文摘

尽管有限的生物利用度和快速退化,膳食花青素抗氧化剂与心血管益处。本研究测试的假设花青素的抗氧化保护授予,飞燕草色素,是由调制的内源性抗氧化防御系统,由于其降解产物没食子酸。花翠素被发现迅速降低(t1/2 ~ 30分钟),生成没食子酸作为主要降解产物。花翠素和没食子酸在高(100 oxygen-centred自由基生成μ米)的浓度在体外。在培养的人脐静脉内皮细胞氧化应激模型,飞燕草色素和没食子酸的抗氧化保护作用显示hormesic概要;One hundred.μM浓度的细胞毒性,但相对较低的浓度(100 nM-1μ米)保护细胞,增加细胞内谷胱甘肽。我们得出这样的结论:花翠素本质上是不稳定的,不可能带来任何直接的抗氧化活性在活的有机体内然而,提供抗氧化保护细胞在低浓度。这个悖论可以解释为降解产物的能力,没食子酸,带来好处。研究结果很重要,理解花青素赋予的保护模式和强化行为的必要性在体外实验在生物相关的浓度。

1。介绍

花青素的多酚类植物化学物质,虽然不是必不可少的生存,是有助于健康的因素fruit-rich饮食的好处。从心血管的角度来看,多酚与减少相关死亡率和心脏病有关,心肌梗死的发生率较低(1,2),降低血压(3- - - - - -5),和防止动脉粥样硬化6- - - - - -10]。酚醛树脂的机制发挥他们的护心行动尚未完全了解,但抵御氧化损伤和血管功能的调制强烈牵连(5,9,11- - - - - -17]。

活性氧(ROS)发挥重要作用在心血管疾病11,18,19]。Oxygen-centred自由基有细胞毒性和促炎的影响血管内皮细胞(20.,21];过氧化物(O₂^∙−)容易与心血管代理反应,生成高细胞毒性过氧亚硝基(ONOO⁻;(22])。此外,ROS-mediated至关重要的脂质氧化,尤其是低密度脂蛋白(LDL),是一个关键事件在动脉粥样硬化的发病机制23]。ROS也通过促进血小板凝血激活(18]。ROS的综上所述,这些特征影响atherothrombotic疾病的关键阶段,从内皮功能障碍和抑制保护低密度脂蛋白的氧化修饰和促进炎症和血栓形成(19]。消除活性氧的抗氧化剂是一个有吸引力的治疗选择。

花青素在范围广泛的丰富的浆果(如黑莓、黑醋栗,覆盆子,红葡萄,小红莓,和草莓)和被认为是强有力的抗氧化剂(因多酚结构7,24- - - - - -30.]。至少有一些红酒是介导的心血管益处的花青素,特别是花翠素(12,17,31日,32]。之间的联系一直是伪造的花青素的抗氧化潜力及其保护作用的心血管健康,但是他们的特点是低生物利用度(~ 1μ米)和所需的浓度诱导直接抗氧化活性是无法实现的在活的有机体内(12,14,33- - - - - -38]。这方面通常被视为一个重大缺陷的观点中,多酚调节的好处归功于红酒。

Berry-derived花青素通常在更稳定的糖基化的形式,但在消费之后,他们接受消化过程,剥夺他们的糖基,释放不稳定糖苷配基(34,36]。在生理条件下,无糖花青素可以进一步降解成更小的酚类化合物(例如,酚酸和醛(39- - - - - -42])。的形式被吸收和血液中存在尚不清楚,但很可能降解产物(简单酚酸和/或醛)可能在数量上超过了父母化合物(11,40]。这个细节很重要,因为酚类化合物已被证明有矛盾prooxidant属性(33,43- - - - - -46),一个概念,把质疑父摄入多酚可以带来直接的抗氧化活性在活的有机体内。

越来越认识到,酚类化合物,包括花青素,可以与各种分子的目标和影响多个信号通路,提供另一种假定的机制来提供抗氧化活性与低浓度发现是一致的在活的有机体内(13,47- - - - - -55]。本研究测试的假设出发保护作用与生物相关的花青素的浓度,飞燕草色素,在培养的内皮细胞由upregulation内源性抗氧化防御系统的主要代谢物,没食子酸。

