文摘
可逆心肌缺血/再灌注(I / R)或缺血预处理(IPC)与立即基因组反应;IPC-induced立即早期基因与减少梗塞大小有关。因为眼前的早期反应基因x - 1 (IEX-1)在细胞凋亡中起着核心作用,我们检查是否IEX-1施加对I / R损伤的保护作用。我们发现IEX-1 mRNA水平增加IPC-imposed鼠的心脏。然而,在I / R表达下调大鼠心脏,由原位IPC阻止。IEX-1撞倒时,IPC所强加的保护作用减弱。当地的基因传递Ad-IEX-1左心室大大降低心脏梗塞大小和改善心脏收缩功能的I / R心在老鼠。相比之下,推倒IEX-1表达式加重心肌梗塞。过度的IEX-1新生大鼠心肌细胞显著减少hypoxia-reoxygenation-induced细胞内线粒体活性氧积累和细胞凋亡。此外,IPC-induced磷酸化和粒子易位PKCε被推倒IEX-1体内受损,和overexpressing IEX-1显示出类似的心脏保护由IPC。 Our results demonstrate that IPC increases IEX-1 expression, which may promote phosphorylation and particle translocation of PKCε and thus reduce intracellular ROS accumulation. These beneficial effects reduce cardiomyocyte apoptosis and necrosis to alleviate cardiac infarction.
1。介绍
及时的心肌缺血后再灌注的策略来挽救心肌致命伤害的风险。然而,突然恢复缺血心肌的血流量具有的潜力引入额外的心肌细胞损伤和死亡的1,2]。这样的再灌注损伤(RI)涉及线粒体渗透性转换孔开放注射(MPTP药物)条件下随再灌注的钙超载和氧化应激。注射防止MPTP药物开放,因此可以由国际扶轮缺血预处理(IPC)之前长时间缺血期间的一个或多个简单的循环缺血和再灌注3,4]。
有大量的数据暗示许多不同的信号通路在预处理,和每个仍热议的相关作用。其中,有大量的证据表明,蛋白激酶C (PKC)在预处理中起着核心作用5]。还有一些争议的PKC可能参与IPC。然而,有大量的证据表明PKCε作为重要的球员在IPC (5]。PKC的拟议的机制ε线粒体ROS介导心脏保护是一代在IPC可能导致激活PKCδ。这增加腺苷生成和释放导致激活磷脂酶c代甘油二酯和inositol-triphosphate导致钙释放和激活PKCε(5]。然而,很少研究PKC激活是否受立即早期基因。
IPC,循环的短时间缺血再灌注(I / R),强化氧化还原信号将死亡信号转化为生存的保护缺血性心脏(6]。先前的研究表明,IPC导致原癌基因的表达或立即早期基因如c-Fos,原癌基因,c-Jun,和Egr-1孤立的老鼠的心脏,这是与改善心室功能,减少梗塞大小(7- - - - - -9),但潜在的机制涉及立即早期基因保护缺血心脏仍然遥遥无期。
即早期反应基因x - 1 (IEX-1),也称为第22位/ PRG1老鼠或者鼠标同系物gly96,是一种新型的应激即刻早期基因。它可以快速调节各种细胞类型的辐照,病毒感染,炎症细胞因子、化学致癌物质,生长因子和激素的控制下转录因子如NF -κB / rel p53, Sp1,原癌基因,AP-1吴(审核通过)10]。像其他立即早期基因,IEX-1扮演一个关键的角色在细胞生存压力条件下(11- - - - - -16]。减少IEX-1表达式是证明与增强的细胞凋亡在titin-deficient扩张型心肌病小鼠模型[17]。此外,IEX-1调节几个蛋白激酶活动的能力,如ERK和一种蛋白激酶,通过相互作用蛋白磷酸酶2 (PP2A) [18,19]。
在目前的研究中,我们研究是否IEX-1发挥保护作用对I / R损伤对大鼠新生儿和成人的心。我们发现IEX-1表达式缺血大鼠心脏中表达下调,但被IPC救起。恢复IEX-1表达式不仅减少了I / R-induced细胞凋亡和坏死,也减轻心脏梗塞。假定的机制包括增加激活PKC和减毒I / R-induced活性氧积累。
