文摘

高血糖诱导应激在糖尿病患者的大脑触发血脑屏障(BBB)的破坏,导致不同的神经疾病,包括中风和痴呆。最近,微rna的作用变得感兴趣研究破译大脑内皮细胞损伤的机制在高血糖。因此,我们调查是否mircoRNA Let7A (miR-Let7A)控制大脑的损伤内皮细胞(bEnd.3)对高葡萄糖条件。细胞活力、细胞死亡标记表达式(p-53、伯灵顿和裂解聚ADP-ribose聚合酶),紧密连接蛋白的损失(ZO-1和claudin-5),促炎反应(白细胞介素- 6、肿瘤坏死因子-α)、诱导一氧化氮合酶和亚硝酸盐生产被证实使用麻省理工,一、定量pcr,免疫印迹、免疫荧光和格里斯试剂测定。miR-Let7A超表达显著预防细胞死亡和损失的紧密连接蛋白和减毒促炎反应和亚硝酸盐生产弯曲。在高葡萄糖条件下3细胞。综上所述,我们建议miR-Let7A可能减弱大脑内皮细胞损伤通过控制细胞死亡信号,紧密连接蛋白的损失,并针对高葡萄糖促炎反应压力。在未来,操纵miR-Let7A可能是一个新颖的解决方案在控制BBB破坏导致中枢神经系统疾病。

1。介绍

血脑屏障(BBB)是一个组织良好的大脑生理结构由几个细胞,如内皮细胞、周,和星形胶质细胞的中枢神经系统(CNS),严格控制的运动细胞和分子之间的血液和脑实质1]。大脑内皮细胞作为主要成分BBB相连的紧密连接蛋白之间的相互作用,如claudins和occludin [2]。作为一个完整的BBB对维持大脑的微环境是必要的,BBB的分解与各种疾病的发生,包括中风、痴呆、癫痫(3,4]。几项研究表明,糖尿病引起的神经功能障碍的风险由于BBB破坏(5,6]。高葡萄糖条件糖尿病引起微血管的改变7,8)和神经血管单元(6]。在糖尿病控制BBB的微环境,许多研究人员调查了多高葡萄糖条件触发大脑内皮细胞的死亡9,10)和紧密连接蛋白的降解是参与BBB通透性(11,12]。

小分子核糖核酸与21 - 25日核苷酸nonprotein-coding rna已经知道控制各种基因表达在转录后的级别定位和3′utr mRNA和发挥重要的监管机构的代谢疾病,从而成为生物标志物和治疗靶点13,14]。小分子核糖核酸,microRNA-Let7A (miR-Let7A)是最近的建议作为治疗目标提高病理条件(即代谢相关疾病。、癌症、糖尿病、肥胖、炎症、血管疾病等)(15- - - - - -25]。这是参与细胞衰老,葡萄糖代谢和炎症通路(15- - - - - -25]。在高葡萄糖条件下,miR-Let7A可以控制细胞因子的生产(21)和炎症机制(25,20.]。然而,监管miR-Let7A对代谢状态的影响与高血糖的条件是不同的研究包括:一些报道miR-Let7A的防护性能,但其他人提出的负面属性(15- - - - - -26]。正如上面提到的,最近的研究报道的参与microrna在BBB破坏的控制,但机制不完全清楚。此外,很少有研究的角色miR-Let7A脑血管系统包括BBB高血糖的条件下。因此,本研究旨在调查miR-Let7A在大脑内皮细胞的作用,例如,细胞凋亡,紧密连接蛋白表达,高葡萄糖条件下和炎症反应,这可能表明,操纵miR-Let7A将保护BBB破坏至关重要。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

老鼠大脑内皮细胞(弯曲。3cells) (ATCC Manassas, VA, USA) were cultured in Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) (Gibco, Grand Island, NY, USA) which contained 0.45% glucose, 0.37% NaHCO₃4毫米的谷氨酰胺,10%胎牛血清的边后卫,100μ青霉素g / ml, 100μ克/毫升链霉素。弯曲。3cells were cultured in a humidified incubator at 37°C with 5% CO₂。与葡萄糖的细胞治疗(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)在不同浓度(100μM、10毫米和25毫米)24小时。

2.2。(3)- 4 5-Dimethylthiazol-2-yl 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)测定

