文摘

细胞内钙^{2 +}处理不当是一个潜在的机制在缺氧/复氧(H / R)受伤,导致线粒体功能障碍和心肌细胞死亡。这些事件是由线粒体Ca^{2 +}(米Ca^{2 +})线粒体钙超载所促进的uniporter(单片机)通道。沿着这条线,我们评估的影响siRNA-targeting单片机在心肌细胞H / R损伤。首先,心肌细胞治疗可以阻止了单片机的表达减少了67%,导致线粒体明显减少^{2 +}交通工具。核治疗心肌细胞显示线粒体渗透性降低孔隙和氧化应激引发的Ca^{2 +}过载。此外,H / R损伤后单片机沉默坏死和凋亡水平降低了30%和50%,分别还存在,并导致减少3/7,9日和8日活动。我们的发现与先前的结论是一致的,证明单片机活动部分原因引起的细胞损伤H / R和支持的概念,利用siRNA-targeting单片机作为一个潜在的治疗策略。

1。介绍

冠心病(CHD)是死亡的主要原因在工业化和第三世界国家1]。冠心病的影响与缺血再灌注的负面影响有关。缺血再灌注损伤通常发生在患者与急性st段抬高心肌梗死心肌再灌注及时有效的限制梗死大小和死亡。然而,一些事件出现在心肌再灌注可以进一步诱导细胞损伤的现象被称为再灌注损伤(2]。

众多实验研究已经确定了一些关键因素一致的行动来调解的不利影响再灌注损伤。首先,细胞内线粒体Ca^{2 +}(米Ca^{2 +}再灌注期间)过载会加剧由于氧化应激中断肌纤维膜和肌浆网的膜(3]。第二,线粒体reenergization期间再氧化允许驱动Ca的膜电位的恢复^{2 +}通过线粒体钙吸收到线粒体^{2 +}uniporter(单片机)通道,随后引发米Ca^{2 +}过载(4]。这些事件导致线粒体功能障碍,导致心肌细胞死亡的线粒体过渡孔()[5]。因此,针对氧化应激和/或调节的活动单片机通过选择性阻断剂如俄文_360年(6,7)或抑制开放的环孢霉素(CsA)提供具体的干预目标(8]。

单片机的监管的作用米Ca^{2 +}支持过载的观察,在心肌缺血再灌注模型,治疗与俄文_360年减少(Ca^{2 +}]_米和维护线粒体ATP合成(6]。俄文_360年治疗心脏再灌注体内后不容易接受线粒体通透性转换()和细胞凋亡9,10]。最近的描述分子的身份单片机通道(11,12)和几个单元,是至关重要的米Ca^{2 +}吸收允许成人heart-specific转基因模型的开发(13]。在这方面,有条件的心脏单片机^−−/老鼠接受再灌注导致显著减少米Ca^{2 +}过载,残疾的激活抑制心肌细胞凋亡和坏死(14,15]。这些数据提供了实验原理发展策略目标单片机活动和防止ischemic-reoxygenation损伤的目的。

另一方面,小干扰RNA (siRNA)为基础的治疗提供一种很有潜力的治疗策略块单片机的活动。感兴趣的,几个阶段I和II临床研究涉及肝炎患者、高胆固醇血症,黄斑变性,实体肿瘤已经完成(16),似乎在人类基因治疗的安全策略(17]。

因此,本研究的目的是探索siRNA-targeting MCU的潜在用途的体外模型缺氧/复氧(H / R)受伤。我们的结果证实了以前的观测,定义了单片机作为一个必不可少的调制器的再灌注损伤的不利影响,并提出单片机沉默使用核治疗可能被用作心血管的策略。

2。材料和方法

2.1。试剂

所有化学试剂、细胞培养基和补充剂,核,和荧光探针从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州,美国),除非另有说明。