2。材料和方法

2.1。材料

化学物质、试剂和耗材购买从以下制造商:花翠素氯化(Extrasynthese、Genay、法国);DMSO、抗坏血酸、甲酸、没食子酸,明胶溶液(B型2%,H₂O)、内皮细胞生长补充丙酮酸钠,消息灵通的解决方案,0.5%胰蛋白酶/ EDTA (1 x)、铁(iii)氯(FeCl₃),2,4,6-tri (2-pyridyl)年代三嗪(TPTZ)和硫酸亚铁七水硫酸锌(FeSO₄h·7₂O) (Sigma-Aldrich,普尔,多塞特郡,英国);基础培养基M199(+厄尔,+谷酰胺,+酚红)和基底介质M199(+厄尔,+谷酰胺,−酚红,和+碳酸氢盐)(表达载体,佩斯利,英国);焦棓酸、甲醇、乙腈、乙醇、丙酮、Coomassie (Bradford)试剂盒,醋酸钠,和盐酸(热费希尔科学有限公司、拉夫堡、英国);Tempone-H盐酸和ROS-ID®总ROS /过氧化物检测设备(英国埃克塞特恩佐生命科学有限公司);PBS(没有钙和镁),胎牛血清,penicilin /链霉素(100 x),和牛血清白蛋白(PAA实验室GmbH,派斯克,奥地利);HUVECs(细胞应用Inc .)、圣地亚哥、钙、美国);肝素钠(雷克斯汉姆Wockhardt有限公司、英国);谷胱甘肽、过氧化氢酶和SOD测定(开曼化学公司,安阿伯市,美国);和过滤瓶(汤姆森单步标准滤瓶)(汤姆森仪器公司、海边、钙、美国)。

2.2。花翠素测定降解概要文件和产品组织培养基

2.2.1。分光光度法

了解飞燕草色素的降解模式很重要在我们的实验条件下起初为了通知后续功能实验。花翠素(200μM;最低浓度很容易衡量的分光光度法)分解测试在苯酚red-free组织培养基(pH值7.4,37°C)含0.2% DMSO,单独或在过氧化物的存在发电机,焦棓酸(100μ米),或抗氧化剂和还原剂,抗坏血酸(5毫米)。花翠素增色的将一个吸收峰的变化到一个更高的价值,取决于环境条件(56]。吸光度(λ= 585海里)因此测量(第一小时每10分钟,然后每小时连续7小时,最后在24 h)使用板读者(Varioskan SkanIt Flash与操作软件2.4版本;英国拉夫堡热费希尔科学有限公司;加热到37°C)。每个实验进行三次( )。

2.2.2。质/女士

花翠素(100μ米)在组织培养中孵化30分钟(湿润孵化器(Heracell 150有限公司₂热费希尔科学、拉夫堡、英国),37°C, pH值7.4,5%的股份有限公司₂在黑暗中)。只控制样本处理车辆(0.2% (v / v)DMSO)。30分钟后所有样本收集并提取如下:从收集沉淀蛋白质组织培养基(1毫升)通过添加一个相同体积的缓冲(冰冷100%甲醇提取包含0.2%甲酸(v / v))。样本被保存在冰1 h,离心前(5分钟,室温,10000)。上层清液被除去,不停地在冰上。颗粒在冰冷resuspended 50%甲醇含0.1%甲酸(v / v)和离心机。提取过程重复三次,以提取尽可能多的酚类化合物。上层清液都结合起来,再次离心(3分钟,5000)。收集到的上层清液保持在−80°C之前使用液相色谱-光谱法分析(质/ MS)。

提取的数量被减少到干燥蒸发真空浓缩器(SpeedVac热费希尔科学有限公司、拉夫堡、英国;在100年之前没有热量)再悬浮μl 50%的甲醇含0.1%甲酸(v / v)。样本转移到过滤瓶(聚四氟乙烯,0.45μ由质膜)之前分析/女士(LTQ Orbitrap XL质装有Acella 600泵,Acella光电二极管阵列检测器(PDA)探测器,和Acella autosampler)在积极和消极离子模式。掌上电脑扫描的波长范围λ= 200 - 600 nm。有两个事件:扫描傅里叶变换质谱全扫描(80 - 2000 m / z)分析之后,视MS / MS使用正常化碰撞最激烈的离子能量的45%。毛细管温度设定在300°C,鞘气体在40 psi和辅助气体在5 psi。样品(8μl)在0.1%甲酸的梯度筛选了超纯水(a), 0.1%的甲酸水乙腈(B)的50%,95%和0.1%的甲酸水乙腈(C)在C18柱(50×2.1毫米,1.9海波西尔金)700的流量μl / min。准确的质量数据进行分析使用居民Xcalibur战浏览器软件。实验进行3次( )。

2.3。抗氧化活性:收紧化验

抗氧化电位测量使用等离子体(收紧)的铁还原能力测定根据Benzie所描述的过程和应变57),小的修改。简单地说,100年μl 1%的(v / v)测试样本和900μl刚做好的收紧的试剂,由20毫米氯化铁(水),10毫米TPTZ盐酸(40毫米),和300毫米醋酸钠缓冲(pH值3.6)的体积比1:1:分别为10。4分钟孵化后吸光度测定λ= 593海里的分光光度法(Ultrospec 2100专业版;通用电气医疗集团生命科学,小都,英国;(57])。硫酸亚铁(FeSO₄在水)作为参考标准。