检查细胞生存能力,我们进行了3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2, 5-diphenyltetrazolium溴化(MTT)测定。在暴露于不同浓度的葡萄糖,弯曲。3细胞(2×10⁵细胞/毫升)和PBS冲洗三次。接下来,培养基替换为无血清培养基,和100年μl (MTT (Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)解决方案在PBS(2毫克/毫升)是治疗好。孵化后1小时30分钟,中移除,二甲亚砜(DMSO)增加了0.1%甲瓒反应产品的解决方案。每个好测量的上层清液使用ELISA读者波长570纳米。所有的实验都重复三次。计算相对于参与细胞的异常,其细胞的异常被认为是100%。

2.3。微rna转染

从Ambion miR-Let7A购买(美国奥斯汀,得克萨斯州)和遵循制造商的协议。两种miR-Let7A被用于这项研究;Let-7A模仿(目录号码,4464066;测定ID, MC10050)和Let-7A抑制剂(目录号码,4464084;测定ID、MH 10050)。负面的表达和抑制水平验证(目录号码,4464058)和积极控制microrna(目录号码,4464062)。弯曲。3cells were cultured for 2 days and were then treated with miR-Let-7A and miRNA negative control for each group.

2.4。免疫印迹分析

弯曲。3cells were washed with PBS and collected. The cell pellets were lysed with cold RIPA 20 min at 4°C to produce whole-cell extracts. Protein (25 μg)在细胞分离SDS-polyacrylamide凝胶12%,转移到一个聚乙二烯二氟化物膜。与脱脂牛奶阻塞后准备在tris-buffered saline-Tween (TBST) (20 nM三,pH值7.2,150毫米氯化钠,0.1%渐变20)在室温下1小时30分钟,免疫印迹孵化了14个小时在4°C主要抗体检测裂解聚ADP-ribose聚合酶(PARP) (Abcam 1: 1000年,剑桥,妈,美国),claudin 5 (CLD5)(1: 1000年,细胞信号,丹弗斯,妈,美国),或β肌动蛋白(1:1000;美国微孔,Billerica的)。屁股被孵化与特定的二级抗体(Abcam、剑桥、马、美国)在室温下2小时。屁股被ECL可视化解决方案(美国微孔,Billerica的)。

2.5。逆转录聚合酶链反应(rt - pcr)

RNA在弯曲。3cells was extracted using Trizol Reagent (Gibco, Grand Island, NY, USA). Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was conducted by using Invitrogen One step III™ Reverse Transcription PCR kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). PCR was performed following thermal cycling conditions: 95°C for 10 min; 40 cycles of denaturing at 95°C for 15 seconds, annealing at 60.5°C for 30 seconds, and elongation at 72°C for 30 seconds; final extension at 72°C for 5 minutes; and holding at 4°C. PCR was performed using the following primers (5′ to 3′): tumor necrosis factor (TNF)-α(F);CGT CAG 20 ATT TGC答CT, (R);CGG行动20 CAA AGT CTA AG);白介素(IL) 6 (F);GTT GCC TTC TTG GGA CTG, (R);CTG GCT TTG TCT TTC TTG TTA T;CLD5 (F);CTG CTG公司治理文化创新艺人经纪公司GTT猫T (R);TGC广汽ACG GGC ACA G;诱导一氧化氮合酶(间接宾语)(F); GGG AAT CTT GGA GCG AGT TG, (R); GTG AGG GCT TGG CTG AGT GA, Bax (F); AAG AAG CTG AGC GAG TGT, (R); GGA GGA AGT CCA ATG TC, p-53 (F); GAG TGT TCC GTG TAT GGC AC, (R); GAT GCC TTG GAT GAT GGT C, ZO-1 CAG CCG GTC ACG ATC TCC T, (R); TCC GGA GAC TGC CAT TGC, GAPDH (F); GAC AAG CTT CCC GTT CTC AG, (R); GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT. PCR products were electrophoresed in 1% agarose gels and stained with mango blue. All samples were normalized with GAPDH.

