文摘
多酚的体外能力,从红葡萄中提取,调节外周血单核细胞反应一直在评估20肥胖(Ob)人。十四烷酸对细胞因子释放在回应佛波醇酯(PMA)、白介素2的水平(2)、干扰素-γ(IFN -γ),il - 4、il - 10和IL-17更高Ob的健康(H)科目。反之亦然只在H, IL-21浓度检测人但是他们察觉Ob。概括地说,il - 1的含量β,il - 6、引发和肿瘤坏死因子-α高Ob人相比,H控制。另一方面,多酚没有修改干扰素-γ、il - 4和IL-17水平。然而,增加在H - 2个人,而Ob同行的水平下降。多酚显著增加il - 10释放H捐赠者,而观察Ob人们增加趋势。此外,茶多酚能显著提高H IL-21的水平,虽然这在Ob人并非如此。因为IL-21 Th17细胞的诱导物,很可能多酚可以抑制细胞因子的来源通过il - 10的生产。因此,多酚降低il - 1β和il - 6版本相比,H控制。
1。介绍
肥胖是一个世界性的流行在持续增长,这是相关的死亡率和发病率高(1,2]。它的特点是脂肪组织的早期炎症,这后来成为系统性,从而导致2型糖尿病,心血管疾病和癌症(3- - - - - -6]。从免疫学的角度来看,肥胖是由几个扰动的免疫反应7,8]。此外,免疫细胞和脂肪细胞均表现出显著的炎性细胞因子在内脏脂肪的来源(9]。一些免疫细胞,甚至包括T细胞、B细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和已确定在脂肪组织中,肥胖似乎影响免疫细胞的数量和配置的子集。由于这些原因,脂肪组织被认为是一个大型免疫和内分泌系统活跃的器官在肥胖的过程中(10,11]。然而,尽管存在造血系细胞脂肪组织,他们直接参与免疫监视或宿主防御需要进一步调查10]。Pandolfi et al。12)提供了最近的证据所产生的高炎症作用T辅助(h) 17个肥胖的内脏脂肪组织细胞(Ob)人,与释放高浓度的白介素(IL) 1β、il - 6和IL-17。同时,生产IL-21有助于使炎症通过激活另一波Th17细胞(6,13]。要注意扩大Th17细胞内脏脂肪的减少有关Treg细胞(9,11]。
Ob个体,血液中白细胞的数量增加而精益同行(14]。特别是,单核细胞数量上升,减少身体的脂肪积极与这些细胞的减少(8,15,16]。然后,单核细胞迁移到脂肪组织和M1和M2分化成巨噬细胞17]。前者发挥炎症功能和主要在Ob脂肪组织,而后者在精益脂肪组织,与生产的抗炎细胞因子il - 1018]。适应性免疫,夸张的释放从脂肪细胞瘦素(一种adipokine)内脏脂肪徒Th1、Th2细胞,从而增加生产和il - 4 - 2 T淋巴细胞增殖(19,20.]。瘦素的活动强化了当代释放抵抗素和visfatin,既有助于il - 1的生产β分别、il - 6、引发和il - 12 (19,20.]。
多酚类物质是天然化合物主要存在于水果,蔬菜和谷物。他们是具有抗氧化和抗炎活动,如动物模型和临床试验所示(21]。根据我们的个人经验,使用多酚,隔绝红酒和发酵葡萄马克(女性生殖器切割),我们发现,这些化合物能够诱导和激活周边人类Treg细胞(22]。反过来,这些细胞释放il - 10的导致免疫内稳态的条件在不同T细胞亚群(23]。女性生殖器切割对人类的直接影响多形核细胞,单核细胞,和观察嗜碱粒细胞减少释放活性氧(ROS)和抑制嗜碱细胞脱颗粒,分别为(24]。此外,人类单核细胞体外治疗的红酒多酚抑制绑定,类毒素toll样受体4 NF -激活降低κB和减少释放促炎细胞因子(25]。