2.2。小干扰rna序列单片机

小干扰rna序列沉默单片机,具体设计使用RNAi siDirect v2.0潜力预测脱靶,最低的100%同源性大鼠基因(NCBI的参考序列NM_001106398.1)。然后,我们使用siRNA-MCU Calcium1, nt 761 - 779相应的信使rna,有义链序列:5′-CGGCUUACCUGGUGGGAAU-3′。合成了核双Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。小干扰rna序列是不属预定目标的任务®siRNA普遍消极控制# 1 (SIC001)命名为siRNA-Neg。

2.3。细胞培养和核转染

大鼠心室心肌H9c2细胞系(crl - 1446™)获得写明ATCC®(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。细胞生长在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM) (D7777)和补充10%胎牛血清(的边后卫)表达载体(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)和1 x penicillin-streptomycin (P4333)湿润孵化器在37°C公司为5%₂和95%的空气。对于单片机沉默,H9c2细胞被播种在2.5×10⁴细胞每在12-well盘子和24 h后转染有18.8,112.5,225 nM siRNA-MCU设计或使用HiPerFect siRNA-Neg™转染试剂(试剂盒®,Venlo,荷兰),根据制造商的协议。

2.4。反转录RNA提取,通过定量PCR和基因表达分析

单片机沉默的基因表达分析,总RNA转染96 h后,从H9c2孤立的均质化细胞TriReagent™遵循制造商的指示。RNA纯度量化和评估与执行Take3™Micro-Volume板中使用的微型板块分光光度计协同™HT (BioTek®工具,Winooski, VT,美国)。从一个微克每个样本的总RNA,互补脱氧核糖核酸的合成ImProm-II™逆转录系统(Promega®,麦迪逊,WI,美国)和5分析了ng中存在SensiFast™SYBR®Lo-Rox工具包(Bioline®,伦敦,英国)。管家基因β肌动蛋白是用来规范所有数据。实时PCR引物序列扩增片段的158个基点的CCDC109A(单片机)基因如下:弗兰克-威廉姆斯,5′-CACACAGTTTGGCATTTTGG-3′,房车,5′-TGTCTCTGGCTTCAGGATAA-3′。引物序列扩增片段的110个基点β肌动蛋白是弗兰克-威廉姆斯,5′-GAAAAGATGACCCAGATCATG-3′,房车,5′-ATCACAATGCCAGTGGTAC-3′。比较表达分析siRNA-MCU细胞siRNA-Neg细胞进行使用方法。

2.5。免疫印迹分析

细胞蛋白提取H9c2转染96 h后,如前所述[18]。简单,清洗后用冷PBS,细胞培养被刮,收获,resuspended里帕缓冲区。样本涡和用轮10秒声波降解法/ 10秒休息和离心机在15000 g×10分钟。蛋白质的溶解产物的浓度是由洛瑞蛋白质分析。蛋白溶解产物(30μg / lane)解决在sds - page凝胶10%,转移到PVDF膜在150毫安,50分钟,和孵化anti-MCU抗体ab121499 (Abcam、剑桥、马、美国)1:500,洗了三次10分钟PBS-Tw 0.5%,随后探讨了二次抗体anti-rabbit免疫球蛋白与合共轭(美国Billerica的微孔,mA) 1: 5000 2小时在室温下(RT)。三次洗后10分钟,protein-antibody墨迹了与西方发射极耦合逻辑清晰™(Bio-Rad大力神,CA)和量化使用BioSpectrum 415图像采集系统(UVP®,高地,CA,美国)。反β肌动蛋白抗体(ab8229) 1: 500或anti-GAPDH抗体(ab9484) 1: 500(他们两人从Abcam,剑桥,妈,美国)被用作加载控制。单片机的水平表达的强度比MCU-signal /β肌动蛋白信号归一化与siRNA-Neg信号。