2.6。TaqMan化验的microrna的

分析miR-Let7A水平,进行逆转录使用Taqman微RNA逆转录工具包(美国应用生物系统公司,沃尔瑟姆,马萨诸塞州)和10 g RNA。PCR反应按制造商的协议进行了量化的microRNA Let7A使用Taqman普遍PCR大师混合,没有Amp擦掉)(美国应用生物系统公司,沃尔瑟姆,马萨诸塞州)和Taqman microRNA化验(美国应用生物系统公司,沃尔瑟姆,马萨诸塞州)miR-Let7A。PCR扩增是在豆类进行实时PCR(豆类、东京、日本)在95°C 10分钟,其次是40周期在95°C,持续15秒,60秒和60°C。PCR孵化概要文件扩展到40 miR-Let7A周期。使用ΔΔCt方法计算的微分水平。水平的microrna Let7A被表示为一个相对数量(RQ)规范化U6。PCR反应进行了三次。

2.7。定量实时聚合酶链反应

细胞总RNA提取的细胞使用试剂盒试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的指示。保利(A)添加使用保利(A)聚合酶(美国Ambion、奥斯汀、TX)。一步SYBR®'脚本™rt - pcr工具包II(豆类、日本)被用来进行qPCR。使用以下引物进行PCR (5′, 3′): ZO-1 CAG 20 GTC ACG ATC T移行细胞癌,(R);GGA广汽TGC猫TGC移行细胞癌,肿瘤坏死因子-α(F);CGT CAG 20 ATT TGC答CT, (R);CGG 20 CAA AGT CTA AG,伊诺(F);GGG AAT GGA GCG AGT TG,总部(R);GTG gg GCT TGG CTG AGT GA。每个因素的表达评估使用ABI棱镜7500实时PCR系统(美国生命技术公司,CA)与Ct量化比较和分析。β肌动蛋白是放大作为内部控制。的值是相对数量(RQ)。所有的实验都重复三次。

2.8。免疫细胞化学

弯曲。3cells were washed thrice with PBS and were permeabilized for 20 minutes. bEnd.3 cells were incubated with the primary antibodies for 12 hours at 4°C. The following primary antibodies were used: anti-rabbit CLD5 (1 : 500, Cell Signaling, Danvers, MA, USA) and anti-rabbit cleaved PARP (1 : 500, Abcam, Cambridge, MA, USA). After 16 hours incubation, bEnd.3 cells were washed three times with PBS and incubated with each specific secondary antibody for 1 hour at room temperature. bEnd.3 cells were counterstained with 1 μg / ml 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI 1: 100年,表达载体,卡尔斯巴德,CA,美国)在室温下5分钟。使用共焦显微镜图像得到(Thornwood卡尔蔡司,纽约,美国)。测量细胞三个随机选择的字段使用ImageJ immunodensity软件(ImageJ,麦迪逊,威斯康辛州,美国)。

2.9。测定亚硝酸盐生产

弯曲。3cells were seeded onto 96-well plates at density of 5 × 10⁴细胞/好,使用d -葡萄糖(25毫米),Let7A模仿或Let7A抑制剂。上层清液的收集和评估为亚硝酸盐生产使用格里斯试剂(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。格里斯试剂(100μl)添加和孵化在室温下30分钟。上层清液的吸光度测量在540 nm使用ELISA读者(Versamax分子器件、汉普顿,在北半球,美国)。

2.10。统计分析

统计分析是由SPSS 23.0软件(美国纽约阿蒙克的IBM公司)。结果表示为均值±标准差(SD)。统计分析使用单向方差分析(方差分析)其次是Bonferroni事后多重比较。每组实验包含至少3复制/条件。一个被认为具有统计显著性值小于0.05。

3所示。结果

3.1。高葡萄糖弯曲的条件与细胞死亡有关。在高葡萄糖体外条件下3细胞

评估弯曲的细胞死亡。3cells under high glucose condition, we performed MTT (Figure1(一))、rt - pcr (p-53和伯灵顿,数字1 (b)和1 (c))和免疫印迹(PARP裂解,图1 (d))分析。细胞的生存能力是剂量依赖性增加了25个,50和100μM 10点葡萄糖,然后逐渐下降,25岁和50毫米的葡萄糖。尤其是细胞异常暴露在25 - 50 mM的葡萄糖水平显著降低比参与控制细胞(图1(一))。因此,我们选择100μM、10毫米和25毫米的葡萄糖进行进一步的实验。mRNA水平p-53显著增加了葡萄糖治疗(100μM、10毫米和25毫米)(图1 (b)),和伯灵顿也增加了葡萄糖浓度治疗特别是在10毫米和25毫米(图1 (c))。此外,裂解PARP蛋白质含量明显,逐渐增加了葡萄糖治疗(100μM、10毫米和25毫米)(图1 (d))。