在肥胖、饮食的有益影响多酚已报告了作者。Ricordi et al。26]指出多酚的能力发挥抗炎活动在肥胖、糖尿病和代谢综合症,从而导致调制的血糖和胰岛素水平。Rios-Hoyo et al。27]表明多酚的性质避免肥胖的心血管并发症,促进血管舒张,antiatherogenetic和抗血栓形成的作用。Moreno-Indias et al。28]报道的影响,适度饮用红酒多酚在肠道微生物群的调制和减少Ob炎症标记物的人。实验,绿茶多酚已被证明减弱炎症功能Ob大鼠中性粒细胞减少释放活性氧和促炎细胞因子(29日]。最后,莫利纳et al。30.)记录在Ob老鼠,绿茶多酚处理,减少炎性细胞因子的释放和il - 10的增加。
在此基础上,本工作的目的是探讨在体外的影响多酚分离红葡萄的种子(尼禄di Troia品种)外周血单核细胞(Ob PBMCs)人。PBMCs绝对数量和细胞因子释放(Th1、Th2 Treg, Th17-related细胞因子和规范促炎细胞因子)将评估相比,多酚类物质的存在或缺乏健康(H)。
2。材料和方法
2.1。Ob人报名
Ob人连续进入门诊临床肿瘤学的动态部分,c / o生物医学科学和人类肿瘤,巴里大学医学院,巴里,意大利。他们通过家庭医生门诊的减肥和接收的饮食和生活方式的建议。
关于标准包含的研究中,受试者身体质量指数(BMI)超过25.0,18岁以上,不使用任何类型的药物(包括激素替代治疗和口服避孕药前和绝经后的表现,分别地。)登记。实际上,目前的招聘,他们仍然肥胖的治疗的条件。
排除标准是由糖尿病、慢性炎症性疾病,心血管疾病。在这些基地,按照纳入和排除标准,连续二十Ob人登记(八个男性和十二个女性)。
知情同意是口头上的所有受试者招募,审批的研究是按照当地特设委员会的道德标准人体实验以及与1975年赫尔辛基宣言,就像2000年的修订。
没有参与者在有限的卡路里饮食也没有入学前参加激烈的体育活动。免疫学评价之前,实验对象被要求避免服用酒精和咖啡因。
2.2。正常的捐助者
二十heparinised外周血样本H捐助者(年龄范围:出具)招募了综合医院医院的血库,巴里,意大利,在书面同意。
2.3。多酚提取
Canosina红葡萄从尼禄di Troia原地葡萄葡萄品种,生长在阿普利亚(意大利南部)。它的特点是厚皮和小尺寸的浆果。冷冻浆果的种子被渗流提取使用乙醇/水(70:30)。然后,提取首次通过液相色谱分析与二极管阵列检测定义多酚成分。此后,提取纯化在合成吸附剂溴化树脂和多酚含量的比例确定。潜在的抗氧化作用的提取物进行评估通过使用2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl分析衡量测试代理来清除自由基的能力(31日]。
2.4。实验设计
PBMCs H和Ob人分离的聚蔗糖梯度和1640年完全培养基由RMPI resuspended (Miltenyi研究,Bergisch格拉德巴赫,GE)和补充庆大霉素(Sigma-Aldrich、米兰、意大利)、青霉素(100毫克/毫升)(美国Walkersville Biowhittaker)、丙酮酸钠(Sigma-Aldrich),消息灵通的缓冲区(Sigma-Aldrich),和30%胎牛血清(Biowhittaker)。PBMCs调整到一个3×10的浓度6/毫升,然后与三个不同的刺激(1、3和5μg,职责。)的多酚。PBMC样品被用来描述他们的绝对数量或评估释放各种细胞因子通过流仪测定。如果PBMCs作为消极的控制,而十四烷酸细胞接受佛波醇酯(PMA) (Sigma-Aldrich)加上ionomicyn (Sigma-Aldrich)担任积极控制H和Ob个人。不同的细胞悬浮液分别孵化24 h,在37°C, 5% /有限公司2。然后,浮在表面的每个样本的收集和离心机在10000 rpm 10分钟和存储−30°C到使用。相反,细胞球的每个样本被用来描述PBMCs的绝对数量。