2.4。Prooxidant测量:EPR谱分析

电子顺磁共振(EPR)是一种光谱技术,促进了检测的化学物种具有一个或多个未成对电子,如自由基和过渡金属离子。EPR谱检测自由基明确(58]。措施的吸收能量的未配对电子(s)自由基物种的存在磁场。但是,自由基是高活性化学物种和结果是非常短暂的。因此,我们使用了EPR spin-trapping技术为了确定激进的生产由选定的酚类化合物。EPR自旋捕获是一种方法,是基于一个自由基的反应与EPR-silent旋转陷阱。这个反应的产物,EPR-active加合物,比父母更稳定的激进和展品多行EPR谱(图特征1 (b))[59]。一个不成对电子的EPR谱只包含一行。多行EPR谱生成的未配对电子的磁自旋之间的交互和邻近的核自旋核自旋的陷阱;这就是所谓的超精细分裂(图1 (b))[59,60]。Tempone-H(盐酸6-tetramethyl-4-oxo-piperidine 1-hydroxy-2 2 6日)经常用于检测和量化等oxygen-centred自由基的超氧化物和羟基自由基61年- - - - - -63年这里使用),为了评估飞燕草色素的prooxidant潜力和没食子酸。技术不能区分不同oxygen-centred自由基,但不包括nonradical物种通过spin-trap的选择,可以选择为一个特定的类激进的物种(例如,Tempone-H oxygen-centred自由基)。

酚类化合物(花翠素和没食子酸),浓度,包含生理相关范围(10 nm - 100μ米),准备在组织培养基添加之前Tempone-H(10毫米的股票,溶解在超纯水)来生成最终的浓度2毫米。50μl容量的样本被卷入一个玻璃毛细管和插入一个电子顺磁共振波谱仪(微型示波器MS200光谱仪、Magnettech,德国,以下参数设置:磁场(B₀)3343.48克,扫描49.10 G,扫描时间60秒,光滑的1秒,4096步,调制2000毫克,微波衰减10 dB,获得2×10¹)。电子顺磁共振光谱获得的一阶导数。

4-oxo-tempo形成加合物生成一个3线EPR谱特征集中在3340高斯。峰值强度成正比的浓度加合物形成(图1 (b))。Pro - /测试化合物的抗氧化活性是由测量4-oxo-tempo信号强度产生30分钟后潜伏期(37°C在黑暗中)在组织培养中包含花翠素或没食子酸。组织培养基仅作为控制。Prooxidant酚类化合物的活性与自旋加合物的形成与车辆相比,增加抗氧化活性而导致减少自由基形成与汽车相比。

2.5。人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)文化

HUVECs从池的主要文化传播人类脐带,凯利VEGF-R2, Etk / Bmx,以挪士,Tie2,和妳(细胞应用Inc .)、圣地亚哥、钙、美国),和欧洲提供的细胞培养的集合。HUVECs亚文化是根据供应商的协议,与一些细微的修改。简单地说,这些细胞被种植在烧瓶或板上涂上一层凝胶(稀释1:1 (v / v)和PBS),在生长介质,根据菜谱准备前面描述的(64年]。基础培养基M199(+厄尔和+谷酰胺)和20%(补充v / v胎牛血清,100μ20 g / ml青霉素和链霉素,μ10 g / ml内皮细胞生长补充μg / ml肝素,消息灵通的20毫米,2毫米丙酮酸钠作为额外的能源。HUVECs是生长在湿润孵化器(Heracell 150有限公司₂热费希尔科学、拉夫堡、英国)37°C, 5%的公司₂,通过每3 - 4天,直到他们达到80%融合,由视觉评估。在接种过程中,细胞被取消使用胰蛋白酶/ EDTA(0.05% / 0.02%)和温和的风潮。细胞数使用血球计和镀在75厘米²水瓶(7.5×10⁵细胞)进行进一步的文化,或到6-well 24-well板块(1×10⁵和2×10⁴每口井的细胞,分别地)进行实验。所有研究进行80%汇合的HUVEC文化在第六段。

2.6。细胞Treatment-Phenolic和氧化剂制备

样品含有酚类化合物(1 nm - 100μ米)准备在温暖(37°C)苯酚red-free组织培养基。此外,一些花翠素样本被孵化的培养基1 h应用细胞以启动之前花翠素退化和获得本地飞燕草色素及其降解产物组成的混合物。获得的混合物被称为“花翠素岁”用于随后的细胞培养实验。

三氧化应激的细胞培养模型被用于研究:焦棓酸(超氧化物自由基生成器,O₂^∙−;(65年))、过氧化氢(H₂O₂;(66年])和绿脓菌素(细胞内O₂^∙−发电机,通过诱导线粒体功能障碍;(67年])。氧化剂都准备在温暖(37°C)苯酚red-free组织培养基剥夺丙酮酸钠,这是已知的过氧化氢基清除剂,因此不适合氧化应激模型研究[68年]。

因为HUVECs汇集来自不同的捐赠者,氧化剂批次的变化的敏感性。氧化剂的浓度因此优化测试实验为每批细胞之前,为了选择一个合适浓度的氧化剂轻快,导致高频的,但却很容易被损失的细胞生存能力24 h后(20 - 70%)。浓度的变化从100焦棓酸用于测试实验μM - 180μM。