3.2。高葡萄糖条件与弯曲的丧失紧密连接的完整性。3细胞

检查弯管的紧junction-related蛋白质表达的变化。3cells under high glucose condition, we conducted RT-PCR (ZO-1 and CLD5, Figures2(一个)和2 (b))和免疫印迹分析(CLD5,图2 (c))。ZO-1的mRNA水平弯曲。3cells were significantly attenuated by the treatment of glucose (10 mM and 25 mM) (Figure2(一个))。的mRNA水平CLD5明显和剂量依赖性减少葡萄糖治疗(图2 (b))。此外,蛋白质含量CLD5也剂量依赖性降低葡萄糖治疗(图2 (c))。

3.3。高葡萄糖条件与生产相关的促炎细胞因子和伊诺弯曲。3细胞

调查的mRNA表达促炎细胞因子和伊诺弯曲。3细胞在高葡萄糖条件下,我们进行rt - pcr(数字3(一个),3 (b),3 (c))。肿瘤坏死因子-的mRNA水平α是剂量依赖性增加葡萄糖的治疗(图3(一个))。il - 6 mRNA水平也显著增加了葡萄糖治疗(图3 (b))。此外,伊诺的mRNA水平显著增加了葡萄糖治疗:特别是,显著增加观察葡萄糖(图25毫米3 (c))。

3.4。高葡萄糖条件参与(bEnd.3) miR-Let7A表达的差别,对这些基因的细胞

Taqman试验进行比较miR-Let7A参与细胞中表达水平,25毫米葡萄糖仅对细胞,Let7A模仿glucose-treated细胞过表达和25毫米。如图4,我们发现miR-Let7A 25毫米葡萄糖仅对细胞的表达水平明显低于在参与细胞。另一方面,miR-Let7A Let7A模仿中表达水平和25毫米glucose-treated细胞明显增加(超过2.5倍)相比,参与细胞或25毫米葡萄糖仅对细胞。这个结果可能表明miR-Let7A表达大脑内皮细胞在高葡萄糖条件下表达下调。

3.5。miR-Let7A参与调节细胞死亡和紧密连接蛋白弯曲。在高葡萄糖体外条件下3细胞

确认是否miR-Let7A参与调节细胞死亡和紧密连接蛋白的弯曲。3cells under high glucose condition, we performed immunofluorescence analysis for cleaved PARP and CLD5 with immunointensity calculation (Figures5和6)和qPCR ZO-1 mRNA表达(图7(一))。裂解PARP显然增加了治疗25毫米的葡萄糖。有趣的是,易位的裂解PARP核也观察到在glucose-treated弯曲。3细胞。另一方面,miR-Let7A超表达显著减弱裂解PARP的表达以及它的易位到细胞核glucose-treated弯曲。3细胞(图5)。减少CLD5水平高葡萄糖条件下明显恢复的超表达miR-Let7A(图6)。ZO-1的mRNA水平显著降低了25毫米葡萄糖相比之下,参与细胞的治疗。的mRNA水平降低ZO-1高葡萄糖条件下的超表达明显恢复miR-Let7A(图7(一))。另一方面,裂解PARP glucose-induced改变高,CLD5, ZO-1仍保留当miR-Let7A抑制剂处理(数据5和6)。

3.6。miR-Let7A变弱的mRNA表达TNF -α在弯曲,进气阀打开,亚硝酸盐生产。3细胞under High Glucose In Vitro Condition

确认是否参与miR-Let7A促炎细胞因子和免疫反应的调节弯曲。3细胞在高葡萄糖条件下,我们执行qPCR分析mRNA的表达TNF -α,进气阀打开,格里斯试剂测定亚硝酸盐生产(数字7 (b),7 (c),7 (d))。肿瘤坏死因子- mRNA水平α高葡萄糖条件下显著增加,但显著减毒miR-Let7A超表达(图7 (b))。伊诺的mRNA水平明显高葡萄糖条件下但显著增加,极大地减弱miR-Let7A超表达(图7 (c))。另一方面,高glucose-induced增加TNF -α和伊诺仍保留当miR-Let7A抑制剂处理(数据7 (b)和7 (c))。亚硝酸盐生产25毫米葡萄糖的细胞治疗是参与细胞的约2倍。另一方面,增加产量的亚硝酸盐glucose-treated弯曲。3cell was significantly reduced by miR-Let7A overexpression but markedly increased by the treatment of Let7A inhibitor (Figure7 (d))。

