香豆素衍生物对人白血病细胞多药耐药基因表达的调控

摘要

肿瘤细胞中多药耐药(MDR)的存在被认为是癌症化疗失败的主要原因。解释了多药耐药现象的机制，其中包括主要来自ABC家族的膜转运蛋白的过度表达，这些膜转运蛋白积极地清除肿瘤细胞中的细胞抑制剂。20种香豆素衍生物对细胞毒性和表达的影响凋亡,MRP1,BCRP,含碘该研究分析了癌细胞中负责多药耐药的基因(编码蛋白)。本研究的目的包括测定白血病细胞中米托蒽醌存在和不存在时选定香豆素衍生物的IC10和IC50值，并分析多药耐药相关基因表达的变化:凋亡,MRP.,含碘,BCRP在IC10和IC50浓度的米托蒽醌存在和不存在的情况下，将研究的细胞系暴露于选定的香豆素24小时后。本设计研究以人造血系统衍生的5种细胞系为研究对象:CCRF/CEM、CEM/C1、HL-60、HL-60/MX1、HL-60/MX2。细胞系CEM/C1、HL-60/MX1和HL-60/MX2表现出多药耐药表型。

1.介绍

天然来源的化合物及其衍生物在医学和药理学中发挥着越来越重要的作用。大约60%用于治疗癌症的治疗药物是由天然化合物和/或它们的衍生物组成的[1］．癌症化疗的主要问题是对正常快速增殖的细胞，特别是骨髓和胃肠道的高细胞毒性的不良反应。为了减轻副作用，改良的治疗方案，如联合治疗已被引入[2- - - - - -4］．在人类中可以发现两大主要的蛋白超家族atp结合盒(ABC)和溶质载体(SLC)中的数百个膜转运体。转运体可能代表药代动力学和药物-药物相互作用中决定速率的步骤[5,6］．ABC转运体，在其他功能中，利用ATP结合和水解的能量，积极地通过细胞膜外和细胞膜内运输化学物质。

多药耐药蛋白亚家族(MDRs和ABCB)、多药耐药相关蛋白(MRPs和ABCC)、乳腺癌耐药蛋白(BCRP和ABCG2)也属于人类ABC转运蛋白家族[5］．

这些ABC药物转运体在癌细胞中过表达所引起的多药耐药现象，使癌细胞对多种药物产生交叉耐药，成为限制肿瘤化疗疗效的重要障碍。近年来，许多天然植物源化合物已被发现具有抑制增殖、诱导凋亡、抑制血管生成、延缓转移和增强化疗的作用，在体外和体内均显示出抗癌潜力。许多研究人员指出，使用天然产品作为多药耐药性的抑制剂，并经常称它们为“第四代调节剂”[7,8］．

多药耐药的发生是由Biedler和Riehm于1970年在白血病细胞的孵育过程中首次描述的叙利亚仓鼠和放线菌素d浓度越来越高的小鼠，它们不仅遇到了这种特殊药物的耐药性，而且还遇到了许多其他药物的耐药性，包括柔红霉素和长春碱[9］．然而，真正的突破发生在1976年，当时Juliano和Ling首次描述了现在经典的p -糖蛋白(ABCB;P-gp)，这是已知的第一个导致多药耐药发生的人类蛋白[10］．大量研究表明，P-gp过表达与较低的癌症缓解率和较高的治疗耐药发生率之间存在密切关系。这一观察结果强调了多药耐药相关P-gp在肿瘤中的作用机制的重要性。此外，一些研究提供了证据，P-gp的表达可能是某些肿瘤(如乳腺癌和儿童神经母细胞瘤或肉瘤)治疗的临床结果的一个因素[11,12］．基于这些观察和调查结果，我们可以说，抗癌治疗的未来成功是不显着的程度，依赖于克服多药抗性的研究结果[13- - - - - -15］．Mitoxantrone是一种合成的炭疽丁基，已用于各种癌症的临床治疗。据信抗癌机制被认为与其结合DNA的能力和抑制细胞核隔室中的DNA拓扑异构酶II的能力有关。此外，其代谢物在细胞内细胞溶质隔室中的作用也可能有助于含有米萨洛酮的抗肿瘤活性[16,17］．