2.6。测量的线粒体Ca^{2 +}吸收

Cytosolic-free Ca^{2 +}监控在digitonin-permeabilized H9c2转染细胞。简单地说,5×10⁴细胞被洗了三次Tyrode解决方案(0.4 mM: 128氯化钠,不₂阿宝₄5.4,5葡萄糖,氯化钾,0.5 MgCl-6H₂啊,没有Ca和25个玫瑰,pH值7.4)^{2 +}和resuspended 50μL呼吸缓冲区包含在毫米以下:150蔗糖,KH 50氯化钾,2₂阿宝₄琥珀酸,20 Tris-HCl pH值7.3,5,2μ40 g / mL鱼藤酮,μ洋地黄皂苷,0.5μM thapsigargin (TG), 1μM CsA, 0.3μ米钙Green-5N (CG-5N)盐(热费希尔科学、沃尔瑟姆,妈,美国)。CG-5N荧光(485海里/528海里)监测在基底25°C条件和15μM Ca^{2 +}除了不断搅拌使用微型板块荧光分光光度计协同HT(美国BioTek乐器,Winooski VT)。

2.7。线粒体膜电位(),测量

番红精是用来评估在digitonin-permeabilized心肌细胞转染如前所述奥利维拉et al。(19),做了一些调整。简单地说,5×10⁴H9c2转染细胞被洗和resuspended已经50所μ与2 L呼吸媒体μ红色染料。红色染料荧光被记录485海里,使用微型板块荧光读者590海里。5分钟后,琥珀酸10毫米被添加为衬底,直到在达到稳定状态。Ca^{2 +}脉冲7.5或15μM添加诱导渗透过渡,1μ环孢菌素(CsA)或0.5μM俄文_360年被用来作为药理抑制剂的分别打开和单片机。氰化物米-chlorophenyl腙(CCCP 20μ米)表示消散时添加。13分钟后去极化测量的Ca^{2 +}加法。实验数据归一化到最大的红色染料荧光(100%),计算稳态荧光之间的差异和之后挺。

该Ca来支持^{2 +}诱发开,5×10⁴H9c2 permeabilized转染心肌细胞呼吸作用的媒体,我们进行了Ca^{2 +}保留实验用一个50μM Ca^{2 +}丸使用CG-5N Ca^{2 +}指标。实验被执行(1μ米)或没有CsA。

2.8。流式细胞仪测量

转染心肌细胞被染色和分析FACSCanto II™流式细胞分析仪(BD生物科学,圣何塞,CA),和每个时间点分析包括5000年记录的事件。细胞形态学评估通过分析了散射(FSC)和侧散射(SSC)的参数和我们排除了紧身衣FSC-A / FSC-W浇注。残骸丢弃了其独特的低和侧散射。样本运行无报酬的和FMI分析使用FlowJo™vX。07(树明星,亚什兰,美国)。

2.8.1发布。测量活性氧的生产

评估线粒体ROS(过氧化物)生产、转染心肌细胞都沾染了MitoSOX红色(热费希尔科学),之前报道的Mukhopadhyay et al。20.]。短暂,细胞被允许负载MitoSOX为30分钟37°C。染色后,细胞与Tyrode清洗解决方案。最后,每个样本刺激与TG浓度的5μm之前,TG, siRNA-Neg心肌细胞是有或没有孵化5μM俄文_360年30分钟或1μM CsA在10分钟的药理抑制剂超氧化物生产。连续的样本在不同时间点进行分析(0.5,15、30、60和120分钟)。MitoSOX的数据给出的平均荧光强度成倍增加对siRNA-Neg控制。

2.8.2。细胞毒性试验

细胞生存和凋亡和坏死细胞死亡是衡量膜联蛋白V / PI染色流式细胞术分析紧随其后。后,短暂normoxy (Nxy)、缺氧和1.5和3 h再氧化条件下,H9c2转染细胞被洗,resuspended在195年μL Tyrode CaCl + 2.5毫米₂解,沾染了5μL膜联蛋白V组细胞凋亡检测PE-Cy7 88 - 8103(美国eBioscience,圣地亚哥,CA) 10分钟。195年后,细胞被洗,resuspendedμL Tyrode CaCl + 2.5毫米₂解决方案和孵化100 ngπ(P4170)抛弃坏死细胞。染色细胞立即通过流式细胞术分析。分析被执行的two-color-analysis PE-Cy7-labeled膜联蛋白V绑定和π与波长488纳米的激光染料兴奋。评估可行的比例、凋亡和坏死细胞,我们进行了荧光补偿。丢弃对比后,活细胞(膜联蛋白V⁻/π⁻第四季度),早期凋亡细胞(膜联蛋白V⁺/π⁻第三季),晚期凋亡细胞(膜联蛋白V⁺/π⁺、Q2)和坏死细胞(膜联蛋白V⁻/π⁺Q1)是杰出的。