4所示。讨论

目前的研究表明,miR-Let7A显著预防细胞死亡和损失的紧密连接蛋白和减毒促炎反应的弯曲。在高葡萄糖体外条件下3细胞。这表明miR-Let7A操纵的可能是一个新颖的解决方案在控制BBB破坏导致中枢神经系统疾病。

大脑内皮细胞BBB的主要细胞成分,对于CNS体内平衡是必要的(27]。他们构成了多个网络的船舶运输营养物质和气体在整个大脑(28),形成代谢障碍(27,29日]。大脑内皮细胞通过复杂的互联横向等离子体膜之间的紧密连接(30.]。紧密连接的完整性报告负责大脑内皮通透性(31日];因此,紧密连接蛋白的损失可能会导致BBB破坏,导致各种中枢神经系统疾病(32- - - - - -34]。特别是,糖尿病正成为一个关键问题在BBB分解(35,36),这表明高葡萄糖会损害细胞和减弱紧密连接的完整性(37- - - - - -39]。在本研究中,我们证实了高葡萄糖激活mRNA的表达p-53和伯灵顿和蛋白质表达的裂解PARP表明激活细胞死亡信号(35,40,41]。我们还观察到mRNA的表达减少ZO-1 CLD5和蛋白表达的CLD5现在大脑内皮细胞紧密连接蛋白的损失(32,33,36,42]。

最近的研究表明,转录后的基因调控微核醣核酸在大脑内皮细胞可能通过减轻神经病理学的中枢神经系统疾病(43- - - - - -50]。据报道,这些microrna miR-Let7A明显下调促炎细胞因子在神经炎症条件下(50),而且支持大脑内皮屏障功能包括增加单核细胞粘附和迁移的50]。在目前的研究中,我们观察到miR-Let7A表达大脑内皮细胞高葡萄糖条件下表达下调,但miR-Let7A超表达显著减弱促炎细胞因子(即生产。肿瘤坏死因子-α)[23),抑制裂解PARP及其表达的增加易位到细胞核标明细胞死亡信号(51,恢复紧密连接蛋白的损失(即。在弯曲、CLD5和ZO-1)。3细胞(32,33,36,42在高葡萄糖条件下)。此外,我们发现亚硝酸盐生产和伊诺mRNA表达高葡萄糖条件下(52)被miR-Let7A显著抑制过度。从这些结果,我们假设miR-Let7A显著减毒BBB的中断和大脑内皮细胞的细胞死亡。这可能表明miR-Let7A起着有益的作用对紧密连接蛋白的损失,细胞死亡信号,大脑中促炎反应内皮细胞在高血糖状态。

这项研究有一定的局限性。(即动物研究。,knockout or knockin mouse model for miR-Let7A) together with in vitro experiment would be more supportive for the conclusion. Further study with animal model is needed to elucidate the role of miR-Let7A in brain endothelial system under hyperglycemic condition. Second, this study used nontreated cells and high glucose-treated cells as “control” based on the previous reports [16,21- - - - - -24),但使用控制模拟(例如,C。线虫miR-2或任何其他无关的米尔)在控制细胞将有意义的阐明唯一miR-Let7A对大脑内皮细胞的影响。

尽管这项研究的局限性,我们在这个研究强调三点。首先,高葡萄糖加剧紧密连接蛋白和细胞死亡的损失。第二,miR-Let7A有助于维护紧密连接完整性尽管高葡萄糖压力。最后,miR-Let7A减轻大脑内皮细胞的凋亡在高葡萄糖体外条件。因此,我们建议miR-Let7A的操纵将改善的BBB破坏保护大脑内皮细胞在高血糖状态。

5。结论

从这项研究中,我们建议miR-Let7A可以减弱大脑损伤的内皮细胞通过控制细胞死亡信号,紧密连接蛋白的损失,并针对高葡萄糖促炎反应压力。此外,操纵miR-Let7A可能是一个新颖的解决方案在控制BBB破坏导致中枢神经系统疾病。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Juhyun歌曲和杨•金哦设计实验和写的手稿。Juhyun歌曲进行了实验。Juhyun歌,所以Ra Yoon,哦,杨•金分析数据。哦,杨•金修订后的手稿和提供研究经费。所有作者审查和同意的最终版本的手稿。

确认

这项研究得到了韩国国家研究基金会资助由韩国政府(2016 r1a2b4013627)。