据报道，植物源多酚类化合物，主要是黄酮类化合物和二苯乙烯或其合成衍生物，可以调节与癌症耐药有关的主要ABC转运体，包括P-gp、多药耐药相关蛋白1 (multidrug resistance associated protein 1, MRP1)和乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein, BCRP) [18］．香豆素是植物次生代谢产物，具有巨大的结构多样性。它们有非常不同的作用机制。它们的生物活性由其内酯结构决定，而药理性质则由化合物的结构决定[19］．

一些香豆素，如七叶甲素、七叶甲素和弗拉欣，也具有抗氧化活性。急性淋巴细胞性白血病(ALL)和急性非淋巴细胞性白血病(ANLL)患者体内各种活性氧(ROS)水平升高，如超氧自由基、H₂O₂，以及与健康个体相比，酶(SOD和CAT)和非酶抗氧化剂水平下降[20.- - - - - -22］．

有许多关于调节多药耐药的关系的出版物，这些关系由于作用弱或副作用而没有在临床中使用。还需要寻找能够克服肿瘤细胞耐药性现象的物质。因此，有必要测试香豆素等能够逆转耐药性的有效化合物[23］．

在我们之前的论文中，我们筛选了香豆素衍生物对人类肿瘤细胞的细胞毒活性，发现一些香豆素衍生物表现出强大的细胞毒活性[24- - - - - -31.］．这些研究导致了对香豆素衍生物通过多药耐药基因表达逆转五种人白血病细胞系耐药影响的分析。在持续寻找有效和选择性的细胞毒香豆素衍生物作为抗肿瘤药物的研究中，我们分析了20种香豆素衍生物，并评估了它们对人类白血病细胞的细胞毒作用和影响凋亡,MRP1,BCRP,含碘基因的表达。

2.材料和方法

2.1。细胞系和细胞培养

使用人急性高幼粒细胞白血病细胞系HL60，HL60 / MX1和HL60 / MX2和急性淋巴细胞白血病细胞系CEM / C1和CCRF / CEM。来自美国型文化收集（ATCC）10801，大学大学大道Manassas，VA 20110，美国型文化收集（ATCC）。HL-60（CCL 240）是由柯林斯（1987）衍生的幼胞菌细胞系。外周血白细胞由一名36岁的白种人女性的白血病获得，其中急性早幼粒细胞白血病。HL-60 / MX1（CRL-2258），HL-60细胞系的耐氧化酮耐药衍生物，由来自患者的白核病获得的外周血白细胞从患有急性暴露细胞白血病的患者获得的外周血白细胞获得。HL-60 / MX2（CRL-2257）也是HL-60细胞系的耐氧化酮耐药衍生物。HL-60 / MX2细胞随着P-GP过表达的不存在和改变Topoisomerase II催化活性和降低水平的TopoisomeraseIIα和β蛋白水平而显示出非典型多药电阻（MDR）。CCRF / CEM（CCL-119）衍生自来自急性白血病儿童的外周血的人淋巴细胞。CEM / C1是人T细胞白血病细胞系CCRF / CEM的喜树碱 - （CPT-）耐药衍生物。细胞系被选择并在1991年亚克隆，​​以抵抗CPT（http://www.lgcstandarts-atcc.org/)。细胞保存在RPMI 1640培养基(PAA实验室，Linz，奥地利)，补充10%胎牛血清(FBS) (PAA实验室)用于HL60/MX1, HL60/MX2, CEM/C1，和CCRF/CEM细胞株，20%胎牛血清用于HL60细胞，青霉素链霉素(100 U/mL PAA实验室)，和两性霉素(PAA实验室)在37°C, 5% CO的湿化气氛₂。

２.２.细胞活力分析

细胞播种在12孔板上(Sarstedt, Wiener。在初始密度为1 × 10时⁶细胞/毫升。24小时后，用浓度为10μ.M - 1000μ.M. 24小时后，取细胞悬液1 mL, 1000 rpm离心5分钟，弃上清。细胞在50分钟重悬μ.微升PBS。从每个管中，10 μ.取L细胞悬液与10μ.L kypan蓝色试剂（Bio-rad，赫拉克勒斯，加州，美国）。将样品孵育5分钟。通过TC20自动细胞计数器（Bio-rad）测量细胞活力。每个实验重复三次。