2.9。ATP含量测量

在96 h转染细胞内ATP含量测定心肌细胞,使用CellTiter-Glo®发光测定(美国麦迪逊Promega),根据制造商的协议。ATP的内容表示为发光相对单位(LRU)。

2.10。体外缺氧/复氧模型

缺氧的挑战,H9c2转染细胞使胰蛋白酶化,用Tyrode没有葡萄糖,和孵化修改Tyrode溶液模拟缺血条件(IT) (8 mM: 135氯化钠,氯化钾,0.5 MgCl₂0.33不₂阿宝₄,5个消息灵通的,1.8 CaCl₂,20 Na⁺乳酸,pH值6.8)(21]和转入厌氧室的氧气水平< 1%,37°C。3 h后缺氧,细胞被洗和孵化Tyrode (CaCl葡萄糖+ 5毫米,1.8毫米₂)和转移到孵化器在常氧条件下(37°C公司为5%₂和95%的空气)为1.5和3 h再氧化和分析细胞凋亡和坏死。在缺氧,实验组在常氧条件下保持。缺氧/复氧模型的示意图表示如图1。

2.11。半胱天冬酶活性的测量

半胱天冬酶活动的测量,H9c2被播种在1.5×10³细胞每口井96 -孔板和24 h后被转染如前所述。转染96 h后,这些细胞被洗Tyrode,与IT解决方案孵化,转入厌氧室的氧气水平< 1%,37°C。3 h缺氧后,它的解决方案是,细胞在DMEM孵化常氧条件(37°C公司为5%₂和95%的空气)为0、1.5和3 h再氧化和分析还存在还存在3和7和8和9每次活动。在缺氧,实验组在常氧条件下保持。的活动还存在3和7和9半胱天冬酶和半胱天冬酶8测量使用Caspase-Glo 3/7, 9日和8个试验(WI Promega,麦迪逊,美国),分别根据制造商的协议。

2.12。统计分析

统计数据提出了均值±SEM。对比是由未配对学生的手段以及或单向方差分析Dunnett紧随其后,图基,或Bonferroni事后测试在适当的时候比较实验。差异被认为是重要的时候。进行了数据处理、图形和统计分析与GraphPad棱镜(美国V.5.01拉霍亚,CA)和OriginPro 8.1 SR3 v8.1 (OriginLab公司,北安普顿,妈,美国)。

3所示。结果

3.1。siRNA-Targeting单片机有效降低线粒体Ca^{2 +}运输在心肌细胞

大鼠心肌细胞转染了小干扰rna (siRNA-MCU)或特定MCU-targeted nonsilencing核(siRNA-Neg)研究单片机在细胞死亡的作用。使用qPCR化验,我们认为有一个()减少单片机mRNA表达水平96 h转染后(图2(一个))。接下来,我们用免疫印迹检测消声效果验证。在心肌细胞转染siRNA-MCU,单片机表达低于那些与siRNA-Neg细胞转染。这种效应显示响应时间在48和72 ~ 50%沉默h(图2 (b))。此外,在转染96 h,我们发现单片机蛋白水平明显降低()。此外,在这种条件下使用单片机siRNAs(225海里)的浓度没有影响可行的细胞的数量或心肌细胞形态和ATP生产(增刊。图1 a e,网上补充材料https://doi.org/10.1155/2017/5750897)。基于这些结果,我们使用siRNAs在余下的225 nM 96小时我们的实验中,我们得到了最大的沉默单片机mRNA和蛋白表达(数字3(一个)和3 (b))。此外,siRNA-MCU没有修改其他uniplex组件的相对表达,如MICU1 MICU2,埃姆雷,MCUR1(图2 (c))。