2。材料和方法
2.1。Adenoviral载体建设
Replication-deficient运载体包含人类IEX-1 cDNA (Ad-IEX-1)或GFP (Ad-GFP)巨细胞病毒(CMV)启动子的控制下了,准备根据制造商的指令(BD生物科学,圣何塞,CA)。运载体携带细菌β牛乳糖(广告-β加)请提供h .程教授(北京大学、中国)。
2.2。大鼠心肌缺血模型和IPC
所有的动物获得了人道关怀遵守制度权威实验动物照顾北京大学健康科学中心。Sprague-Dawley (SD)大鼠心脏缺血和IPC手术是前面描述的20.]。短暂,开胸后,老鼠接受了30分钟的心肌缺血,然后3或再灌注24小时。IPC治疗之前,致命的I / R,老鼠接受了三个周期的短I / R(4分钟/ 4分钟)。执行当地的基因传递与先前描述的协议(21]。四天前缺血,5×109250年点状单元(pfu)腺病毒μl的病毒解决方案是左心室肌壁心肌内的注入。
2.3。在活的有机体内小干扰RNA镇压
我们核/转染剂溶液注入左心室肌壁达到足够的siRNA浓度IEX-1镇压在心脏组织。老鼠被戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(60毫克/公斤)。开胸后,核(20μg核/公斤体重)一起转染剂解决方案(jetPEI PolyPlus转染)是心肌内的注入在5(小伙子)左前降枝预定地区区域。总共有250μl siRNA /转染剂解决方案的交付。注射由一个调查员进行盲评。隐形siRNA针对老鼠IEX-1(意义:cca aca uug cca aga gga ucc ucu u;反义:亚美大陆煤层气有限公司gg auc中联科利uug gca 8月uug g)和控制核(猫号码:12935300)是合成了表达载体(表达载体,CA)。注入,两天后心脏注射区域周围组织切除,IEX-1水平由实时聚合酶链反应和免疫印迹。
2.4。新生大鼠心室心肌细胞文化
新生大鼠心室心肌细胞分离得到1 -幼童Sprague-Dawley老鼠(22]。实验研究在文化的第三天。缺氧/复氧(H / R),细胞在缺氧培养的缓冲区(在118年更易/ l氯化钠,NaHCO324日,KH氯化钾16日2阿宝41,CaCl22.5,MgCl21.2,Na+EDTA 0.5和Na+pH值6.2)和乳酸20日接受O < 1%2+ 5%股份有限公司2+氩治疗4 h,然后被转移到5%的股份有限公司2+ 95%的空气再氧化。与10分钟和10分钟后缺氧复氧预处理的被认为是一个周期。
2.5。实时聚合酶链反应和免疫印迹分析和免疫染色
细节的实时PCR,免疫印迹分析,和疣状,看到网上在线数据补充https://doi.org/10.1155/2017/6109061。
2.6。测量的活性氧积累
细胞内活性氧和线粒体活性氧的积累与luminol-derived化学发光检测,DCFH-DA, MitoTracker®红色CM-H2XRos(详情,请参阅在线数据补充)。
2.7。统计分析
所有的值表示为±SEM。对比以上两组分析单向方差分析后跟Tukey-Kramer事后测试。一个 被认为是具有统计学意义。
作者完全访问数据,并对其完整性负责。所有作者已阅读及同意写的手稿。
3所示。结果
3.1。IEX-1-Mediated IPC-Induced心脏保护
我们使用的模型原位IPC间歇性心肌梗塞检查第一IEX-1的表达鼠的心。如图1(一)IEX-1 mRNA水平迅速增加,IPC-imposed心,达到5分钟,拒绝之后,仍高于基准面1 h(图1(一))。致命的缺血(30分钟)本身并不促进IEX-1表达式,虽然IEX-1 mRNA水平增加在早期再灌注(30分钟)(图1 (b));它减少再灌注3小时时(图1 (c)),IEX-1 mRNA水平高的心,经历了IPC I / R比之前的心只接收I / R(图1 (c))。IEX-1蛋白水平降低再灌注3小时时由IPC获救之前,I / R(补充图1 a和B)。