２.３.标准和试剂

异opimpinellin (ISO)， bergapten (BER)， XOL (XOL)， xanththotoxin (XIN)， byakangelicin (BIN)， byakangelicol (BOL)， heraclenin (HEC)， phellopterin (FEL)， herniarine (HER)，七叶皂苷(AET)，二氢香豆素(DHD)，香豆素(COU)，七叶皂苷(AEL)， UMB)， 4-甲基-7-甲氧基香豆素(4,7m)， 4-甲基-7-乙氧基香豆素(4,7e)，7-甲基香豆素(7ME)、6-甲基香豆素(6ME)、0,0-二甲基fraxetin (OOD)和scoparone (SCO)购自ChromaDex®(ChromaDex, Irvine, CA, USA)。

2.4。基因表达的测定

相对基因表达凋亡,MRP1,BCRP,含碘采用实时荧光定量PCR和2^−ΔΔC_T方法。定量评估研究组每个样本的基因，参照对照组相应样本的基因表达量1:1。

2.4.1。细胞准备

细胞播种在12孔板上(Sarstedt, Wiener。在初始密度为1 × 10时⁶细胞/毫升。24小时后，将细胞悬浮液与IC10和IC50浓度分别香豆素衍生物刺激。细胞的另一组刺激的香豆素衍生物以0.02的浓度IC10坐着和IC 50浓度与米托蒽醌（+ M） μ.M.我们使用两种对照细胞培养物，没有刺激物和细胞培养物，浓度为0.02 μ.M. 24小时后，细胞悬液(每孔)800 rpm离心5分钟，弃上清。

2.4.2。分离总细胞RNA

为了分离细胞总RNA，我们采用Kocki等人的方法，使用tri试剂溶液(Ambion, USA)进行修饰[32.］．在此过程中，细胞样本与250μ.l三试剂缓冲液(Ambion，美国)获得均匀的悬浮液。然后样品在室温下孵育5分钟，直到完全分离。下一阶段是50μ.将L氯仿（Sigma-Aldrich，USA）加入到样品中并摇动15秒。接下来，将样品放置15分钟以在室温下孵育，然后在5415R Eppendorf离心机中在4℃下以14,000rpm离心15分钟。将水相置于新管和250 μ.l -丙醇(Sigma-Aldrich，美国)加入。样品充分混合，室温孵育20 min。然后，在5415R Eppendorf离心机中，在4°C, 14000 rpm下离心20分钟。从上述沉淀物中去除水相。RNA沉淀在80%的乙醇中洗涤，获得的RNA样品在−80°C的80%乙醇中存储以供进一步分析。

2.4.3。RNA的定量和定性分析

用NanoDrop2000 (Thermo Scientific, USA)分光光度法测定RNA浓度和纯度。在−20°C提取80%乙醇中的RNA沉淀，然后在5415R Eppendorf离心机中，在4°C, 14000 rpm下离心15分钟。将液体部分取出，RNA颗粒在室温下晾干。随后，沉淀物在4℃下溶解在DNase-， RNase-和无蛋白酶水(Sigma-Aldrich，美国)中，体积取决于RNA浓度。

2.4.4。互补脱氧核糖核酸的合成

根据厂家说明书，使用高容量cDNA逆转录试剂盒合成cDNA [33.］．每组反应混合物含有以下试剂：1×RT缓冲液，20u rNase抑制剂，50u逆转录酶（多股反转转录酶），1×Rt随机引物，和每种脱氧核苷酸的4mm：DATP，DGTP，DTTP，和DCTP Plus检查1 μ.克RNA在DNA酶，无RNA酶，和无蛋白酶的水（Sigma-Aldrich公司，美国）以完成反应所需的体积。反应混合物的最终体积为20 μ.l.然后将反应组分充分混合，离心使其充分融合。cDNA在Veriti Dx (Applied Biosystems, USA)上合成，条件如下:第一阶段，25°C (10 min);阶段II, 37°C(120分钟);III阶段，85°C(5分钟);第四阶段，4°C。