图3 (c)显示代表米Ca^{2 +}控制和MCU-silenced心肌细胞吸收的痕迹。Permeabilized心肌细胞转染和15的挑战μM Ca^{2 +}除了在1μM CsA确定最大单片机活动(9]。控制细胞,快速米Ca^{2 +}条目被俄罗斯观察(完全废除_360年,数据未显示);然而,在siRNA-MCU治疗细胞,Ca^{2 +}运输是大幅减少。线粒体钙^{2 +}吸收时间的50% (T_50%)提供了一种单片机活动的数量指标。为控制心肌细胞,T_50%是分钟,而在MCU-silenced细胞,分钟()(图3 (d))。这些结果表明显著减少的速度在我们MCU-silenced心肌细胞线粒体运输。

3.2。单片机沉默降低线粒体Ca^{2 +}过载、渗透过渡孔和心肌细胞氧化应激

因为过度的Ca^{2 +}线粒体基质中积累导致线粒体的崩溃的潜力,心肌细胞转染和Ca的挑战^{2 +}过载后对膜电位的影响。在稳定状态下,膜电位并未显示差异之间的控制和MCU-silenced心肌细胞(增刊。图1 c - d)。然而,在Ca^{2 +}脉冲,控制心肌细胞表现出明显的Ca^{2 +}端依赖去极化而MCU-silenced心肌细胞(图4(一))。与此同时,MCU-silenced细胞得以维护在~ 75% ()(图4 (b))。俄文_360年和CsA治疗防止Ca^{2 +}全身的膜去极化~ 95%(数据4 (c)和4 (d)和5。图2 a)。

此外,在Ca^{2 +}用50保留实验μM Ca^{2 +}丸,我们观察到一个Ca的早期和戏剧性的释放^{2 +}从控制心肌细胞而MCU-silenced细胞(增刊。图2 b)。Ca^{2 +}释放被CsA抑制,表明的参与膜电位触发的崩溃。

氧化应激和Ca^{2 +}过载是已知的不利影响在线粒体膜的完整性,因为两者都是诱发的打开(22]。图5(一个)显示的时间进程分析过氧化物生产应对TG-induced Ca^{2 +}过载。在基础条件,控制和MCU-silenced MitoSOX心肌细胞表现出相似的荧光强度。60 - 120分钟后TG治疗,MitoSOX强度明显高于siRNA-Neg转染细胞比MCU-deficient心肌细胞(图5(一个))。因此,MCU-deficient心肌细胞(51%Ca)减少^{2 +}overload-induced过氧化物生产(图5 (b))。在这种情况下,俄罗斯_360年也能减少ROS和CsA治疗生产22% (ns)和49% (),分别(图5 (c))。依照这些发现,单片机沉默可能发挥保护作用,减少氧化应激引起的Ca^{2 +}过载。