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因为IPC能诱导IEX-1表达式,然后调查IEX-1水平的增加是否参与IPC-mediated心脏保护。小干扰RNA针对老鼠IEX-1 (siIEX-1)被用来推倒IEX-1表达的心。如数据所示1 (d),1 (e),1 (f)原位IPC保护心脏,揭示了减少梗塞大小、小干扰rna (csiR)集团在炒,但不是siIEX-1组。这些都是平行的,证实了减少释放乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK) csiR组的血清,但不是siIEX-1组(数字1 (g)和1 (h))。
IEX-1击倒受损IPC的保护作用,这进一步证实了超声心动图分析。如数据所示2(一个)和2 (b)观察、收缩功能受损帖子/ R I / R组评估射血分数(EF),缩短分数(FS),和收缩期左心室内部维度(LVID-s),而IPC-imposed老鼠显示改善收缩功能篇/ R csiR组。值得注意的是,堕落的收缩功能在老鼠对待siIEX-1 IPC之前,这是类似于老鼠,仅在I / R。
(一)
(b)
3.2。IEX-1超表达减弱心肌梗死
调查一个功能性IEX-1对缺血后心脏保护的贡献,我们开发了一个adenoviral向量表达人类IEX-1 (Ad-IEX-1)。在实验组中,Ad-IEX-1直接注入左心室壁,而对照组收到Ad-GFP或盐水。四天注射后,老鼠的心脏切除。的超表达IEX-1在心肌经免疫印迹(图3(一个)图2 a)和免疫染色(补充)。如数据所示3 (b),3 (c),3 (d),IEX-1过度引起严重的心脏保护。明显减少梗塞心被发现在这些动物的大小,与心接收盐水或Ad-GFP相比。此外,这些老鼠表现出低水平的血清LDH和CK(数字3(e)和3(f))。事故发生,细胞凋亡率在该地区面临风险,评估通过TUNEL染色,在IEX-1过表达显著降低大鼠(图3(g))。
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检查功能后果造成Ad-IEX-1基因传递,我们测量心脏收缩功能的超声心动图测量心脏血流动力学参数。值得注意的是,收缩功能受损帖子/ R,评估EF、FS, LVID-s,观察GFP组,而Ad-IEX-1交付老鼠显示改进的帖子/ R收缩功能(数据4(一)和4 (b))。同样,catheter-mediated心脏血流动力学参数的测量表明,平均动脉压、左心室收缩压,最大压力的增加和减少明显受损的帖子/ R,而这些参数是提高Ad-IEX-1交付老鼠(补充表1)。
(一)
(b)
3.3。SiRNA推倒IEX-1加重心肌梗塞
在互惠的方法中,我们使用核抑制心脏IEX-1体内的表达。数量5μ小干扰rna (siIEX-1)一起克IEX-1转染试剂直接注入大鼠左心室壁。IEX-1 mRNA水平减少在48小时接受(图5(一个)),和相应的减少蛋白质免疫印迹(图证实了5 (b)图2 b)和免疫染色(补充)。对I / R(30分钟/ 24小时),老鼠siIEX-1注入显示显著增加梗死大小表示为左心室面积的百分比(~ 7%),与动物相比控制核(数字5 (c)和5 (d))。同样,血浆LDH和CK活动增加老鼠接受siIEX-1(图5 (e)和5 (f))。
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3.4。IEX-1抑制H / R-Induced活性氧积累
因为活性氧积累在缺血和再灌注加重心肌细胞损伤(23,24)和PKCε减少这些ROS水平是预处理的关键一步3),因此,我们测试了的角色IEX-1 H / R-induced活性氧积累。新生大鼠心肌细胞腺病毒感染10莫伊和受到缺氧4 h,然后报化学发光和荧光分析细胞内活性氧积累。细胞内ROS在细胞显著减少overexpressing IEX-1(~ 74%减少化学发光,图6(一)~ 69%减少DCF荧光,人物6 (b))。
