文摘

菲兰l .(印度醋栗)被用于阿育吠陀的有力rasayan治疗肝脏疾病。大部分的药理研究,然而,在很大程度上集中在PE水果,而其余的部分体育,特别是,树皮,保持underinvestigated。因此,我们旨在调查hydroalcoholic提取的保护作用菲兰树皮(尿)ethanol-induced肝中毒大鼠模型。总酚、类黄酮和单宁含量和体外抗氧化活性测定采用H₂O₂清除和abt脱色化验。我们的结果表明,尿是丰富的总酚类(mg GAE / g)、总类黄酮(mg槲皮素水合物/ g),总单宁(mg儿茶素/ g),这显然支持其强大的抗氧化潜力。HPTLC-based定量分析揭示了强有力的抗氧化剂的存在没食子酸(25.05毫克/克)和鞣花酸(13.31毫克/克)。此外,一个月尿治疗(500和1000毫克/公斤,订单)。其次是30天70%乙醇(10毫升/公斤)政府显示hepatoprotection就是明证ALT显著修复()、AST (),高山(),TP (),进一步证实了肝脏组织病理学。PEE-mediated hepatoprotection可能是由于其自由基清除和抗氧化活性可能归因于其抗氧化成分,也就是说,鞣花酸和没食子酸。因此,本研究的结果支持在阿育吠陀治疗主张菲兰。

1。介绍

饮酒是很常见的在大多数文化中这可能是酒精滥用的原因之一。另外,酒精性肝病(ALD)代表一个范围的临床疾病和形态变化,从脂肪肝肝脏炎症最终进行性纤维化和肝硬化。广泛接受的机制ethanol-induced肝损伤肝细胞脂肪堆积,CYP2E1感应,氧化stress-mediated肝细胞损伤(1]。CYP2E1,细胞色素P450酶的主要变异以及微粒体乙醇氧化系统的一个组成部分(meo),乙醇代谢中起着重要的作用。乙醇消费后,CYP2E1活动可以增加到四倍(2]。乙醇脱氢酶和MEOS-mediated乙醇代谢产生乙醛的生产,产生活性氧。由此产生的活性氧产量导致氧化应激,内质网应激和脂肪变性。ROS生产的另一个来源是通过激活的肝细胞NADPH氧化酶。ROS-mediated氧化应激被认为是最重要的诱发因素ALD的病理。活性氧导致肝损伤通过各种机制包括抗氧化酶失活,减少谷胱甘肽耗竭,改变脂肪分解的分子,和脂质过氧化作用。集体所有这些变化导致肝细胞炎症和细胞凋亡(3]。另一方面,细胞抗氧化环境被耗尽;尤其是慢性乙醇导致消费减少谷胱甘肽耗竭,使肝细胞更敏感ROS-mediated氧化应激(4]。

草药提取物表现出对氧化应激的保护机制增强抗氧化酶的活动和避免谷胱甘肽耗竭(5]。菲兰l . (PE)是一种热带和亚热带树,属于大戟科,分布在整个德干,沿海地区,克什米尔和印度中央邦的落叶森林。体育也广泛分布在大多数热带和亚热带国家包括中国和印尼和马来半岛。PE原产于热带东南亚,尤其是,在中部和南部印度、尼泊尔、巴基斯坦、孟加拉国、不丹、斯里兰卡、缅甸和马斯克林群岛(6]。体育是一个中型到大型落叶植物7 - 19米高野生或栽培在热带印度,树皮灰色和红色的木头。PE似乎是闪亮的灰色的树皮棕色或灰色绿色和12毫米厚。根据两个主要在阿育吠陀经典文本,Charak Samhita, Sushruta Samhita,印度醋栗被认为是“最好的振兴药草和酸的水果之一。各种有益的影响”兰索已描述的“药品”,印度古典文本的阿育吠陀医学系统(7]。体育是一种主要成分在很多阿育吠陀的准备包括Triphala Chyawanprash,一般主音为所有年龄段的人整体的精神和身体状况。传统体育被用于阿育吠陀治疗腹泻和发热、利尿剂,在炎症,皮肤溃疡,伤口,一个强有力的rasayan在肝脏疾病(8,9]。植物的果实已经规定了不同的药理活性如抗氧化剂(10,抗肿瘤11],gastroprotective [12,止咳药13],王亚南[14),和抗糖尿病的15]。