3.3。单片机沉默减少心肌细胞缺氧/复氧损伤的细胞死亡

转染心肌细胞在缺氧3 h孵化室为O₂在结合glucose-deprivation(1%),无血清,酸中毒诱导缺氧(pH值6.8)条件。缺氧/复氧的原理模型如图1。细胞生存能力和细胞凋亡测定膜联蛋白V / PI染色和流式细胞仪分析了在特定时间点在Nxy和再氧化:开始时(0 h), 1.5小时后,经过3 h。代表流式细胞术点阴谋显示可行的人口(膜联蛋白V⁻、IP⁻(膜联蛋白V)和凋亡细胞⁺/ IP⁻和膜联蛋白V⁺/ IP⁺)所示的数据6(一)和6 (b)在Nxy和1.5 h的再氧化。细胞生存能力(5 ~ 90%。图1 a)和细胞凋亡心肌细胞转染~ 3 - 5%在常氧条件。在再氧化的发生,我们没有发现任何变化在细胞死亡之间的控制(12.6%)和MCU-silenced心肌细胞(8.2%),如图6 (c)。然而,在1.5 h的再氧化,在控制心肌细胞坏死增加了46%相比MCU-silenced心肌细胞(16.7%,)。3 h的复氧后,可行的细胞被保存在MCU-silenced心肌细胞%,然后下降% ()控制心肌细胞。凋亡细胞死亡测量显示出类似的结果;没有观察到细胞凋亡水平显著变化在Nxy或实验团体之间的再氧化的开始。然而,我们发现了一个双重的减少MCU-deficient ()与siRNA-Neg心肌细胞(1.5 h(复氧(后))。同样,3 h的复氧后,siRNA-Neg心肌细胞的凋亡水平增加了1.5倍(与,)。因此,还存在3和7活动增加了2倍的再氧化的控制心肌细胞()相比,MCU-deficient心肌细胞(,)。与此同时,半胱天冬酶9活动显著增加()在两个实验组,每组,但1.5 h的复氧后,半胱天冬酶的激活水平9下降1.5倍MCU-deficient心肌细胞()。事实上,半胱天冬酶的激活还存在9和复氧后3和7一直持续到3 h siRNA-Neg细胞相比MCU-silenced心肌细胞。另外,我们观察到激活的18倍半胱天冬酶8在控制细胞再氧化的发生。然而,我们观察到减少40%半胱天冬酶8 MCU-silenced细胞相比,控制细胞的活动(与RLU·毫克⁻¹)。总的来说,这些结果说明单片机沉默在心肌细胞缺氧/复氧损伤的减少坏死和凋亡。

4所示。讨论

在心脏,米Ca^{2 +}吸收可以塑造胞质钙信号调节某些生理过程,主要是匹配工作负载和能源生产(23]。然而,过度的Ca^{2 +}触发线粒体功能障碍通过开放,导致细胞损伤,细胞凋亡和坏死5]。在这方面,一些研究已经表明,胞质Ca的失调^{2 +}导致米Ca^{2 +}过载存在生理病理学的缺血/再灌注(I / R)损伤和心力衰竭(HF) [24]。单片机通道,校长米Ca^{2 +}交通系统,进行这种机制。然而,精确的作用,Ca的规定^{2 +}处理和其后果在心脏疾病仍有争议25]。直到最近的分子表征单片机成为可能(11,12研究),允许其在心肌疾病的生理病理学意义明确的作用。这一发现让我们探索的可能性调制单片机小干扰rna技术在基因敲除小鼠或使用一个表达式。在这方面,我们测试了一个特定的核设计击倒单片机表达在体外单片机的心肌细胞线目标验证。后一个挑战米Ca^{2 +}过载,MCU-deficient细胞能够很大程度上维持Ca和保留^{2 +}类似于这些药物治疗CsA,如预期。总之,这些研究结果表明,单片机沉默抵抗打开(6,14]。此外,MCU-silenced心肌细胞治疗TG (SR-Ca^{2 +}/ atp酶(SERCA)抑制剂),促进胞质Ca^{2 +}后来ROS,未能提高超氧化物自由基产量。同时,H / R协议后,siRNA-MCU-silenced心肌细胞减少还存在8和9的开幕和激活。依照我们的结果,半胱天冬酶8可能启动细胞凋亡的执行阶段,之后,线粒体功能障碍引起的激活半胱天冬酶9。对于这个发现的一种可能的解释是,激活半胱天冬酶8劈开的报价(26),然后裂解投标激活线粒体伯灵顿/贝克和导致多个线粒体功能障碍,包括释放intramembrane空间蛋白质,apaf-1和激活,进而劈开半胱天冬酶的酶原9活性形式。当俄罗斯这些观察类似报道_360年单片机被抑制在体内和体外模型I / R (9,10),确认部分或急性单片机抑制可能是一个治疗策略以减少细胞死亡(27]。此外,这种保护作用与单片机作为缺血预处理(IPC)中介(6,28]。与IPC机制并不完全理解;然而,低水平的米Ca^{2 +}涉及生成活性氧激活触发器的IPC的生存激酶(29日]。由于大量生产活性氧在再灌注期间重要的是有助于诱导心肌细胞死亡,由单片机控制活性氧的生产沉默模仿IPC心血管效应。因此,我们的研究结果是根据观察到的保护条件心脏单片机^−−/老鼠(14,15]。在这种转基因模型,删除单片机在成人心肌细胞从细胞死亡导致保护缺血再灌注损伤等引起的急性损伤。然而,结果在MCU-knockout本构动物仍有争议。例如,在再灌注损伤,MCU-knockout心是类似于控制的心,CsA没有产生一种保护作用。这表明,Ca^{2 +}独立的死亡通路发生在缺乏单片机和替代机制存在的Ca^{2 +}条目(30.]。值得注意的是,近亲繁殖MCU-knockout老鼠并不可行,因为他们是embryonically致命;只有mixed-strain MCU-knockout老鼠是可行的(31日]。除了这个争议,最近导致单片机overexpressing小鼠抗再灌注损伤是由于一个增强的生存活动激酶(32]。