2.7。细胞生存能力评估:台盼蓝排斥和MTT试验

台盼蓝排斥试验是用于常规细胞计数,但是一些研究也用于确定水平的细胞毒性测试酚醛的代理。胰蛋白酶化后,台盼蓝(0.1%v / v)添加到细胞培养(1:1,5分钟)细胞计数之前使用一个血球计(彩色和清白的)。生活的数量(台盼蓝-)和死(台盼蓝积极)细胞表达为彩色的数量还是清白的每毫升。

(3)- 4 5-dimethylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)还原试验是一个代谢活动分析,常用的测量细胞的可行性。可行的细胞与肝癌和活跃的代谢减少黄色稳定,紫色,彩色甲瓒晶体,可以溶解。死细胞,另一方面,失去MTT转换成有色甲产品的能力。紫色spectrophotometrically测量解决方案,其细胞生存能力的形成是一个合适的指标。减少肝癌发生的机制并不完全理解,但最有可能与线粒体NADH涉及反应和/或其他细胞间减少代理(69年- - - - - -71年]。

MTT试验进行了制造商的协议后,与一些细微的修改。简单地说,HUVECs被播种在2×10⁴细胞每在24-well板块和治疗。治疗后24小时内,MTT (50μl;最终体积为0.25毫克/毫升)添加到每个。在37°C细胞孵化4 h,以确保完整的肝癌和减少甲瓒晶体。培养基是仔细删除之前的MTT溶液化解决方案和温和搅拌10分钟。吸收(λ= 570海里)测量使用板读者(Varioskan Flash,热费希尔科学有限公司、拉夫堡、英国)。背景吸光度λ= 630 nm还测量了随后的减法λ= 570 nm读数。实验重复在6尺11寸不同场合,每一式三份。

2.8。超氧化物测定

超氧化物测定使用荧光技术(ROS-ID总ROS /过氧化物检测设备;恩佐生命科学有限公司),允许实时测量(a)过氧化物和(b)特异性的细胞内ROS生成。套件包含一个cell-permeable染料(橙色探针)反应特别O₂^∙−(72年,73年),生成一个橙色荧光产品能被探测到的荧光板读者配备标准的橙色过滤器集(λ= 550/610 nm)。

对于这个实验,HUVECs被播种在2×10⁴细胞每在24-well盘子。这些细胞被cotreated焦棓酸(140μ米)有或没有花翠素或没食子酸的浓度1海里,1μ米,100μm .过氧化物生成测量在4、8、12、24 h后治疗,在制造商的协议。简单,所需的时间后,组织培养基从井中删除和丢弃。与500年HUVECs立即清洗μ信用证提供的缓冲洗。这些步骤减少直接干预的可能性分析外生代理。洗缓冲区删除后,400年μ信用证的过氧化物检测混合(2μl(过氧化物检测试剂/缓冲洗10毫升)添加湿润孵化器孵化前板(37°C, 5%的股份有限公司₂和读者阅读在盘子里λ_前女友= 550海里,λ_新兴市场= 610海里),同时不影响检测混合。实验进行6 - 8次,各一式三份。四个时间点的数据集成到每个实验曲线下面积。

2.9。总谷胱甘肽含量、过氧化氢酶和SOD活性测定

HUVECs在6孔板培养根据上述方法。超氧化物自由基的细胞被cotreated生成器,焦棓酸(180μM)和飞燕草色素或没食子酸浓度,导致最突出的保护作用对化学诱导氧化应激(100海里和1μ米)。

谷胱甘肽、过氧化氢酶和SOD化验进行根据制造商的协议(开曼化学公司)。总细胞内谷胱甘肽浓度、SOD、过氧化氢酶活动是正常的蛋白质存在于培养细胞,决定使用Coomassie化验后,制造商的协议(热费希尔科学有限公司、拉夫堡、英国)。实验进行6次,各一式两份。

2.10。统计分析

结果表示为±SE。统计分析(与Dunnett后续测试的单因素方差分析,因子方差分析适用)使用GraphPad棱镜执行软件版本5.01(美国圣地亚哥GraphPad软件)。小于0.05的值被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。花翠素测定降解模式组织培养基(37°C, pH值7.4)分光光度法

花翠素(200μ米)是不稳定的组织培养中(37°C, pH值7.4)。降解过程立即开始,最快速的在第一个小时(图2(一个));半对数图显示日志时间和浓度之间的线性关系,表明衰变一级动力学(图2 (b))。抗坏血酸(5毫米)减缓退化的过程,但氧化剂,焦棓酸,并没有显着影响的飞燕草色素的稳定性。半衰期很短,(~ 30分钟没有抗坏血酸;图2(一个));~ 80%的飞燕草色素是在第一个小时。抗坏血酸增加了半衰期> 1.5 h(图2(一个))。