2.5。分析PBMCs的绝对数量
细胞悬液被分发到两个不同的管子,然后,分别添加以下单克隆抗体:CD3FITC, CD8PE, CD4APC, CD45APC-Cy7, CD3FITC, CD16PECD56PE和CD19APC分别。
40分钟后孵化在37°C在黑暗中,每个管在1200转离心10分钟。此后,上层的丢弃,每个管增加了500人μl(磷酸缓冲盐(PBS)。
标记细胞,流式细胞术进行分析(流式细胞仪咏叹调三世,正欲(BD),米兰,意大利)。
与流式细胞仪进行数据采集和分析软件6.1.3天后列表模式的形式FCS数据文件版本3.00中,使用默认biexponential转换。
2.6。细胞因子测定
细胞上清液仪孵育珠阵列(CBA)人类可溶性蛋白质Flex工具包(BD)。这个工具允许确定以下细胞因子:2;il - 12;干扰素-γ;il - 4;il - 10;IL-17;IL-21;il - 1β;il - 6;引发和肿瘤坏死因子(TNF)α。
捕获每个CBA珠子中提供人类可溶性蛋白质Flex集被分配在每个细胞上清液,在黑暗的1 h孵化后,一组人类可溶性蛋白质Flex PE检测在黑暗中添加2 h。后来,每个样品悬浮在1毫升PBS在800转离心10分钟,然后上层清液小心丢弃,最后,500μl PBS是添加到球。
样本获得使用流式细胞仪天后软件,它能够根据一些属性来区分不同类型的细胞因子如向前散射,散射,和平均荧光的荧光染料:PE、APC e APC-Cy7。所有细胞因子的标准曲线最初准备。FCAP软件中所有细胞因子(BD)是用来量化标准和样品。
2.7。统计分析
统计分析是使用Bonferroni执行的测试比较H和Ob样本。GraphPad棱镜使用统计软件5.0版本Windows Vista。统计学意义是。
3所示。结果
在表1Ob个人招募、人口统计学和人体测量的特性。
3.1。绝对数量的PBMCs
在数据1(一)- - - - - -1 (c)在数据2(一个)和2 (b)PBMCs绝对数字,由流式细胞术,表示。CD3 +细胞绝对数字(数字1(一)CD4 +(图)1 (b)),CD8 +(图1 (c)),CD19 +(图2(一个)),CD16 + CD56 +(图2 (b)在Ob)明显高于H组。
(一)
(b)
(c)
(一)
(b)
在这两个人物,多酚类物质的影响的绝对数字PBMCs表示。这些数据将在本节中讨论的一个特定的副标题。
3.2。PMA对Th1和Th2-Related细胞因子释放的影响
在图3,(a)和干扰素- - 2的释放γ(b)表示。两Th1-related自发释放细胞因子在H和Ob个体察觉,分别。然而,在PMA的存在,只有Ob学科产生和干扰素- - 2数量的提升γ。在图4、il - 4生产增加显著的方式只有在Ob PBMC在PMA的存在。
(一)
(b)
3.3。PMA Treg / Th17-Related细胞因子的影响
在图5(一个)、il - 10水平显著增加在Ob PBMCs PMA的存在。相反,H和Ob治疗PBMCs没有释放大量的il - 10。可检测水平的IL-17(图5 (b))记录只在PMA-treated Ob PBMCs。相反,IL-21释放(图5 (c))是观察到的只有如果和PMA-stimulated H PBMCs与Ob同行相比,这种细胞因子的水平是无法觉察的。
(一)
(b)
(c)
3.4。PMA对促炎细胞因子释放的影响
