产量明显提高。p47phox或gp91phoxshRNA单一转染显著降低细胞内ROS水平相比炒shRNA转染。p47phox和gp91phoxshRNA cotransfection有更好的抑制作用。在对照组,转染RAW264.7细胞分别与炒成分,p47phox成分或gp91phox成分,没有对基底ROS表达水平(图的影响7 (b))。免疫印迹分析表明p47phox或gp91phox击倒减少LPS-triggered伊诺表达和JAK / STAT1磷酸化,而同时p47击倒phox和gp91phox达到最好的抑制作用(数字8(一个),8 (b),8 (c))。

(一)
(一)
(b)
(b)
图7
p47phox和gp91phoxRNAi抑制细胞内ROS的生成。(一)暂时RAW264.7细胞转染1μg, 2μ4 g,或者μg pFU-GW-p47phox,pFU-GW-gp91phoxshRNA质粒或pFU-GW质粒向量,分别。转染48 h后,细胞溶解产物受到使用p47抗体免疫印迹phox和gp91phox。GAPDH是用作加载控制。(b) RAW264.7细胞分别与shRNA-p47转染phox和shRNA-gp91phox或cotransfected shRNA-p47phox和shRNA-gp91phox。炒RNAi组与pFU-GW细胞转染质粒向量。后48 h转染细胞与LPS刺激(100 ng / ml)为5分钟。治疗后,细胞被洗PBS和流式细胞仪测得的荧光强度是描述的材料和方法。这些独立实验重复三次,结果表示为平均数±标准差。 和 和炒RNAi组。
(一)
(一)
(b)
(b)
(c)
(c)
图8
p47phox和gp91phoxRNAi抑制LPS-induced JAK / STAT1激活和伊诺和cox - 2表达下降。分别RAW264.7细胞转染shRNA瞄准p47phox或gp91phox和cotransfected p47phox和gp91phox成分。炒RNAi组与pFU-GW转染质粒向量。转染后48小时,RAW264.7细胞与LPS刺激(100 ng / ml) 15分钟(a), 4 h (b)和16 h (c),细胞溶解产物是准备和接受西方墨点法利用phospho-JAK1和phospho-JAK2抗体(a), phospho-STAT1抗体(b),和anti-iNOS anti-COX-2 (c)的抗体。GAPDH和nonphosphorylated抗体估计protein-loading控制每个车道。p47phox和gp91phox估计识别干扰的影响。每个酒吧代表三个独立实验的平均数±标准差。 和 和炒RNAi组。
3.5。Myricitrin对LPS-Induced急性肺损伤(ALI)的老鼠

有限合伙人吸入是一个广泛使用的模型的急性肺损伤(ALI),特征是炎症细胞的浸润,牙槽间的小叶间隔增厚、肺水肿、片状出血、透明膜形成,肺泡腔中分泌,有些崩溃肺泡(59- - - - - -61年]。评估的影响myricitrin阿里,肺组织的组织学变化调查)染色后12 h有限合伙人吸入。如图9,控制动物的肺组织表现出一致的肺泡小叶结构完整性和干净的肺泡腔,在肺泡空间没有出血或渗出。在模型动物的肺,注射LPS引起明显的炎性细胞浸润在气道和肺泡空间,这表明阿里的成功模式。然而,这些病理改变引起的有限合伙人被myricitrin治疗明显减弱。地塞米松是类固醇消炎药,用于治疗细菌性肺炎和广泛的临床使用。在我们的实验中,我们使用地塞米松作为一个积极的控制药物评估myricitrin的抗炎效果。图9表明地塞米松大大改善了阿里的病理变化。Myricitrin地塞米松治疗效果相似。因此,myricitrin临床抗炎药物具有巨大的潜力。

(一)
(一)
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(b)
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(c)
(d)
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图9
myricitrin对组织病理学变化的影响小鼠的肺组织LPS-induced急性肺损伤(ALI)。老鼠接受单剂量的滴注气管内的50μl盐水有或没有(5毫克/公斤)有限合伙人,和一些LPS-exposed老鼠用myricitrin预处理(120毫克/公斤)或地塞米松(0.5毫克/公斤)通过阴茎静脉注射4 h。有限合伙人挑战十二小时后,小鼠安乐死与乙醚。整个肺组织的老鼠与多聚甲醛影射。从每组处理肺组织学评估后12 h有限合伙人的挑战。(一)对照组;(b)有限合伙人(5毫克/公斤)组;(c)地塞米松(0.5毫克/公斤)+有限合伙人(5毫克/公斤);(d) myricitrin(0.5毫克/公斤)+有限合伙人(5毫克/公斤)。代表肺组织学的变化从小鼠获得不同的组织所示(苏木精和伊红染色,放大:400 x)。

4所示。讨论和结论

激活的巨噬细胞通过过度生产各种促炎细胞因子和介质,活性氧和活性氮物种,这些都进一步加剧炎症,炎症中发挥核心作用和宿主防御机制(62年]。在这项研究中,我们证实myricitrin抑制生产的不,TNF -α巨噬细胞il - 6,和MCP-1 LPS-stimulated RAW264.7细胞。体内,我们也证明了myricitrin缓解小鼠急性肺损伤和抑制LPS-induced巨噬细胞的炎症反应。Myricitrin明显降低肺组织炎性细胞的浸润。此外,myricitrin伊诺的信使rna和蛋白质水平,降低催化酶的产生。这表明myricitrin对生产的影响是由于它能够减少伊诺mRNA代然后抑制伊诺蛋白表达。这些结果表明,myricitrin有抗炎作用,但作用的确切机制尚未完全阐明。