3.2。花翠素降解产物在组织培养基的识别

两个花翠素降解产物分子量相对较低的被确定在苯酚red-free组织培养基(pH值7.4,温度37°C) 30分钟孵化后,使用质/女士:没食子酸(GA);1)和峰值间苯三酚醛(3)峰值(图3)。母体化合物(4)峰值在这个时间点也仍然存在。未知化合物(2)峰值,并不是出现在控制样本也发现。基于收集的特点LCMS / MS分析(表1),复合推定地确认为查耳酮的吸收最大值λ~ 220和320海里74年]。此外,包含一个主要离子在321年达到峰值(m / z)(M + H),分裂成两个较小的离子在303.03和152.97 (m / z),分别对应于花翠素和醛(表1)。

3.3。抗氧化潜能

收紧试验才能够探测飞燕草色素的抗氧化活性和GA的浓度≥10μM(图1(一))。有一个小(~ 5%),但明显更高的抗氧化潜力花翠素没食子酸相比,以收紧(双向方差分析Bonferroni期末测验 10 - 100μ米)。

3.4。测量Pro - /抗氧化性能(EPR谱)

花翠素和没食子酸表现出oxygen-centred激进出席10时生成活动μ米和100μm .没食子酸还显示适度的自由基清除属性≤1μM浓度(图1 (c))。为花翠素radical-generating效应明显高于整个浓度范围(图没食子酸1 (c);因子方差分析, )。

3.5。飞燕草色素的影响和没食子酸的可行性HUVECs由台盼蓝排斥

花翠素和没食子酸对细胞完整性没有显著影响浓度≤10μ米,以台盼蓝排斥试验。然而,代理100的浓度μM造成很大(30 ~ 50%,职责。)减少锥虫blue-negative细胞(图4)。此外,100年μ米没食子酸在锥虫引起适度增加blue-positive细胞(~ 5%)。

3.6。花翠素和GA在HUVECs Pyrogallol-Induced细胞死亡的可行性

焦棓酸感应细胞生存能力的丧失(~ 30 - 70%;MTT试验),至少在一定程度上防止了飞燕草色素,飞燕草色素岁和GA的浓度≤10μM(图5)。飞燕草色素的效果是最明显(图5(一个)岁)和飞燕草色素(图5 (b)),细胞生存能力是完全受浓度的10 nM-10保护μM(达到~ 1μ100)。μ另外米花翠素和岁花翠素诱导细胞毒性效应大于那些单独与焦棓酸;额外的效果是类似的在振幅与花翠素没有焦棓酸(图4)。

没食子酸也显著降低pyrogallol-induced毒性,但在低浓度(10 - 100海里;图5 (c))。效果比花翠素和飞燕草色素岁并不完整,但重要的是要注意,焦棓酸的效果就更明显在这个特定的实验(~ 70%减少生存能力相比,30 - 40%)。One hundred.μM GA有大量额外的细胞毒性效应,减少细胞~ 5%控制细胞的可行性。

3.7。花翠素和没食子酸氢Peroxide-Induced HUVECs细胞毒性

过氧化氢诱导的细胞生存能力~ 55%(图6)。只有没食子酸(10μ米)显著防止H₂O₂全身的衰减(~ 40%保护;图6 (c))。有一个趋势在所有酚治疗10 nM-10测试μM浓度诱导的保护作用,但检验结果未达到统计上的显著水平。在所有情况下,coincubation酚治疗在100日圆μM和H₂O₂加剧了H₂O₂全身的细胞死亡(~ 80%损失的可行性;图6)。

3.8。飞燕草色素及其降解产物的影响在HUVECs Pyocyanin-Induced细胞毒性的可行性

绿脓菌素细胞生存能力减少了~ 30%(图7)。花翠素,享年花翠素,没食子酸提供保护pyocyanin-treated细胞,特别是在浓度的10μ米和1μM;其他的测试浓度没有显著保护细胞免受绿脓菌素(图7)。与H的数据₂O₂和pyrogallol-treated细胞,没有额外的100细胞毒性的影响μM浓度的酚治疗pyocyanin-induced细胞死亡。

3.9。花翠素的影响在焦棓酸和没食子酸内源性抗氧化防御系统——(O₂^∙−)治疗HUVECs

3.9.1。焦棓酸和酚醛树脂对细胞内过氧化物的影响

治疗与外生HUVECs焦棓酸诱导细胞内过氧化物的增加,用一个细胞内的荧光探针(数字8(一个)和8 (b);+ 86%);ROS总量没有显著影响(结果未显示)。Cotreatment细胞温和(1μ米)浓度的飞燕草色素(图8(一个))或没食子酸(图8 (b))倾向于减少细胞内过氧化物浓度,而cotreatment 100μ米花翠素或没食子酸诱导大幅增加细胞内超氧化物(+ 73% + 41%的进一步增加,分别地。,除了pyrogallol-induced增加)。