(一)
(b)
(c)
似乎在H / R,线粒体活性氧的主要来源在心肌细胞(25]。4 h缺氧后,心肌细胞被孵化与MitoTracker红色CM-H2XRos调查线粒体ROS(补充图3)。共焦显微镜显示,新生大鼠心肌细胞进行h / R显示荧光强度增加了5.5倍,在细胞接收Ad-IEX-1显著降低(图6 (c)),这表明IEX-1能够减少线粒体活性氧积累。
3.5。IEX-1降低H / R-Induced心肌细胞损伤
ROS增加是主要刺激线粒体死亡通路。然后,我们使用了一个体外H / R模型来研究IEX-1 H / R-induced心肌细胞死亡的影响。新生儿心肌细胞被感染Ad-GFP或Ad-IEX-1 5、10或20莫伊。H / R的侮辱后,Ad-IEX-1-infected细胞形态学变化显示低于那些感染Ad-GFP(补充图4 a)。IEX-1的过度表达,但不是GFP,大大减少LDH释放条件媒体(补充图4 b)。,caspase-3乳沟,表明细胞凋亡,减少细胞内overexpressing IEX-1(图7(一))。后H / R, caspase-3乳沟增加再氧化时间延长Ad-GFP——和Ad-IEX-1-infected细胞。然而,裂解caspase-3少细胞overexpressing IEX-1在所有时间点(图7 (b))。与此同时,在细胞感染Ad-IEX-1 caspase-3/7活动减弱,而与Ad-GFP(图7 (c))。根据H / R, TUNEL-positive的百分比(凋亡)细胞也减少了IEX-1(图8 (d))。此外,减少线粒体细胞色素c细胞质IEX-1过表达细胞(数据泄漏7 (e)和7 (f))。在一起,这些数据表明IEX-1超表达对新生大鼠心肌细胞保护作用下H / R。
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3.6。IEX-1促进PKCε磷酸化和线粒体易位
然后,我们发现明确的PKC粒子易位ε之前在心肌细胞受到IPC I / R, IEX-1过表达也观察到同样的心;与这些相比,粒子PKC的易位ε显著抑制siIEX-1管理敲下来时心脏IEX-1(图8(一个))。然后,我们进一步发现phosphor-PKCε在IPC + I / R后的心;值得注意的是,增加phosphor-PKC水平ε通过IPC被废除IEX-1击倒(图8 (b))。
多个研究表明活化蛋白激酶Cε(PKCε)是至关重要的保护表型IPC对心肌I / R损伤(5]。因此,我们在培养心肌细胞证实这些结果。首先,体外IPC,称为缺氧预处理(HPC),引起短期缺氧和再氧化同样增加IEX-1表达式在mRNA水平(图8(c, d))和蛋白质水平(补充图5 a和B)。此后,我们培养的心肌细胞中过表达IEX-1, phosphor-PKCε增加细胞内接收Ad-IEX-1正常文化和通过/ R(图8 (e))。此外,免疫印迹显示IEX-1过度增加了PKCε线粒体蛋白质水平的分数(图8 (f))。和PKCε保护作用的抑制剂废除IEX-1 H / R-induced caspase-3激活(图8 (g))。
4所示。讨论
这项研究表明,IEX-1至关重要的心脏保护对I / R-induced IPC-induced受伤。我们发现IPC,常用在冠状动脉介入和冠状动脉旁路移植(26,27),可能会增加IEX-1缺血性心体内表达。当IEX-1表达式被核抑制,IPC所强加的保护作用减弱。使用功能的方法,我们表明,与体内表达IEX-1增强他们的宽容心,I / R。在互补实验,siRNA推倒内生IEX-1加剧了心脏损伤。分子基础的底层这种保护作用包括,但不限制,促进PKCε磷酸化和衰减的H / R-induced活性氧积累和细胞死亡。