在图6(一),il - 1β在Ob PBMCs显著增加的PMA相比Ob未经处理的细胞。在H个人水平的细胞因子低于Ob。肿瘤坏死因子-α数量(图6 (b))在统计上显著的PMA-treated Ob PBMCs Ob未经处理的和PMA-treated H PBMCs相比,分别。在图6 (c),有证据表明,所有样品生产的引发,其水平在统计学上显著高于Ob和H细胞PMA处理与未经处理的PMBCs相比,分别。il - 6水平(图6 (d))在统计学上显著高于Ob细胞+ PMA相比,未经处理的Ob和H细胞+ PMA,分别。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.5。体外H和Ob PBMCs多酚的影响
多酚没有修改的绝对数字H和Ob PBMCs浓度,如数据显示1和2。
此外,茶多酚治疗并不影响干扰素-的释放γ和il - 4(数据未显示)。相反,作为显示在图7,而多酚适度增加释放- 2 H PBMCs,他们减少从Ob PBMCs自发生产的细胞因子。
在图8(一个)从H和Ob PBMCs, il - 10释放表达。很有趣的是,从H细胞il - 10的生产增加的5μg多酚相比,如果细胞。注意,相同剂量的多酚,il - 10水平的趋势增加Ob PBMCs相比,如果细胞观察。
(一)
(b)
在图8 (b),IL-21释放H和Ob PBMCs被描述。很有趣的是,如果没有释放IL-21 polyphenol-stimulated Ob细胞。相反,在所有剂量茶多酚能够显著提高IL-21 H细胞的释放。
IL-17中没有检测到H和Ob PBMCs,分别在多酚(数据没有显示)。
在图9,释放il - 1β(一)、肿瘤坏死因子-α(b),引发(c)和il - 6 (d),分别表示。至于il - 1β释放,5μg H细胞中多酚类物质增加了释放。多酚没有有效剂量Ob细胞。相反,肿瘤坏死因子-α和引发产生的H和Ob在存在多酚在同样的方式没有任何统计上的显著差异。关于Ob il - 6,减少细胞因子的5μ观察g多酚相比,H。
(一)
(b)
(c)
(d)
4所示。讨论
肥胖是一个严重的健康问题在世界范围内,以系统性炎症状态和并发症,如II型糖尿病,心血管疾病和癌症(3- - - - - -7,32]。我们目前的数据确认和扩展报道改变免疫内稳态在肥胖8,14- - - - - -16]。因此,我们绝对数量增加的证据Ob PBMCs似乎夸大了相关回应PMA刺激Ob - 2分泌细胞。很有趣的是,H PBMCs对PMA和他们的绝对数量低于Ob刺激外周免疫细胞。这些数据表明先前存在的条件激活的Ob Th1细胞,2的主要来源,它充当一个强有力的生长因子(33]。在这个方向,体内几个循环抗原,如饱和脂肪酸和木糖醇,不断刺激Ob免疫细胞,从而导致他们的hyperactivation顺向失衡的免疫网络(34,35]。同时,观察到的增强版本的干扰素-γ由PMA-stimulated Ob PBMCs可能导致炎症状态的维护与释放的促炎细胞因子和ROS monocytes-macrophages和中性粒细胞36]。相反,在我们的测试系统中,H PBMCs不产生和干扰素- - 2γ为了应对PMA刺激。也可以观察到类似的响应模式的情况下增加分泌il - 4的PMA-stimulated Ob PBMCs。也在这个实例中,H Th2细胞在相同的实验条件下不产生il - 4。增加大量的il - 4在肥胖可能导致更持续生产抗体、参与免疫复合物的形成,和/或汽车抗体(37]。此外,频繁与肥胖哮喘协会可能依赖于一个更加明显的IgE开关响应环境过敏原(38]。我们的数据Treg / Th17-related细胞因子在肥胖的免疫发病机理提供新的见解。只有Ob PBMCs产生il - 10和IL-17在PMA刺激,但这不是H细胞。然而,在我们的测试系统中,一个关键细胞因子似乎IL-21,作为一个产品不同的T细胞,甚至包括Th17细胞(39]。