3.9.2。细胞内总谷胱甘肽

焦棓酸(180μ米)与抑郁症相关的总细胞谷胱甘肽HUVECs ~ 35%, 24小时后( 相比,控制;数据9(一个)和9 (b))。花翠素(100 nM和1μ米)显著防止pyrogallol-associated总谷胱甘肽的抑郁症HUVECs在24小时( ,两个;图9(一个)),尽管谷胱甘肽的浓度没有达到同一水平的细胞不焦棓酸处理(控制)。没食子酸在100纳米级花翠素的效果类似,虽然没食子酸在1μ米总谷胱甘肽的浓度完全防止oxidant-induced抑郁症(图9 (b))。

3.9.3。SOD活性

超氧化物歧化酶(SOD)活性在HUVECs很低(< 5μ/毫克蛋白)在未经处理的细胞。焦棓酸明显提高SOD活性(~ 10倍相比,控制;数据9 (c)和9 (d))。既不花翠素(图9 (c))和遗传算法(图9 (d))增强SOD活性除此之外单独与焦棓酸;事实上,与代理所显示的趋势是积极抑制pyrogallol-induced SOD活性在这个模型。的特异性试验证实了SOD活性测试等效HUVEC提取物治疗与焦棓酸KCN立即化验前。KCN抑制SOD活性~ 87%,表明一个强大的特异性SOD ( ;数据未显示)。

3.9.4。过氧化氢酶活性

焦棓酸治疗(180μ米)没有显著改变过氧化氢酶活性在HUVECs 24 h后治疗。同样,co-treatment与这个氧化剂和酚类化合物未能对过氧化氢酶有显著影响细胞活动(数据9 (e)和9 (f))。

4所示。讨论

本研究发现花青素,飞燕草色素,在生理条件下快速降解,未能提供大量的抗氧化活性在体外在浓度与口服生物利用度。然而,它有效地保护培养的内皮细胞对化学诱导氧化应激。花翠素hormesic在概要文件的保护作用,达到~ 1μm .飞燕草色素的主要降解产物没食子酸(GA),共享的许多抗氧化剂保护母体化合物的特性。花翠素和没食子酸诱导增加总细胞内谷胱甘肽,但没有增加SOD或过氧化氢酶的活性。这些研究结果的推论是,飞燕草色素的抗氧化保护作用可能不是由直接抗氧化活性和不一定需要母体化合物的存在。然而,增加细胞内谷胱甘肽是可能引发的GA花翠素本身。这个协会不明确识别谷胱甘肽作为效果的原因,但这是一种解释。

4.1。飞燕草色素的稳定性

花翠素在生理条件下更稳定当礼物作为糖苷(75年]。然而,其稳定性迅速下降当糖的剥夺一部分在运输途中通过肠道。我们的研究结果表明,花翠素糖苷配基在生理条件下不稳定,半衰期短的~ 30分钟。抗坏血酸分解提供了一些保护,但半衰期仍然是< 2 h的抗氧化剂。

质/ MS数据表明,飞燕草色素降解自发没食子酸和间苯三酚醛在生理状态下组织培养基。事实上,降解产物出现在解决方案只有30分钟后显示过程的速度,证实了以前的观测39,41]。中间降解产物的存在,查耳酮,是一种象征,先前描述的化学过程类似于(39,41,56]。从生物的角度来看,这些数据暗示花翠素,剥夺了糖在肠道,不太可能持续长在血液或组织。很可能更稳定的飞燕草色素分解和代谢的产物,包括没食子酸,更有可能有机会调解通常归因于花翠素的保护作用。

4.2。在体外反Prooxidant飞燕草色素的影响和没食子酸

收紧分析才发现减少活动花翠素和没食子酸的浓度≥10μM;虽然效果也显著大于花翠素没食子酸,绝对的区别只是~ 5%。在解释这些数据,重要的是要强调收紧,以及许多其他的在体外“抗氧化剂”分析,实际措施减少权力,而非自由基清除。此外,这种技术不会识别任何prooxidant效果。EPR谱只检测自由基(59),并通过使用选择性自旋陷阱oxygen-centred激进的一代,可以提供一个radical-mediated氧化潜力的直接测量。EPR生成的数据表明,飞燕草色素和没食子酸≥10 prooxidant展览活动μ米,此外,还有一些温和清除oxygen-centred激进的物种生成的自发组织的影响在低浓度培养基。prooxidant发现并非没有先例:酚类化合物,包括没食子酸,已被证明有prooxidant属性(43,44),可能通过减少过渡金属离子和顺向芬顿化学感应(59]。几个研究小组(44,75年,76年)报道,酚类化合物,尤其是没食子酸,可以在组织培养基和氧化容易产生自由基,如超氧化物自由基(O₂^∙−),H₂O₂,醌类。事实上,自氧化酚类化合物,重要的自由基生成,可以解释对癌细胞的细胞毒性在高浓度44]。很明显的收紧和电子顺磁共振数据在处理酚类化合物存在的复杂性与他们的还原能力,支持和抗氧化活性。当然,浓度减少权力的概念(收紧)转化为抗氧化能力在活的有机体内不持有的并发,违反直觉oxygen-centred自由基生成增加;如果有的话,EPR的数据表明,只有没食子酸的浓度~ 1μ适度的直接抗氧化作用的迹象。