可逆心肌I / R在人类心脏手术或鼠标IPC与立即基因组反应(28,29日]。IPC导致原癌基因的表达或立即早期基因等c-Fos,原癌基因,c-Jun,Egr-1孤立的老鼠的心脏,与改善心室功能,减少梗塞大小(7- - - - - -9]。我们的结果表明,Iex-1信使rna被IPC快速诱导,建议增加IEX-1表达式将有助于IPC的保护作用。论文是支持的事实siRNA推倒内生IEX-1加剧了心脏损伤,废除了IPC引起的保护作用,而overexpressing IEX-1 IPC表现出类似的保护作用。IEX-1在心肌细胞的凋亡效应和几个以前的研究是一致的。IEX-1-transgenic老鼠降低t细胞凋亡引发了FAS结扎或t细胞受体/ CD3复杂(30.]。p73 IEX-1超表达显著下降β介导和staurosporin-induced CHO细胞死亡(12,16]。然而,IEX-1也被证明在CHO细胞,增加细胞凋亡率HaCaT角化细胞(15,海拉细胞13),或HEK293细胞(14]。IEX-1的不同角色的职业——或者antiapoptosis可能取决于细胞类型,表达水平和类型的刺激。通过转录因子如NF -κB / REL复合物、p53、SP1,原癌基因,和AP-1 IEX-1可以诱导多种细胞类型的辐照,病毒感染,炎症细胞因子、化学致癌物质,生长因子,和激素(了16),和原癌基因,NF -κB, AP-1 IPC响应(31日];这些转录因子可能参与的直接感应IEX-1 IPC。
充足的证据牵连到mitochondrion-originated ROS, NADH-dependent微粒体,和NOS很可能是在初始损伤心肌细胞缺血和再灌注期间结束时25,32- - - - - -35]。ROS,压力会导致脂质过氧化,引起蛋白质氧化,DNA链断裂,影响正常的心脏功能。尽管在缺氧(ROS生成36),一个健壮的活性氧发生后复氧(37]。在心脏,线粒体可能是复氧后活性氧的主要来源和/或再灌注(25]。ROS增加注射是一种主要刺激MPTP药物打开,导致受损的线粒体膜(38,39]。事实上,注射开放MPTP药物,从线粒体释放细胞色素c,激活半胱天冬酶级联可能是一系列事件,引起再灌注期间不可逆转的损伤(39- - - - - -41]。IEX-1过度降低活性氧积累,就是减少luminal-derived化学发光,荧光光纤,和红CM-H2XRos荧光,细胞质中线粒体细胞色素c泄漏有限。因此,IEX-1可能参与维持线粒体膜的完整性,防止线粒体死亡通路通过抑制线粒体活性氧的生产。
线粒体调解各种细胞功能包括能源和ROS生产和信号转导。线粒体也主要监管机构的细胞生存能力和发挥核心作用的坏死和凋亡细胞死亡通路诱导心脏I / R损伤。PKCε在心血管信号通路中起着至关重要的作用,保护心脏I / R (42]。新出现的证据表明,PKC的护心的目标ε驻留在线粒体,包括mitoK三磷酸腺苷(线粒体ATP-sensitive K+频道)43注射),组件的MPTP药物(44),和组件的电子传递链(45),而磷酸化和PKC的线粒体易位ε需要心脏保护(46]。据报道,细胞质的位置,包括线粒体位置,IEX-1至关重要的凋亡和抗氧化作用12]。在目前的研究中,我们发现IEX-1和PKCε与线粒体;IEX-1表达式的PKC IPC-induced磷酸化是必要的ε体内和体外促进线粒体PKC的易位ε。因为激活PKCε对心脏保护对I / R IPC-induced至关重要,促进PKC吗ε激活的主要机制可能IEX-1-mediating IPC-induced心脏保护,PKCε抑制剂阻止IEX-1的保护作用。然而,IEX-1-promoting PKC的机制ε磷酸化和线粒体易位仍有待阐明。值得注意的是,IEX-1的交互的核心作用是PP2A IEX-1-modulating ERK和AKT活动(18,19),这也可能是IEX-1-promoting PKC的机制ε活动。另一方面,潜在影响的IEX-1 ERK和AKT活动可能也有助于心脏保护,随着心脏保护[IPC-induced AKT-ERK-NO通路是另一个重要机制47]。
