文摘
本研究旨在评估的抗氧化和抗炎作用杜仲黄酮(EUF)使用diquat-challenged小猪模型。共有96个断奶仔猪被随机分配到1的3治疗8复制笔每治疗和4只小猪笔。基础治疗饮食、基底饮食+杀,100毫克/公斤EUF饮食+杀。治疗开始后7天,小猪在腹腔里注射了敌草快8毫克/公斤体重或相同数量的消毒盐水。实验进行了21天。EUF补充改进的增长表现diquat-treated小猪从14到21天。杀也诱导氧化应激和炎症反应,然后受损肠道形态。但是EUF除了减轻这些负面影响引起敌草快显示降低血清浓度促炎细胞因子,但增加抗氧化指标和抗炎细胞因子在14天。补充EUF也增加了绒毛高度和绒毛高度、隐窝深度,但减少组织病理学评分和MPO活性与基底和diquat-challenged猪相比,美联储在14天的饮食。结果表明,EUF减毒引起的炎症和氧化应激的小猪杀注入。
1。介绍
在人类和动物氧化应激是一种常见的现象,导致大量的生物和环境因素和压力(1]。在正常生理条件下,平衡生产的氧化剂和抗氧化剂之间的生物系统(2]。绝大的自由基会损害这种氧化还原平衡,从而导致氧化应激,包括氧化蛋白质,脂类和核酸3,4]。据报道许多慢性病都与过度生产活性氧(ROS) (5,6]。
天然化合物存在于植物已报告表现出抗氧化活动与活性氧和活性氮物种(RNS),从而终止链式反应(7- - - - - -9]。杜仲(欧盟)(也称为“杜钟”在中国)含有丰富的化学成分如木质素、环烯醚萜苷,酚醛树脂,类固醇,和类黄酮,因此,提出了各种药用价值作为中国传统医学8,10]。欧盟的叶子也包含丰富的次生代谢产物,如类黄酮(8,11,12]。据报道,黄酮类化合物具有很强的抗氧化活动;它显示直接清除自由基,抑制促炎细胞因子通过抑制活性氧和一氧化氮,减少炎症基因包括环氧合酶(cox)和诱导一氧化氮合酶(间接宾语),移植抗氧化酶,调节转录因子如NF -κB和AP-1,增强Nrf2信号通路(13- - - - - -16]。
因此,这个实验的目的是探讨黄酮的抗氧化活动和抗炎作用从欧盟使用的叶子中提取氧化应激是联吡啶溴杀小猪模型除草剂产生产生自由基的能力通过redox-cycling代谢和被广泛接受的体内氧化应激模型17- - - - - -19]。
2。材料和方法
2.1。EUF提取
EUF提取和总黄酮含量测定的方法进行了李et al。20.,21)的医学,吉首大学(湖南吉首,中国)。欧盟的叶子是阴凉干燥和细粉。提取是厄伦美厄烧瓶中使用65%的乙醇进行30分钟使用超声波清洁50°C,其次是过滤。这个提取过程重复两次。那时滤液集中使用一个旋转真空蒸发器在70°C。集中提取的解决方案是将使用石油醚脱脂,然后使用大孔树脂纯化通过用蒸馏水冲洗列和静态吸收2 h。的分数是筛选了90%乙醇2 h,然后按顺序集中,与异丙醇清洗两次,过滤,浓缩和冻干。的内容总黄酮EUF粉83.61%通过紫外分光光度计使用芦丁作为校准用标准方法分析(22]。
2.2。动物和实验设计
动物实验机构批准的动物保健和使用委员会亚热带农业研究所中国科学院(2013020)。
96 three-breed杂交(杜洛克猪×长白猪×大约克郡)仔猪断奶后21天被随机分配接受1 3治疗8笔/治疗和4只小猪复制/笔。3治疗方法包括基底饮食,基底饮食+杀,100毫克/公斤EUF饮食+杀。饮食被制定来满足营养需求,刚断奶的小猪(表1)。敌草快从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国)和一剂8毫克/公斤BW报告的结果显示使用阴et al。18]。小猪单独被安置在一个环境控制与硬plastic-slatted地板育婴室。所有的动物都可以免费获得水。7天适应期后,小猪与各自的饮食喂养3乘以每天八点,13:00,18:00 21天的时间。小猪都是每周体重,他们的平均每日增加,每日采食量,并获得:喂比率计算在整个实验。
7天,小猪在基底饮食+敌草快和EUF饮食+杀治疗收到的腹腔内注射8毫克/公斤BW溴杀小猪在基底饮食收到同样体积的消毒盐水。14和21天,8小猪(1头猪/笔)被随机选择和血液样本采集无菌的颈静脉2 h后点喂食。血清样本通过离心法血液样本在2000 g×10分钟在4°C,然后立即存放在−80°C进行进一步分析。小猪与戊巴比妥钠麻醉,通过颈静脉穿刺安乐死。肠道样本收集从空肠、回肠、结肠前、后结肠和固定在4%甲醛形态学分析和组织病理学分级。前部和后部结肠组织立即snap-frozen在液体储存在−80°C N和髓过氧化物酶(MPO)活性分析。