4.3。细胞毒性和保护作用的飞燕草色素和HUVECs没食子酸

生理相关浓度(≤10μ米花翠素和没食子酸不诱导细胞死亡HUVECs没有实验氧化应激。然而,在supraphysiological浓度(100μ米),能够有力的减少影响和伴随oxygen-centred自由基生产,有大量的细胞毒性效应衡量细胞膜完整性的丧失(一级或二级坏死)。细胞毒性的阈值的同时,可检测的还原能力和自由基生成可能表明,细胞毒性是由oxidant-free激进的生产,进而由减少金属ion-mediated芬顿化学。无论机制,然而,很明显,这些酚类代理成为有毒浓度高于~ 10μM,这就可以解释为什么它们很大程度上排斥在肠道和等离子体浓度保持低于~ 10μM。

4.4。酚类化合物防止氧化应激细胞死亡:Hormesic关系

花翠素,享年花翠素,GA大量HUVECs对化学诱导氧化应激保护作用。保护的程度是特定于所使用的氧化剂;在HUVECs最为明显暴露在超氧化物自由基生成的焦棓酸和氧化应激的pyocyanin-induced细胞死亡。保护浓度依赖:pyrogallol-treated细胞,100 nM和1μ浓度最明显的有利影响,但非常低浓度(10 nM)也提供了重要的保护。岁的飞燕草色素和飞燕草色素,足以保护全面恢复oxidant-induced细胞生存能力的损失。GA的有效性显著较弱的飞燕草色素和年龄花翠素相比,但这可能是由于这样的事实:焦棓酸引起的细胞死亡的孤独的GA实验大大高于花翠素和aged-delphinidin实验。pyocyanin-treated细胞,优化效果被认为在1 - 10μM和H₂O₂,只有10μM GA显示部分保护作用。而影响的模式相似的所有测试代理,有细微的差别在每个所需的最佳浓度和相对有效性对不同的氧化剂的压力。对遗传算法在一般情况下,最优浓度~ 10倍低于花翠素和飞燕草色素岁暗示治疗在24小时的代谢产物与花翠素比最初的治疗更有效,尽管后者的可能恶化最终生成没食子酸。数据表明,飞燕草色素或者不稳定的中间化合物并不要求抗氧化保护在这个模型。

数据包括直接测量细胞内超氧化物使用一个细胞内的荧光探针支持概念,飞燕草色素和GA 100μM积极诱导细胞内氧化应激,这表明细胞毒性作用的细胞与氧化应激有关。同时,低的趋势(1纳米)和中间浓度淬火细胞内超氧化物,符合hormesic关系通过测量细胞死亡的这个模型。

的浓度范围为本研究选择拥抱那些有关在活的有机体内生物利用度(100 nM - ~ 1μ米)(12,14,33,37]。然而,为了获得一个更好的洞察酚类化合物的有效性,更高浓度被包括在实验设计中。虽然测试代理的保护作用浓度依赖性,没有遵循传统的s形log浓度响应的关系关系,增加效应(在这种情况下抗氧化保护)和浓度增加,然后到达高原。相反,它被发现,而低中间浓度显示保护作用,造福与100年未见μ岁的米花翠素,飞燕草色素,或没食子酸。事实上,在细胞治疗与焦棓酸或H₂O_2,这些药物的细胞毒性效应显然是添加剂,造成化学氧化剂。的现象相同的代理可以在较高的浓度和有益有害低浓度称为毒物兴奋效应(77年),曾被描述为白藜芦醇,在低剂量的保护作用,但高剂量的不利影响是观察到的78年]。飞燕草色素及其降解产物在HUVECs显示典型的毒物兴奋效应的存在一个氧化剂(特别是超氧化物pyocyanin-induced焦棓酸或引发氧化应激和细胞死亡)。最优效益恰逢浓度可能可以从饮食摄入。

结果不仅表明积极的属性的多酚类化合物也被高估了,但作为提醒自然并不自动意味着安全和更多的并不一定意味着更好的(11]。应该强调,日志浓度与效应的关系,加上肠道中酚类化合物的高效筛选,确保水平可能产生毒性作用的接触通过饮食无法实现。它将成为一个重要的考虑因素,但是,应该考虑的多酚类化合物对静脉注射或并入植入式设备。