除了定义单片机的贡献在病理活动,发现治疗策略调节单片机活动将成为未来发展的极其重要的假定的MCU-targeting疗法。这里,使用核或几个药理战略(如俄文_360年或CsA),我们试图减少打开或减少米Ca^{2 +}过载为了减少心律失常的可能性和postmyocardial梗死心脏功能障碍(2]。在这方面,在体外和胞质Ca的体外研究^{2 +}过载和红外损伤表明,CsA的有效抑制剂,防止再灌注心肌细胞死亡(8,33]。事实上,CsA应用在小动物模型出现再灌注了减少心肌梗死面积的~ 45% (34)通过抑制损失,NADH氧化、Ca^{2 +}释放,线粒体肿胀35]。因此,一些临床试验确定其心肌梗死患者再灌注损伤的保护作用[36]。然而,最近的一项荟萃分析的随机对照试验表明,CsA不能对临床患者再灌注损伤保护作用[37]。这些影响的原因尚不清楚,但这可能是因为CsA,有多个目标的免疫抑制剂如还有和钙调磷酸酶(38]。此外,CsA的阈值只会增加诱导物,所以它是理想的探索另一个策略来防止的形成和再灌注损伤。另一方面,俄罗斯的使用_360年作为单片机的一个特定抑制剂用于完整的心肌细胞(7),孤立的心6,10)和小鼠模型(9)提供保护再灌注损伤,改善力学参数,减少梗塞大小和细胞内酶释放(9,39]。然而,他们的药代动力学参数、生物利用度和副作用尚未完全描述。

此外,这些治疗策略,减少缺血性损伤可能有利于降低心衰的进展。在这方面,曾经当过et al。40)最近表明,细胞内Ca^{2 +}泄漏可能导致线粒体Ca^{2 +}高频的过载和障碍小鼠模型。特别是,肌浆网钙^{2 +}泄漏可以建立一个病态的反馈与线粒体,线粒体功能障碍增加活性氧的生产,因此导致氧化/亚硝基化RyR2等一些重要的肌浆网的渠道,提高舒张Ca^{2 +}泄漏,影响细胞的收缩性。此外,我们发现选择性单片机治疗抑制有可能防止catecholamine-induced毒性观察高频(41]。在这方面,安德森的小组使用单片机显性负转基因老鼠证实我们的发现单片机的作用对儿茶酚胺的反应,因为他们的老鼠无法达到儿茶酚胺反应(14,27]。这些新颖的数据提供了实验原理探索单片机在高频发展中的作用。