总之,我们证明IEX-1是关键在预防心脏损伤和氧化应激介导IPC-induced在大鼠心脏保护。除了这个新发现的抗氧化效果,IEX-1抑制对高血压的影响,neointima形成,和心脏肥大(48- - - - - -50]。因此,IEX-1心血管基因。早期反应基因的识别参与心脏I / R-induced侮辱可能揭示了一个新的治疗策略探索缺血性心脏疾病的目标。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
确认
作者从北京大学谢谢程教授张友谊和和平的建议。本研究支持的中国主要国家基础研究项目(没有。2006 cb503802),中国国家自然科学基金(没有。30821001,没有。30500198李文静,没有。81470557 Ming-Jiang徐)和“111”授予教育部授予西安Wang和国家心脏,肺和血液研究所(HL77448, HL88940约翰Y.-J。Shyy)。
补充材料
补充图1 (A) IEX-1蛋白质含量在老鼠的心脏post-IPC + I / R被包含IHC检测,(B)包含IHC染色强度测量。n = 5 ~ 6 * P < 0.05 vs骗局,# P < 0.05 vs I / R。补充图2 (A)在大鼠左心室部分Ad-GFP和Ad-IEX-1表达。老鼠的心脏被切除腺病毒注射后4天。在荧光显微镜检测到GFP表达(顶部,放大×200)。IEX-1表达式通过免疫组织化学染色法检测反IEX-1抗体(底部,放大×200)。(B)大鼠接受开胸手术,然后5µg炒(csiR)或IEX-1siRNA (siIEX-1)在250年与转染试剂µl直接心肌内的注入生理盐水(NS)的左室肌壁。2天后,心被切除,分段,沾anti-IEX-1抗体。正常免疫球蛋白作为消极的控制。补充图3 MitoTracker®红色CM-H2XRos探测器是用来定位在线粒体ROS点分布模式。 Image acquisition was by confocal microscopy. Supplemental figure 4 IEX-1 overexpression attenuated H/R-induced cardiomyocyte injury. Neonatal rat cardiomyocytes were infected with corresponding adenovirus for 36 hr, then underwent hypoxia for 4 hr. (A) Cardiomyocyte morphology after reoxygenation for 4 hr. Results are from one representative experiment of 3 (magnification ×150). (B) LDH release in the cell culture medium after reoxygenation for 4 hr. Triangle represents adenovirus infection at 5, 10, and 20 multiplicities of infection (MOI). Each column represents results of at least 3 independent experiments. *P<0.05 vs. control (Ctrl), #P <0.05 vs. corresponding Ad-GFP group. Supplemental figure 5 Neonatal rat cardiomyocytes were subjected to HPC or HPC+H/R. (A) IEX-1 mRNA was analyzed by real-time PCR. (B) IEX-1 protein was detected by western blot. N=3, * P<0.05 vs Con or H/R. Supplemental table 1. IEX-1 overexpression improves cardiac function after acute I/R.