4.5。花翠素和没食子酸的影响细胞内Defences-Secondary抗氧化效果

总细胞内谷胱甘肽浓度增加pyrogallol-treated HUVECs回应花翠素和没食子酸100 nM-1出席μM;没食子酸的作用是足够强大,能够完全防止pyrogallol-induced总谷胱甘肽的抑郁。重要的是要认识到,观察到的保护由GA和保护之间的联系的谷胱甘肽本身不能证明增加细胞内谷胱甘肽负责高卢酸性溶液的保护作用可能同样推断没食子酸或花翠素提供了直接的谷胱甘肽抗氧化保护导致保护。然而,我们认为后者的解释是不太可能的缺乏对没食子酸的抗氧化活性相关的浓度(1μ米)的抗氧化剂化验使用。此外,效果上总谷胱甘肽浓度不平衡减少/氧化谷胱甘肽成分,推断调制的谷胱甘肽合成/崩溃而不是抗氧化保护。酚醛谷胱甘肽诱导应确认,这个概念是有趣的,因为它可以驱动大量扩增的抗氧化能力:1的影响μ米没食子酸对总细胞抗氧化能力可以忽略不计,但是通过这个过程,增加细胞内谷胱甘肽可以在毫克分子范围内。

这一结果与以往的研究都花翠素(78年和没食子酸79年,80年极大地推动了谷胱甘肽的耗竭和ROS增加生产。然而,以往的研究中使用的浓度更高(25 - 100μ米和10 - 400μ米花翠素和没食子酸、职责)水平,我们的数据表明,飞燕草色素和没食子酸都能产生oxygen-centred的自由基。这些差异突出密切关注的重要的抗氧化剂的浓度在细胞培养中应用及其相关性在活的有机体内生物利用度。

相似的变化没有发现我们调查的关键抗氧化防御酶(SOD和过氧化氢酶),提出一个相当有针对性治疗的影响。这一结论符合最近的一项研究[81年),没食子酸被发现导致增加GST-alpha 3对SOD活性没有显著影响。同样,没食子酸的活动增加大鼠肝微粒体谷胱甘肽S-transferase MGST-1,但只有在缺乏的过氧化氢酶和SOD (82年]。

飞燕草色素的基本机制和没食子酸增加细胞内总谷胱甘肽尚不得而知,但upregulation病原反应酶负责合成谷胱甘肽,谷酰基半胱氨酸连接酶(GCL),是一个可靠的选择。多酚类物质被激活NF-E2-related因素的形成2 (Nrf2) / antioxidant-responsive元素(是)通路,导致感应解毒酶(49,83年),包括GCL在别人(84年),我们假设没食子酸可能激活类似的途径。

4.6。机理和影响

越来越多的证据表明,酚类化合物作为外源性物质的细胞(34,85年]。因此,广泛的代谢暴露,加上生物利用度较低,可能是由于自然防御有潜在毒性的侮辱。这个概念可以解释的相对较低的浓度(聚)酚醛树脂中发现等离子体(100 nM-10μ米),这并不显著影响phenolic-rich食物的摄入(2,14,54]。少量的父母多酚,克服防御机制,一起简单的酚类化合物,代表降解产物,对轻微的有害效应,推动Nrf-2 / ARE-1-mediated upregulation胞内防御酶和xenobiotic-metabolising酶,导致观察到的抗氧化剂和cytoprotective效果。

这项研究的结果提供支持的观点delphindin-and潜在其他berry-derived polyphenols-has保护内皮细胞免受氧化应激的能力,也许通过一个间接的路线。矛盾普遍的观点,提供的保护似乎没有直接相关的抗氧化多酚本身的属性;相反,调制的细胞内的防御机制是一个可能的替代作用方式。此外,这项研究表明,降解产物可能是负责观察到的生物活性,而不是母体化合物本身。这有着深刻的影响在活的有机体内生物利用度的研究,表明我们的注意力之前可能是错误的,我们应该衡量酚代谢物,也会赋予生物活性和可能存在浓度高于母体化合物(年代)。

膳食多酚有促进健康的品质,但他们的行动模式仍然是模棱两可的。一个完整的理解的生物活性代理在活的有机体内及其作用方式将帮助塑造的公共卫生建议。也有深远的影响,我们的研究结果为研究实践,特别对的相关性在体外抗氧化(还原能力)测试视为公认的健康食品中提取的多酚类化合物的好处。

5。结论

这项研究增加了更多的文学解释之间的明显差异非常低的生物利用度和快速复杂的多酚类物质和代谢的能力,然而,唤起一种强大的抗氧化作用。在高浓度时,花翠素及其主要代谢物,乔治亚州,有可能是有毒的,但是在subtoxic浓度,他们可以通过一种机制,防止氧化应激与增加谷胱甘肽有关。多酚的抗氧化活性的影响是不可能有任何轴承在保护细胞免受氧化应激的能力;相反,它的能力是生物代谢产物刺激可能驱动保护作用,抗氧化防御途径的方式无关在体外父分子的还原能力(55]。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版这篇文章。

确认

这项工作是支持的欧盟Interreg印度河流域文明计划(Climafruit)。加里·g·Duthie和德里克·斯图尔特是感激苏格兰政府的财政支持农村和环境科学和分析服务部门和他们的健康安全的饮食计划。德里克·斯图尔特承认支持通过欧盟FP7 BachBerry项目(项目之下。fp7 - 613793)之下。Katarzyna Goszcz目前支持的高地和岛屿的企业。