目前,可拆卸的核基因表达的技术提供了一种有效的治疗方法的具体调制基因打靶(42]。核疗法适用于药物使用,因为它不需要基因组集成,可以便宜和容易合成。自从小干扰rna能具体地设计合理的抑制内源性基因表达,它可以调节任何疾病相关基因表达(43]。因为他们的伟大的治疗潜力,至少20 siRNA-based药物已经进入人类临床试验(43]。然而,核分子不稳定在血清和显示细胞吸收不良和免疫原性44]。在这方面,siRNA治疗的成功应用需要有效的药物输送系统的发展,特别是nanovectors [45]。最近,内皮功能障碍出现在高频一直探索小说大道nanovectors的交付,以及由此产生的内皮渗透性打开场纳米疗法可以通过功能失调的渗透达到心肌内皮(46]。在高频的小鼠模型,一个被动的心脏内的高浓度的人们积累发生在单个应用程序。正常心脏组织相比,积累nanovectors高出12倍在高频的动物47]。这种方法应该使用作为一个潜在的大道siRNA-MCU治疗在再灌注损伤或心力衰竭,可能对小说翻译疗法可以改善病人的结果。

5。结论

总之,作为第一个概念证明,我们已经表明,单片机沉默由特定核降低体外H / R损伤减轻心肌细胞死亡。因此,这些知识将允许合适的交付系统的开发测试的治疗潜力siRNA线粒体钙超载的体内模型和功能障碍出现在高频。在这种背景下,这部小说单片机druggability应该是一个肥沃的未来的研究领域。

缩写

AFU:	任意荧光单位
CG-5N:	钙Green-5N
挺:	氰化物米-chlorophenyl腙
客服人员:	环孢菌素一个
等:	电子传递链
人力资源:	缺氧/复氧
小额信贷机构:	平均荧光强度
米Ca2 +:	线粒体钙
单片机:	线粒体钙uniporter
:	线粒体通透性转换孔
:	线粒体膜电位
微血管的2:	心肌耗氧量
Nxy:	Normoxy
PI:	Propidium碘化
RLU:	相对发光单元
ROS:	活性氧
SERCA的:	石棺/内质网calcium-ATPase
TG:	Thapsigargin
TI:	Tyrode缺血性的解决方案
Uniplex:	线粒体钙uniporter holocomplex。

信息披露

这项工作在部分实现的要求提交的博士学位Yuriana Oropeza-Almazan著名生物技术博士学位的蒙特雷。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

概念和设计的研究是由Gerardo Garcia-Rivas和Yuriana Oropeza-Almazan。爱德华多Vazquez-Garza Yuriana Oropeza-Almazan,赫克托耳Chapoy-Villanueva进行实验;爱德华多Vazquez-Garza Yuriana Oropeza-Almazan,赫克托耳Chapoy-Villanueva分析数据;Yuriana Oropeza-Almazan Gerardo Garcia-Rivas起草的手稿;爱德华多Vazquez-Garza Yuriana Oropeza-Almazan,赫克托耳Chapoy-Villanueva, Guillermo Torre-Amione, Gerardo Garcia-Rivas解释实验结果;Yuriana Oropeza-Almazan准备数据;Gerardo Garcia-Rivas Guillermo Torre-Amione编辑和修改手稿。爱德华多Vazquez-Garza和赫克托耳Chapoy-Villanueva同样的贡献。

确认

作者感谢Arturo Chavez-Reyes博士的支持与核设计和实验结果的评论,西尔维亚Cardenas罗德里格斯,医学博士米格尔·a·弗洛雷斯,狗屁,for exceptional technical assistance. They also thank Valeria Oropeza for editing the figures. This work was partially supported by Endowed Chair in Cardiology (Tecnológico de Monterrey, 0020CAT131) as well as CONACYT Grants 151136, 133591, and 269399 and Fronteras de la Ciencia grant (0682) and Xignus Research Fund. Postdoctoral fellowship (CONACYT to Eduardo Vázquez-Garza and Héctor Chapoy-Villanueva) is also acknowledged.

补充材料