STAT1经历快速磷酸化对由多个TLR配体刺激做出的反应。磷酸化STAT1新兵TLR4和调节基因直接参与生产的促炎细胞因子和介质,这表明一个关键的角色在TLR4-induced STAT1炎症(12]。我们的研究结果表明,myricitrin抑制LPS-induced STAT1磷酸化剂量依赖性的方式。我们进一步证明myricitrin JAK1/2抑制磷酸化。Myricitrin也抑制核易位和DNA结合LPS-activated STAT1的RAW264.7细胞。Ruxolitinib,特定JAK1/2抑制剂,完全模拟myricitrin的抗炎作用,包括抑制肿瘤坏死因子-αMCP-1, il - 6,没有生产,以及STAT1激活和进气阀打开蛋白质的一代。这些结果表明,myricitrin发挥抗炎作用通过STAT1信号机制涉及上游目标,导致核易位和STAT1的DNA结合。

STAT1, STAT3和STAT4守恒MAPK磷酸化网站,Pro-X-Ser-Pro。治疗的细胞干扰素-β导致MAPKs身体与STAT1的α亚基。所有这些数据暗示可能会有功能MAPK和JAK / STAT信号通路之间的通信(63年- - - - - -65年]。在我们的研究中,LPS诱导磷酸化MAPKs,但myricitrin预处理没有影响MAPKs的激活。细胞因子和白介素- 2规范统计磷酸化MAPK-independent的方式(8]。因此,我们推测在LPS-stimulated RAW264.7细胞,激活STAT1没有通过MAPK通路。

新出现的证据表明,LPS刺激TLR4和促进巨噬细胞中活性氧的产生66年]。尽管他们的氧化活动,最近的研究表明,ROS作为第二信使的上游不同生物反应涉及TLR-induced先天免疫反应,包括自噬和炎症(24,67年,68年]。我们观察到细胞内ROS水平急剧上升后有限合伙人的待遇。不同浓度的myricitrin有效减少ROS生成的数量。最高剂量组,ROS水平降至背景水平。活性氧清除剂NAC治疗后,清除细胞内ROS, LPS-induced释放肿瘤坏死因子-α、il - 6、MCP-1不,伊诺表达式、被抑制了。我们推测,myricitrin可能起到抗炎作用,调节细胞内的氧化应激水平。

NOX2-dependent ROS生成所需TLR4-dependent炎症反应在巨噬细胞69年]。子单元gp91phox和p47phoxNADPH氧化酶是必不可少的组成部分。我们的研究结果表明,myricitrin没有影响gp91的蛋白质表达水平phox和p47phox。ROS生成似乎不相关的减少氮氧化物的表情而更有可能与减少活动。进一步的研究证实,p47phox被招募进和gp91细胞膜和绑定吗phox有限合伙人后治疗。与此同时,myricitrin完全逆转的作用有限合伙人。Apocynin NOX2-specific抑制剂,进行细胞内ROS,减少促炎细胞因子和介质的生产。Apocynin也抑制JAK1/2和STAT1的激活。myricitrin相比,apocynin显著抑制cox - 2的表达。apocynin排除非特异性的影响,我们撞倒了p47phox和gp91phox。与p47分别转染细胞phox或gp91phox,LPS-induced细胞内活性氧积累,木菠萝/ STAT1激活,伊诺表达式被削弱。的p47phox和gp91phoxcotransfection集团取得了最好的抑制作用。蛋白质水平的cox - 2转染后没有显示出明显的变化。此外,myricitrin STAT3的LPS-triggered激活没有明显的影响。据报道,STAT3主要分布在线粒体和监管下由线粒体过氧化氧化应激(70年]。我们推测myricitrin主要调整NOX-derived ROS水平,STAT3在受线粒体过氧化的影响。cox - 2 myricitrin之间的变化差异,apocynin, RNAi疗法,以及不同的影响myricitrin STAT1和STAT3进一步证实,myricitrin氮氧化物酶复杂的目标。

总之,如图10、LPS-boosted ROS生成激活JAK1 / JAK2至关重要,促进STAT1磷酸化和核易位,起着关键作用的炎症介质和细胞因子的释放。Myricitrin阻塞木菠萝/ STAT1清除细胞内ROS信号转导。此外,myricitrin抑制氮氧化物的组装的组件(gp91酶复杂phox和p47phox)。NOX-derived ROS的关键作用myricitrin LPS-induced调节炎症建议myricitrin有可能成为抗炎药具有特定目标的能力。


图10
示意图说明该信号通路参与myricitrin LPS-induced的抑制炎症反应在RAW264.7细胞蛋白质。NOX2 (gp91 LPS激活phox/ p47phox)途径增强活性氧生成,进而启动激活的JAK1 JAK2、STAT1和最终诱导肿瘤坏死因子-αil - 6, MCP-1,没有生产和伊诺RAW264.7细胞中表达。此外,预处理myricitrin抑制通过gp91 LPS-induced炎症phox/ p47phox抑制。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突与目前的研究有关。

作者的贡献

示气和Zunyong冯本研究同样起到了推波助澜的作用。

确认

这项工作是支持由中国国家自然科学基金(批准号31301171和31301171);安徽省自然科学基金,中国(通用项目)(批准号1508085 mh149);高校省级青年人才基金重点项目(批准号2013 sqrl055zd);皖南医学院开始研究基金会项目(批准号201223);活性生物大分子研究省级重点实验室项目(批准号1306 c083008);安徽省高校自然科学研究项目(批准号 KJ2016SD59); Colleges and Universities Outstanding Young Talent Support Programme Key Projects (Grant no. gxyqZD2016173); and Wuhu Technology Bureau Production and Research Cooperative Special Foundation (Grant no. 2013cxy04).