PE的整个地区,包括水果、花、种子、叶、根和树皮,已经广泛应用于各种民间系统,如系统的印度传统医学(阿育吠陀)、中药、西藏医学,和阿拉伯医学(Unani)。生活在中国的西南少数民族使用治疗湿疹的根源和水果治疗黄疸和腹泻,然而,在尼泊尔,它用作收敛剂和止血16- - - - - -18]。树皮PE具有强大的抗氧化和自由基清除活动证明它可以与多酚类物质的存在(19]。作为一个丰富的单宁(21 - 33%),PE的树皮单宁提取的主要原材料之一,在中国生产。大部分的药理研究,然而,在很大程度上集中在PE水果,而其余的部分体育,特别是,树皮,保持underinvestigated。目前只树皮伤口愈合活动的体育报道(20.]。

等PE含有抗氧化成分总酚类、黄酮类、单宁丰富和ROS-mediated氧化应激是主要负责饮酒导致的肝损伤的机制,我们旨在评估的王亚南活动hydroalcoholic树皮中提取的p .兰索(尿尿)在大鼠乙醇中毒。

2。材料和方法

2.1。化学物质

水飞蓟素是从麦蓝购买,班加罗尔,印度。没食子酸和鞣花酸从自然疗法pvt Ltd .)购买印度班加罗尔。诊断工具分析ALT, AST,高山,和总蛋白从波峰购买生物系统公司,印度果阿。

2.2。工厂收集和验证

新鲜树皮的PE收集克姆村Solapur马哈拉施特拉邦,印度,在季风季节,用水洗了彻底,shade-dried。凭证标本(没有:rmc - 1. - bsi /中心/ Tech.2012)是由印度的植物调查,识别和验证浦那。

2.3。提取

干树皮粉(100克)提取了250毫升绝对比例的乙醇和水的混合物7:3使用索氏仪器。此外,hydroalcoholic提取下蒸发干燥,蒸馏减压旋转蒸发器。尿的收益率是3 g / 100 g的PE树皮。尿是然后进行表征和植物化学的筛查。

2.4。植物化学的筛选

小便受到植物化学的评估检查存在的碳水化合物,黄酮类、单宁、苷类、皂苷、生物碱、甾醇类和常用药用氨基酸。总酚类、类黄酮和单宁也量化撒尿。

2.4.1。总酚类化合物

总酚含量测定尿中的基于Folin-Ciocalteu (FC)比色法(21]。总之,1毫克/毫升尿与FC试剂准备和混合。3分钟后,3毫升的碳酸钠(20%)被添加到反应混合物和允许站为2 h偶尔摇晃。蓝色的吸光度测量使用分光光度计在760海里。总酚含量计算校准曲线的没食子酸和总酚类表示为没食子酸的浓度相当于毫克/克干尿。

2.4.2。类黄酮

总类黄酮含量测定采用氯化铝试验通过比色测定法(22]。一毫升尿与2毫升蒸馏水稀释,5分钟后,3毫升的5%亚硝酸钠和0.3毫升的10%三氯化铝是补充道。6分钟后,2毫升1 M氢氧化钠添加和体积是10毫升蒸馏水。孵化后一个红颜色的复杂成立以510海里。黄酮醇含量计算槲皮素,校准曲线的表示为槲皮素相当于毫克/克撒尿。

2.4.3。丹宁酸

总单宁含量是决定使用修改过的香兰素试验(23,24]。尿(1毫升1毫克/毫升)在水浴孵化为一段时间温度均衡。工作香草醛试剂(5毫升)添加到样品和5毫升4%盐酸作为空白。样品和空白都孵化20分钟在500 nm和吸光度是阅读。总单宁含量计算校准曲线的儿茶素,并表示为儿茶素等价物毫克/克撒尿。

2.5。描述小便使用效果分析

2.5.1。仪器及色谱条件

尿是标准化依照[Kannan Jeganathan和使用效果分析25)使用尿的解决方案(20毫克/毫升)和标准股票解决方案没食子酸和鞣花酸的股票(10μg / mL),准备在高效液相色谱级甲醇。股票的解决方案和尿透过0.45μ注射器过滤器,然后进行效果分析。执行的分析比较和插值的尿峰面积与标准没食子酸和鞣花酸的校准曲线。