2.3。抗氧化能力的检测
浓度血清超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(氧化酶)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)、总抗氧化能力(T-AOC),并使用相应的分析工具测量谷胱甘肽(南京,南京建成,中国)根据制造商的指示。总之,SOD、猫和由黄嘌呤氧化酶分析oxidase-xanthine反应方法,CAT-H2O2分别反应方法,减少谷胱甘肽的方法。MDA的能力被2-thiobarbituric酸法和化验T-AOC被ferric-reducing /抗氧化力量反应方法检测到。所有样品都是通过测量紫外/可见分光光度计(UV - 2450,日本岛津公司,京都,日本)。
2.4。分析血清细胞因子的浓度
血清浓度的白介素(IL) 1βil - 12、il - 4、il - 6,引发,粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gm - csf)、转化生长因子- 1 (TGF -β1)、肿瘤坏死因子(TNF)α、il - 10和移行细胞(IFN -γ)使用猪细胞因子测定数组QAP-CYT-1 (RayBiotech Inc .,广州,中国)。基于数组的多路ELISA系统被用于定量测定多种细胞因子根据制造商的协议。简单地说,100年μL样品稀释剂添加到每个好块幻灯片,然后腾出30分钟。100年μL的样本或细胞因子标准添加到板和孵化一夜之间在4°C。提供样本和洗5和2次清洗缓冲I和II,分别。盘子里是80年孵化μ检测抗体的鸡尾酒的L 2 h,然后洗。80年μL Cy3染料等效dye-conjugated链霉亲和素添加到每个好,板在黑暗的房间里孵化1 h。被洗了5次后,幻灯片的幻灯片被放置洗衣机/干衣机,轻轻的用洗缓冲I和II 15和5分钟,分别。信号可视化使用InnoScan 300芯片扫描仪(Innopsys,帕洛阿尔托研究中心d 'Activites Activestre, Carbonne,法国)配有Cy3波长(绿色通道,激发532海里),和定量数据分析使用Quantibody®Q-Analyzer (QAP-CYT-1 RayBiotech Inc .)。
2.5。测定血清二胺氧化酶(DAO)和D-Lactate
刀的血清浓度测定反应系统包括0.1毫升(4μg)辣根过氧化物酶溶液(美国圣路易斯Sigma-Aldrich), 3毫升PBS(0.2米,pH值7.2),0.1(500毫升O-dianisidine甲醇的解决方案μ克O-dianisidine)(美国圣路易斯Sigma-Aldrich), 0.5毫升样品和0.1毫升衬底(175的解决方案μg的尸胺盐酸盐)(美国圣路易斯Sigma-Aldrich)。处理过的样品在孵化器孵化室在37°C 30分钟,以436海里的紫外/可见分光光度计(UV - 2450(日本岛津公司,京都,日本)23]。血清D-lactate决心使用D-lactate分析工具包(BioVision山景,旧金山,美国)按照制造商的指令(24]。
2.6。肠道形态学评价和组织病理学分级
空肠和回肠的形态进行了分析使用苏木精伊红染色根据肖et al。23]。绒毛高度和隐窝深度与计算机辅助显微镜测量(测微的TM;尼康ECLIPSE E200,日本东京)。
组织病理学分级空肠、回肠、结肠前、后结肠进行如前所述[25]。组织学评分是由兽医病理学家使用的方法黄等。25],范围从0(最小损伤)15(最大伤害)对应于四个等级,其中包括单核或多形核细胞浸润,组织损伤,和侵蚀或上皮增生。
2.7。分析髓过氧化酶(MPO)活动在结肠
结肠癌样本均质在10卷的冰冷的磷酸钾缓冲(pH值6.0)含0.5%氢氧化hexadecyltrimethylammonium通过高压均质器在10000 - 15000转4°C。匀浆离心机在2500×r在4°C 15分钟,上层清液转入PBS (pH值6.0)含0.17毫克/毫升3,3′H -dimethoxybenzidine和0.0005%2O2。MPO活性评估通过测量H2O23′端依赖氧化3日-imethoxybenzidine。一个单位的酶活性被定义为MPO礼物的数量,导致吸光度的变化每分钟460 nm和37°C (26,27]。