2.4.5。QPCR协议

通过反转录(RT)获得cDNA，在7900HT real-time Fast System上进行实时基因表达分析(qPCR)扩增[33.]，使用制造商的SDS软件。每个样品进行3次重复的qPCR反应。为了排除外源DNA对试剂的污染，盲法试验通常不采用DNA靶点。反应组分为11.25μ.cDNA探针和1.25的升混合物 μ.L基因特异性寡核苷酸启动子12.5μ.l buffer TaqMan通用PCR Master Mix。反应在光学反应板上进行，所需反应体积为25μ.l，使用探针组的TaqMan基因表达测定[33.利用FAM-NFQ标记物和人类基因的寡核苷酸启动器凋亡,MRP1,BCRP,含碘和家务基因GAPDH作为内控基因。扩增方案包括以下周期:初始变性:95°C, 10分钟;和40个周期，每个周期由两个温度组成:95°C, 15 s和60°C, 1 min。在7900HT实时快速系统上监测和计算DNA分子的拷贝数[33.在每个放大周期中。计算反应开始时混合物中存在的检测DNA分子的数量，以及荧光水平超过阈值周期(CT) RQ研究软件后的PCR循环的数量[33.使用了。内源性对照基因的每个样品的CT值（GAPDH）用于标准化的有趣的基因表达的水平。基因表达的相对水平的计算根据[34.］．

RQ参照对照细胞样本校正器(无刺激)中的基因表达，定义受刺激细胞样本中检测基因的表达。最后，将RQ的对数转换为RQ的对数(loggrq)进行分析[33.］．因此，所得到的结果更清晰。LogRQ取值大于，等于或小于零。LogRQ = O means that gene expression in the calibrated sample and the stimulated one are the same. LogRQ < 0 points to decreased gene expression in the stimulated cell sample, whereas LogRQ > 0 points to signal increased gene expression in the stimulated cell sample compared to the calibrated one.

2.4.6。统计分析

干细胞的结果由STATISTICA软件通过非参数Mann-Whitney进行统计分析U试验，矛盾rho相关分析和kruskal-wallis测试。通过化学测量技术分析了用于细胞系的结果：基于欧几里德距离和平行因子分析（PARAFAC）的聚类分析。数据显示为平均值±SEM。统计显着性水平设定为 。

结果

3.1。细胞毒性分析

所检查的香豆素的细胞毒性在米托蒽醌M（+）和不存在米托蒽醌的存在下，使用台盼蓝活体染色估计。该实验在一式三份进行，并计算平均值从给定的值（表1,2,3.,4)。

香豆素衍生物对5种癌细胞株的细胞均表现出不同的细胞毒性，其细胞毒性取决于IC10、IC10M(+)、IC50和IC50 M(+)的剂量。

的细胞毒性依赖于关系的类型和细胞系的类型。It turned out that the most sensitive cell lines to the IC10 dose were CCRF/CEM > HL-60 > CEM/C1 > HL-60/MX2 > HL-60/MX1 and to the IC50 dose without mitoxantrone were CCRF/CEM > CEM/C1 > HL-60 > HL-60/MX1 > HL-60/MX2.

结果显示，IC10对CCRF/CEM > HL-60 > CEM/C1 > HL-60/MX2 > HL-60/MX1和米托蒽醌IC50对CEM/C1 > CCRF/CEM > HL-60 > HL-60/MX2 > HL-60/MX1最敏感。

３．２．用化学计量学分析基因表达

在对数据结果的初步统计分析中，使用了描述性统计、最小值和最大值、平均值和标准方差。

在研究香豆素衍生物后，为了研究与多药耐药相关的化合物、细胞系和基因表达变化之间的行为相似性，使用化学计量学技术进行了降维:聚类分析和平行因子分析(PARAFAC)。

为了研究香豆素衍生物作用的相似性分布，还进行了总化学计量学分析(所有表达变化值)。

集群分析的结果呈现为树木图（图1和2)。由于研究的数据是连续变量，因此选择欧几里得距离作为合适的相似性度量。

数据被组织为一个维度张量:四个基因(凋亡,MRP.,含碘,BCRP2），五种细胞系（HL-60，HL-60 / X1，HL-60 / MX2，CEM / C1，和CCRF / CEM），以及8呋喃香豆素衍生物：isopimpinellin（ISO），佛手柑内酯（BER），花椒毒酚（XOL）,xanthotoxin (XIN), byakangelicin (BIN), byakangelicol (BOL), heraclenin (HEC), phellopterin (FEL), and 12 simple coumarins derivatives: herniarine (HER), aesculetin (AET), dihydrocoumarin (DHD), coumarin (COU), aesculin (AEL), umbelliferone (UMB), 4-methylo-7-methoxycoumarin (4,7M), 4-methylo-7-ethoxycoumarin (4,7E), 7-methylocoumarin (7ME), 6-methylocoumarin (6ME), 0,0-dimethylofraxetin (OOD), and scoparone (SCO).