效果与硅胶板预镀铝法郎_254年与200年(10×10厘米)μ米厚度(默克公司)作为固定相。使用的流动相是甲苯:乙酸乙酯:甲酸(2:7:2)。提升发展在一个双槽玻璃室进行饱和与流动相溶剂直到达到最大距离160 mm。板是在室温下饱和30分钟(°C),随后可以在室温下干燥。效果上的分隔带盘子被扫描的波长200 - 400纳米,最大吸收波长280纳米。峰值区域记录获得没食子酸的浓度和鞣花酸。

2.6。体外抗氧化活性

2.6.1。过氧化氢清除活动

简单,制备了不同浓度的尿和混合0.3毫升的4毫米的解决方案在磷酸盐缓冲(0.1米,pH值7.4)和孵化了10分钟。溶液的吸光度是在230 nm空白解决方案包含尿没有H₂O₂。抗坏血酸作为标准。所有测量都是在重复和平均这两个观测结果被认为是。然后清除效果计算根据以下方程: 在哪里=控制和吸光度=提取液的吸光度。

相当于抗坏血酸浓度计算的值通过绘制标准曲线的尿抗坏血酸。电子商务₅₀值(毫克/毫升)的浓度清除活动(50%26]。

2.6.2。abt自由基清除活性

在这种方法中,abt是溶解在蒸馏水达到7毫米的浓度。abt激进的阳离子(abt^•+)是由反应abt原液用2.45毫米的过硫酸钾和混合物在室温下被允许站在黑暗中使用前12 - 16 h。尿的百分比清除活动是由计算%抑制由以下公式和结果进行了比较与抗坏血酸标准: 在哪里=控制和吸光度=尿的吸光度。

相当于抗坏血酸浓度计算的值通过绘制标准曲线的尿抗坏血酸(27]。

3所示。王亚南活动

3.1。动物

雄性Wistar鼠(150 - 200 g)保持在国家毒理学中心(浦那(印度)。动物被安置在群六(三个平行性在一个笼子里)在聚丙烯的笼子里,适应于标准实验室条件下(温度°C,相对湿度%)的实际开始前一个星期的实验。光暗周期12-12 h是维持动物。他们提供的标准食物颗粒(NAV马哈拉施特拉邦Chakan榨油机有限公司,普纳)和自来水随意。动物研究和协议批准机构伦理委员会(CPCSEA / IAEC / NTC / P-200/2012)。

3.1.1。Ethanol-Induced肝毒性

动物被随机分成五个不同的组每组包含六个动物。组我担任正常控制和1毫升/公斤盐汇票30天。第二组担任疾病控制和70%乙醇(10毫升/公斤订单。)30天。第三组作为积极的控制和得到水飞蓟素(25毫克/公斤订单)。其次是70%的乙醇(10毫升/公斤订单。)30天。组IV和V作为治疗组和接收小便口服剂量的500和1000毫克/公斤,分别,其次是70%的乙醇(10毫升/公斤订单。)30天。

3.1.2。生化估计

4周结束时,一夜之间,动物被饿死,然后牺牲了过量的麻醉。血液收集和保存1 h在室温下凝血。血清被离心分离的3000 rpm 20分钟和生化参数血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)的活动,和总蛋白质含量测定光谱光度测量的程序,使用ERBA化验用品(ERBA诊断曼海姆GmbH,曼海姆,德国)。

3.1.3。组织病理学检查

研究中使用的动物牺牲,肝组织严重,重检查。每个动物的肝组织的一小部分固定在10%中性缓冲福尔马林处理。然后是嵌入在石蜡获得5 - 6μ米厚的苏木精和伊红染色部分审查(28]。

五个字段被200年组织病理学的放大迹象致盲。正弦拥堵(在肝实质),肝细胞的退行性改变,细胞肿胀,空泡的变化与肝细胞的细胞质颗粒,坏死肝实质的变化,细胞核,细胞核的分裂,小叶,midzonal坏死,胆管增生,血管周围淋巴聚合、单核细胞浸润(跨国公司),形成microgranuloma,脂肪肝(肝细胞脂质沉积),和脂肪变性分级如下:没有异常检测(NAD),最小的病理变化(+),轻度病变(+ +),中度病变(+ + +),和严重的病理变化(+ + + +)。