2.8。统计分析
数据增长的性能进行的方差分析(方差分析)和其他措施重复使用SPSS 17.0软件进行方差分析(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。处理间差异图基的测试评价。概率值< 0.05被送往显示统计学意义。
3所示。结果
3.1。生长性能
体重,平均每日增加,平均日采食量,并获得:喂率如表所示2。体重在天0 7和14中类似的治疗( )。仔猪的体重基底饮食+治疗轻(溴杀 )比基底饮食和EUF饮食+杀治疗21天。小猪相比基底饮食治疗,敌草快曝光减少每日平均增益,增益:饲料比例从7到14天14到21日平均日采食量和增益:进给比从14至21天 )。然而,没有差异平均每日增加,平均日采食量,并获得:喂比小猪基底之间的饮食疗法和EUF饮食+杀治疗( )。在diquat-treated小猪,膳食EUF增加平均每日获得从14至21天,平均每日采食量从7到14天14到21日,获得:喂率从7到14天( )。
3.2。血清抗氧化参数
14天,暴露于敌草快下降( )血清SOD含量,氧化酶,猫,T-AOC,谷胱甘肽在小猪的基底的饮食治疗。但EUF增加的补充( )血清SOD含量,氧化酶,猫,T-AOC,谷胱甘肽在小猪EUF饮食+治疗与溴杀猪的基础饮食+杀治疗。21天,没有差异( )在血清SOD浓度观察,猫,T-AOC,中谷胱甘肽治疗,除了猪EUF治疗有更大的( )氧化酶比diquat-challenged猪美联储与基底的饮食。没有差别的血清MDA浓度在治疗14天、21天( )(表3)。
3.3。血清的细胞因子
暴露于敌草快增加( )血清il - 1的浓度βgm - csf、il - 6、引发、白介素,TNF -α、il - 10和干扰素-γ但下降( )TGF -β1内容当猪喂养与基底在14天的饮食。饮食EUF下降( 血清il - 1的浓度βgm - csf、il - 6、引发、白介素,TNF -α、il - 10和干扰素-γ但增加( )血清il - 4和TGF -β1与基底与diquat-challenged猪相比,美联储在14天的饮食。21天,没有差异( )观察血清细胞因子浓度在3治疗,除了杀注入增加( )血清TNF -α与基底和il - 10与nonchallenged猪喂食物。补充EUF减少( )血清TNF -α浓度与杀猪的挑战时(表4)。
3.4。血清浓度D-Lactate和二胺氧化酶
敌草快暴露增加( D-lactate)血清浓度和二胺氧化酶与基底猪喂饮食14天;然而,这并非如此在21天。没有观察到的差异的血清浓度D-lactate和二胺氧化酶猪美联储与基底之间的饮食和饮食EUF 14和21天( )(表5)。
3.5。空肠和回肠的形态
敌草快挑战减少( 空肠和回肠绒毛高度和空肠和回肠的肠绒毛高度、隐窝深度,但增加( 14天)回肠隐窝深度当猪喂基底的饮食。包含EUF增加( 空肠和回肠绒毛高度和绒毛高度、隐窝深度、基底的diquat-challenged猪与饮食14天。没有观察到的差异在绒毛高度和隐窝深度空肠和回肠3治疗21天( )(表6)。
3.6。组织病理学分级
敌草快暴露增加( )的组织病理学分级空肠、回肠、结肠前,和结肠后14天,但是没有差异( 在21天)观察组织病理学分级。与基底的饮食+杀治疗相比,较低的组织病理学分级空肠、回肠、结肠前、后结肠的小猪EUF +杀治疗观察14天( )(表7)。
3.7。髓过氧化物酶活性
敌草快挑战增加( )的前部和后部结肠MPO活性小猪14天,如果他们与基底的饮食喂养。补充膳食EUF减少( )后结肠的MPO活性与diquat-challenged猪相比,美联储与基底的饮食。然而,未观察到的差异中MPO活性3治疗21天( )(图1)。
4所示。讨论
氧化应激导致细胞损伤和组织损伤日益公认的因素在许多慢性疾病如心脏病、老年痴呆症和帕金森疾病,甚至癌症(1,5]。因此,抑制氧化应激将是一个潜在的策略来预防慢性疾病。已经有相当大的兴趣从天然产物抗氧化制剂的隔离和表征(6,8,9]。本研究关注欧盟树叶黄酮的抗氧化活性,在中国的广泛栽培。