事实上,IL-21充当强Th17细胞的诱导物,从而维护各病理炎症状态(39,40]。很有趣的是,Ob PBMCs不产生可检测的IL-21缺席或PMA的存在。相比之下,H PBMCs自发产生IL-21,在更高的程度上,在PMA的存在。为了更好地阐明目前的结果,我们可以假设Ob il - 10在以一种间接的方式检查IL-17的生产过剩通过废除IL-21生产。然而,我们的研究结果是在分歧与当前的文学。事实上,Fabrizi et al。13]证明IL-21 IL-21 mRNA的表达升高高脂肪饮食的脂肪组织(HFD)小鼠和肥胖病人的间质血管分数。同时,Treg细胞更丰富IL-21基因敲除小鼠与野生型相比,饲喂动物正常饮食和HFD。这些结果证实了克努森和李41]表明IL-21是谁的主要负面调节器干扰素调节因子4,因此抑制Treg细胞积累脂肪组织和系统性胰岛素敏感性。增加IL-17和IL-21/22 HFD老鼠的肝脏被Cavallari报道et al。42]。然而,这些作者发现高浓度的细胞因子HFD回肠和结肠的老鼠。在不同的临床,最近我们报道增加IL-21 PBMCs分泌物的患者慢性上呼吸道感染(43]。同时,增加IL-17释放是指出在同一患者,因此建议IL-21和IL-17水平之间的正相关关系。很可能在我们的群Ob的人维护炎症/抗炎的平衡,所支持的il - 10分泌PMA,可能导致IL-21抑制和当代遏制Th17细胞扩张。
关于促炎细胞因子,il - 1的含量β肿瘤坏死因子-α、il - 6和引发高于那些观察的H个人PMA刺激,因此建议Ob单核细胞向炎症极化倾向的概要文件。
添加茶多酚H和Ob细胞并不影响绝对数字PBMCs和释放il - 4和IL-17。相反,多酚稍稍增加生产H - 2细胞浓度但废除释放Ob - 2细胞。
il - 10, Treg细胞的主要产品44),是在H PBMCs显著增加5μg剂量,也之前报道(22]。在Ob细胞的情况下,同样的剂量会导致细胞因子的趋势增加。
H在存在多酚在剂量依赖性增加释放IL-21时尚。同样的事件不发生当Ob细胞与多酚治疗,从而表明这些化合物可能抑制细胞IL-21来源。事实上,有证据表明,膳食多酚能够抑制血清水平的IL-17志愿者这个早餐摄入(45]。最后,il - 1的显著下降β和释放il - 6可以观察到当Ob PBMCs处理5μg多酚治疗相比,H细胞相同的剂量。这一事实可能归因于多酚的趋势增加以Ob细胞分泌il - 10。
5。结论
关于多酚对Ob PBMCs影响,最引人注目的发现是由无法诱导IL-21生产。另一方面,在H个人,多酚做IL-21增加产量,导致主机保护,因此其余CD8和自然杀伤细胞的功能,和生产的IgG1 B细胞(39]。为了解释polyphenol-mediated废除Ob IL-21的人,每个人都应该考虑到证据表明这些化合物往往会增加分泌il - 10,这本身是增强在PMA刺激。
从转化的角度来看,我们的膳食多酚体外数据显示,假设肥胖的人可以预防肥胖引起的并发症,甚至包括血管损伤。这个观点是由最近的一份报告表明,石榴汁多酚能够转变M1 M2巨噬细胞反应类型响应il - 10的生产(46]。因此,这个开关向抗炎巨噬细胞表型可以减弱小鼠主动脉粥样硬化的炎症状态。此外,还应该考虑一个多酚的能力减少活性氧(ROS)生成由人类白细胞(24]。在这方面,提供了证据,绿茶多酚补充肥胖女性导致减少活性氧的生产由多形核的细胞(47]。
综上所述,所有这些发现支持的有用性饮食的方法来限制炎症在肥胖。
相互竞争的利益
作者宣称没有利益冲突。
确认
本文是PRO.ALI.FUN支持的项目。PON02_00186_2937475(意大利罗马)。