3.3。香豆素衍生数据集

3.3.1。香豆素衍生物基因表达水平的相似性分析

树形图的截止高度（图1(一))设置为12。观测到两个可见星团。第一类为呋喃香豆素:异opimpinellin (ISO)、bergapten (BER)、XOL (XOL)、xanthotoxin (XIN)、byakangelicin (BIN)、byakangelicol (BOL)、heraclenin (HEC)和phellopterin (FEL);第二种是香豆素:herniarine (HER)、七叶香豆素(AET)、二氢香豆素(DIH)、香豆素(COU)、七叶香豆素(AEL)、伞状香豆素(UMB)、4-甲基-7-甲氧基香豆素(4,7m)、4-甲基-7-乙氧基香豆素(4,7e)、7-甲基香豆素(7ME)、6-甲基香豆素(6ME)、0,0-二甲基呋虫素(OOD)和Scoparone (SCO)。

上述数据张量的PARAFAC分析解释了61.56%，其中两个因素的最佳数量。结果分成两组。和前面一样，第一种含有呋喃香豆素衍生物，而第二种含有其他香豆素(图)1 (b))。

3.3.2。用香豆素衍生物刺激细胞系中基因表达的相似性分析

聚类的最佳截止高度被选为14（图1 (c))。基因被分为两组:含碘 + MRP和BCRP2 + MDR1.。PARAFAC结果（图1 (d))没有显示出任何聚集趋势。

3.3.3。香豆素衍生物刺激细胞系特异性基因表达的相似性分析

最佳截止高度设定为20（图1 (e))。第一个集群是由HL-60、HL-60/MX2和HL-60/MX1行创建的，并不严格相似。其余的行更像它们自己。在PARAFAC结果(图1 (f))， HL-60/MX2细胞系是一个可见的异常值，其他细胞系更类似于它们自己。

3.4。香豆素Derivatives + Mitoxantrone Dataset

3.4.1。香豆素衍生物在米托蒽酮暴露细胞基因表达水平上的相似性分析

在聚类分析期间发现紫杉素（AEL）是一个异常值（图2（a）)。Phellopterin（FEL）和heraclenin（HEC）是与自己相似，但比byakangelicin（BIN）略有不同。伞形酮（UMB），0,0-dimethylofraxetin（OOD），蒿属香豆素（SCO），7- methylocoumarin（7ME），6- methylocoumarin（6ME），4- methylo -7-甲氧基香豆素（4,7M），4- methylo-7-乙氧基香豆素（4,7E），和二氢香豆素（DIH）形成可见簇;然而，他们有所不同香豆素（COU）。

在下一个群集中，Bergaptene（BER）和XANTHOTOOSOL（XOL）之间发现了强烈的相似性，其与黄花毒素（XIN）和ISOPIMINELLIN（ISO）不同。

双因素PARAFAC分解说明整个数据的45.89％（图2（b）)。在本次分析中，Aesculin (AEL)和byakangelicin (BIN)被确定为异常值。

3.4.2。香豆素衍生物与米托蒽酮刺激细胞系特异性基因表达的相似性分析

表达水平的含碘和MRP1基因是相似的(图2（c）），而其他基因没有聚类。PARAFAC也没有观察到聚类趋势（图2 (d))。

3．5．细胞系相似

CCRF/CEM和CEM/C1细胞系最为相似(图)2 (e))，而其他细胞系则不聚集。PARAFAC没有观察到明显的聚类趋势(图)2 (f))。

3.5.1。Coumarine Derivatives发表24 h后BCRP2、LRP、MDR1、MRP基因表达的变化(图3(一个)）

我们观察到BCRP基因表达至最小-3.392（mx2 / hl-60; 4,7m; Ic 50），并增加基因表达到最大值含碘2.005倍(mx₁/ HL-60;OOD;IC50),凋亡2.761倍(mx₁/ HL-60;4、7米;IC50),MRP11.407倍(CCRF / CEM;OOD;IC50)。

基因的平均表达水平为BCRP1.06−0.2346 (SD),含碘0.50 0.933 (SD),凋亡0.3664 (SD 1.56)MRP.0.41 0.204 (SD)。

3.5.2。Changes in Gene Expression of BCRP, LRP, MDR1, and MRP1 in Cell Lines after 24 h Exposition on Coumarine Derivatives with Mitoxantrone (Figure3 (b)）