在目前的实验中,氧化应激引起的小猪模型敌草快和已广泛应用在活的有机体内(18,19]。据报道溴杀损害生长性能和养分利用率(18,19]。减少肠道形态和生长性能被杀的挑战在当下同意发表的报告(28]。这主要是由于氧化平衡的破坏(18),这是证明血清SOD浓度下降,氧化酶,猫,T-AOC,谷胱甘肽在小猪的基底接触杀注射后的饮食治疗。在前面的研究中,已经证明溴杀增加血清MDA浓度也抑制SOD和氧化酶的活动18,19]。此外,目前的结果血清细胞因子浓度,肠组织病理学分级、和MPO活性表明,敌草快评估断奶猪的炎症反应,这与先前的研究一致(9,28,29日]。
然而,饮食补充EUF显示缓解这些杀引起的负面影响。首先,EUF显著提高断奶仔猪的生长性能和促进这种增长的影响类黄酮还演示了在鹅、鸭子,肉的羊和去脂猪(30.- - - - - -33]。因此,大规模的性能试验应进行验证使用的潜在EUF作为断奶猪的生长促进剂。
黄酮的抗氧化能力的机制包括抑制活性氧的形成通过抑制酶参与生产,清除活性氧或upregulation或保护的抗氧化防御系统8]。敌草快可以刺激细胞产生活性氧,抑制抗氧化酶的活动如SOD和氧化酶(18,19,34]。抗氧化酶SOD、CAT,氧化酶可以中和毒性氧产品,从而规范人体体内平衡(2]。SOD超氧化物自由基转化为H2O2转化为水的氧化酶和猫35]。氧化应激的结果失败的抗氧化酶,消除自由基(36]。目前的结果表明,EUF施加抗氧化作用在第一道防线通过增加血液中的抗氧化酶水平中和活性氧。
氧化应激和炎症之间的关系已经被先前的研究记录(5,37]。在目前的研究中,膳食补充剂与EUF显著缓解杀引起的炎症反应。多余的血清中抗氧化酶和肠可能与生产相关的促炎和抗炎细胞因子在各自的位置38]。证据表明,自由基尤其是H2O2不可能回应二级信使刺激促炎细胞因子(39,40]。血清细胞因子概要文件可以用作炎症标记物(41,42]。促炎细胞因子il - 1等β、白介素、干扰素-γ肿瘤坏死因子-α巨噬细胞激活后发布的,il - 1 NF -κB通路,负责一个至关重要的因素在病理条件下诱导炎症反应(43,44]。
它表明黄酮类化合物被吸收不好,他们的浓度可能更高的流明胃肠道比曾经在等离子体(45]。因此,消化道的主要网站提供抗氧化防御类黄酮(45,46]。EUF改善肠道的形态结构和屏障功能在目前的研究中,由高证明绒毛高度和低浓度的D-lactate和二胺氧化酶。标记的肠道的完整性,降低血清二胺氧化酶和D-lactate小肠上绒毛的发布的内容显示小损伤的肠道完整性(47,48]。肠道屏障功能的改善可能反映了减轻炎症反应的49]。
总之,黄酮提取杜仲叶子也表明抗氧化活性和抗炎作用。结果表明,膳食补充剂EUF缓解增长的性能障碍,氧化应激,炎症反应,引起的肠道损伤杀小猪。这些发现将有助于未来的抗氧化治疗的发展,新的抗炎药物和EUF在小猪的应用。需要进一步的研究来阐明EUF-regulating氧化应激在炎性疾病的分子机制。
缩写
| 猫: | 过氧化氢酶 |
| 刀: | 二胺氧化酶 |
| EUF: | 杜仲黄酮 |
| gm - csf: | 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 |
| 氧化酶: | 谷胱甘肽过氧化物酶 |
| H2O2: | 过氧化氢 |
| 干扰素-γ: | 移行细胞 |
| IL: | 白介素 |
| MDA: | 丙二醛 |
| MPO: | 髓过氧物酶 |
| NF -κB: | 核因子kappa-beta |
| 没有: | 一氧化氮 |
| RNS: | 活性氮物种 |
| ROS: | 活性氧 |
| SOD: | 超氧化物歧化酶 |
| T-AOC: | 总抗氧化能力 |
| TGF -β1: | 转化生长因子1 |
| 肿瘤坏死因子-α: | 肿瘤坏死因子。 |
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
Daixiu元,Tarique Hussain贡献同样这项工作。
确认
这个项目是由中国国家自然科学基金(31560640,31560640,31560640,31672433),关键项目的前沿科学研究中国科学院(QYZDY-SSW - SMC008),和植物资源保护与利用重点实验室学院湖南省(JSK2016ZZD004)。