我们观察到基因表达增加到最大值BCRP3.652倍(CEM / C1;AEL;IC50),含碘1.790倍((/ HL-60;7我;IC50),凋亡1.973倍(mx₁/ HL-60;6我;IC50)，降低MRP1基因表达量最低为−0.822 (mx /HL-60;她;IC50)。

基因的平均表达水平为BCRP0.92 0.234 (SD),含碘0.406（SD 0.82），凋亡0.278（SD 0.53），和MRP10.26 -0.006 (SD)。

3.5.3。呋喃香豆素衍生物表达24 h后BCRP、LRP、MDR1、MRP1基因表达的变化(图3 (c)）

我们观察到基因表达增加到最大值BCRP到2.850倍（MX1 / HL-60; FEL; IC50），含碘1.358倍（MX1 / HL-60; BOL; IC50），凋亡到2.513倍（MX2 / HL-60; BOL; IC50），和MRP.0.841倍（CCRF / CEM; BER; IC 50）。

基因的平均表达水平为BCRP 20.800（SD 1.13），含碘0.647（SD 0.37），凋亡0.896（SD 0.83），和MRP10.51−0.189 (SD)。

3.5.4。米托蒽酮对呋喃香豆素衍生物作用24 h后BCRP、LRP、MDR1、MRP1基因表达的变化(图)3 (d)）

我们观察到将基因表达降低至最低限度BCRP至-1.6571折（MX1 / HL-60; IZO; IC50），含碘−1.176倍(CEM / C1;本;IC50),和MRP1至-1.213折（CEM / C1; BOL; IC50）和增加凋亡基因表达到最大2.325倍（CEM / C1; BIN; IC 50）。

基因的平均表达水平为BCRP-0.186（SD 0.94），含碘-0.012（SD 0.48），凋亡0.029（SD 0.87），和MRP10.30−0.541 (SD)。

4。讨论

多药耐药是肿瘤治疗失败的主要原因之一。40多年来，世界各地的许多研究团队一直致力于寻找能够消除多药耐药效应的化合物。多药耐药的机制可以通过膜转运体的过度表达来解释，主要来自ABC家族，这种转运体以一种积极的方式将药物从癌细胞中移除。

在M(+)存在和米托蒽醌M不存在的情况下，采用台台蓝活体染色法估计所检测香豆素的细胞毒性。测定IC10、IC10M(+)、IC50和IC50 M(+)值。香豆素衍生物对5种癌细胞株的细胞均表现出不同的细胞毒性，其细胞毒性取决于IC10、IC10M(+)、IC50和IC50M(+)的剂量。

香豆素化合物的IC10、IC10M(+)、IC50和IC50M(+)对所有试验细胞株均表现出较高的细胞毒性。香豆素化合物的IC50剂量低于呋喃香豆素，表明对肿瘤细胞的毒性作用更强。Yang等人也得出了类似的结论[35.，其中简单香豆素的代表醇比呋喃香豆素表现出更高的细胞毒性。

在此背景下，可以得出结论，无抗性表型的品系对香豆素类化合物的影响更敏感。最不敏感的细胞系是HL-60/MX1和HL-60/MX2，来自早幼粒细胞白血病。

天然和合成的香豆素物质通常筛查各种癌细胞系中的癌症毒性[36.- - - - - -39.］．文献综述显示，研究最普遍的白血病是HL-60。

Yang等人[35.]，从中分离出五种香豆素物质Cnidium monnieri然后检测其对HL-60细胞的毒性。IC50值建立在不超过50的水平上μ.M为isoopimpinellin (ISO)、bergapten (BER)和xanthotoxin (XIN)。在我们的工作中，isoopimpinellin (ISO)和bergapten (BER)得到了相似的值，但黄毒素(XIN) 61的值略高μ.米/毫升。

基于MDR基因表达的欧氏距离聚类分析将检测的化合物分为两组。第一组包括呋喃香豆素衍生物，第二组包括香豆素衍生物。这种分裂表明这些化合物对癌细胞的转录组有不同的作用机制。

大多数研究人员在香豆素类化合物的工作中诱导表达增加凋亡,BCRP,含碘,MRP.基因在白血病细胞中[40.- - - - - -42.］．这种现象可以通过细胞对香豆素化合物的防御机制的正确检测来解释，香豆素化合物被细胞识别为外源性物质。

然而，据我们所知，这是描述的香豆素类化合物与米托蒽醌对多药耐药基因表达的影响研究的首次报道。我们的研究显示，在呋喃香豆素化合物的米托蒽醌的存在的情况下，的表达凋亡,BCRP,含碘,MRP.基因减少，这可能对治疗背景感兴趣。

研究ABC家族的基因表达水平在临床实践中经常使用。ABC家族的基因表达水平在患者治疗开始前进行检测。结果取决于进一步的治疗。在白血病诊断中评估ABC基因表达可能有助于早期识别需要单独治疗的治疗失败风险患者[40.,41.,43.］．

根据ABC家族基因在白血病细胞中的表达分析和统计分析结果，呋喃香豆素类化合物在作用机制方面更有前景。

香豆素化合物的高活性似乎是设计新类似物的设计的基础，其特征是通过增加的活性和使用安全性。研究人员的挑战是基于设计和合成高度活跃的衍生品和阐明其行动机制的新药。新工会结构设计的最新进展可能导致对新型抗癌药物的发现。增加癌症死亡率和高医疗费用是不断寻求患有疗效的抗癌药物的激励。

所获得的结果显着扩大了对香豆素化合物的抗癌效果的知识及其对表达的影响凋亡,BCRP,含碘,MRP.人造血系统肿瘤细胞多药诱导基因:CEM/C1、CCRF/CEM、HL-60、HL-60/MX1、HL-60/MX2。

耐药基因的过度表达导致细胞产生耐药，在癌症的治疗中具有重要意义。通常，它是治疗失败的一个主要因素。因此，寻找能够安全地调节影响多药耐药基因表达的新化合物是很重要的。

5.结论

（1）大部分香豆素化合物的IC10、IC10M(+)、IC50和IC50M(+)值均为首次估算。结果表明，检测的细胞株CEM/C1、CCRF/CEM、HL-60、HL-60/MX1、HL-60/MX2具有较高的细胞毒性。（2）观察到无抗性表型的细胞系对香豆素类化合物更敏感。来自早幼粒细胞白血病的HL-60/MX1和HL-60/MX2细胞最不敏感。（3）以呋喃香豆素化合物为例，在米托蒽醌存在的情况下凋亡,BCRP,含碘,MRP.基因减少，这可能对治疗背景感兴趣。（4）基于基因表达进行的聚类分析清楚地将检测的化合物分为两组。第一组包括呋喃香豆素衍生物，第二组包括香豆素衍生物。这种分裂表明这些化合物对癌细胞的转录组有不同的作用机制。PARAFAC分析证实了这一观察结果。（5）所获得的结果显着扩大了对香豆素化合物的抗癌效果的知识及其对表达的影响凋亡,BCRP,含碘,MRP.基因在人造血系统的肿瘤细胞系：CEM / C1，CCRF / CEM，HL-60，HL-60 / MX1，和HL-60 / MX2。

缩写

HL-60：	来自美国型文化收集的人白种人暴露细胞白血病（ATCC CCL-240™）
HL-60 / mx₁:	美国型培养人急性早幼粒细胞白血病(ATCC CRL-2258™)
HL-60 / (:	来自美国型文化集合的人类白种人急性早产儿白血病（ATCC CRL-2257™）
杰姆/ C1:	美国型培养人急性淋巴母细胞白血病(ATCC CRL-2265™)
CCRF / CEM:	美国型培养人急性淋巴母细胞白血病(ATCC CCL-119™)
ISO:	Isopimpinellin
数量:	贝加斯滕
XOL:	花椒毒酚
辛：	花椒毒素
垃圾箱：	Byakangelicin.
起点:	Byakangelicol.
巴黎高等商学院:	Heraclenin
FEL：	Phellopterin
她：	Herniarine
让:	秦皮乙素
DHD：	Dihydrocoumarin
cou：	香豆素
AEL:	七叶树素
UMB:	Umbelliferone
4,700：	4-甲基-7-甲氧基苏马林
4、7 e:	4-甲基-7-乙氧基苏马林
7我:	7-甲基ocoumarin.
6我:	6-甲基乌马林
OOD:	0,0-dimethylofraxetin
上海合作组织:	Scoparone。

利益冲突

作者声明没有竞争的经济利益。

致谢

作者感谢波兰国家科学中心(NN 40516639 - abk)的支持。这篇论文是使用在2007-2013年波兰东部业务方案发展(优先轴一现代经济)“研究用于治疗文明和肿瘤疾病的新药物的创新实验室设备”项目中购买的设备开发的。I.3创新促进(ABK, JK)

补充材料

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参考

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