3.2。急性毒性研究

尿的急性毒性研究是使用男性执行白化病老鼠。这些动物禁食一夜之间在标准条件下实验前和维护。进行的这项研究是根据经济合作与发展组织(OECD)在急性口服毒性测试指南425 (29日]。这项研究是在一个逐步的过程。步中,我使用了三种动物和2000毫克/公斤的尿。当死亡被发现不太可能,第二步。在第二步中,额外的三个动物再次考虑到尿的剂量2000毫克/公斤,观察14天。

3.3。统计分析

从体外实验中获得的数据被表示为±SEM。体内实验和统计的治疗和控制之间的差异是由一维方差分析评价Dunnett测试紧随其后。的概率值被认为是重要的。

4所示。结果

4.1。定性分析的植物化学物质出现在尿中

如表所示1定性分析,尿了黄酮类化合物的存在,单宁,苷、皂苷、生物碱。

4.2。量化的总酚、类黄酮和单宁的内容出现在尿中

如表所示2,尿的量化植物化学的筛选显示的总酚类、类黄酮和单宁。

4.2.1。准备总酚含量

尿的总酚含量决定从校准曲线的回归方程(),发现99.523毫克/克相当于275μ没食子酸的g / mL。

4.2.2。总类黄酮含量

尿的总类黄酮含量是决定从校准曲线的回归方程(),发现389.33毫克/克相当于200μ槲皮素水合物的g / mL。

4.2.3。总单宁含量

尿的总单宁含量是决定从校准曲线的回归方程(),发现310毫克/克相当于300μ儿茶素的g / mL。

4.3。没食子酸的效果分析和鞣花酸在尿尿

线性校正曲线的没食子酸和鞣花酸测试通过线性回归分析,发现线性浓度范围60μ与相关系数(g / mL)超过0.99。没食子酸的山峰和鞣花酸在尿中被确认通过比较参考没食子酸和鞣花酸的保留时间。没食子酸的量和鞣花酸尿估计约为25.05毫克/克没食子酸和13.31毫克/克鞣花酸。

4.4。体外抗氧化活性

4.1.1。过氧化氢清除活动

尿的能力和抗坏血酸清除过氧化氢自由基如表所示3。小便被以剂量依赖的方式清除自由基的能力。200的浓度μg / mL,抑制尿(43.20%)几乎与抗坏血酸(55.39%)。然而,在250年μ克/毫升尿,尿的抑制百分比是79.62%,这被发现比抗坏血酸(71.34%)。的集成电路₅₀尿是188.80的价值μ177.7 g / mL,抗坏血酸的μ克/毫升。

10/24/11。abt自由基清除活性

尿的abt自由基清除活动被发现浓度依赖性。abt的最大抑制自由基浓度的250μg / mL是效果低于42.91%的标准(表4)。的集成电路₅₀尿的价值是329.20μ133.96 g / mL,抗坏血酸的μ克/毫升。

4.5。生化估计

如表所示5乙醇中毒组显示,血清ALT水平显著增加()、AST (),高山()以及减少总蛋白()与正常大鼠相比,表明乙醇肝毒素的效果。经过政府的小便的剂量500毫克/公斤,显著降低ALT水平升高()、AST (),高山(TP)观察以及改善内容(对正常)。管理1000毫克/公斤剂量的尿也恢复了ALT水平升高()、AST (),TP (),但高山的影响无统计学意义。影响尿的剂量为500毫克/公斤ALT, AST,高山,和TP含量相当的水飞蓟素,一个标准的王亚南代理。当测试和标准药物治疗组与正常对照组相比,无显著性差异,所有提到的生化参数。测试和标准药物治疗组之间的区别也是统计学无意义的。

4.6。组织病理学检查

不同组大鼠的肝脏组织学部分如图1。考试的组织学活动指数(HAI,表6)的肝脏发现动物的正常对照组显示正常肝实质的histoarchitecture中央静脉周围肝细胞排列成绳就像时尚。细胞核和细胞质显示正常的组织学特性与完整无缺和细胞质的正常形态和血管和胆管门户三和弦。

肝脏疾病对照组部分显示中度损伤程度与弥漫性肝实质细胞肿胀、退行性改变细胞质、细胞核和坏死的病灶部位在midzonal地区。许多肝细胞显示类脂物质积累而一些领域显示错乱的肝索和坏死的肝细胞的变化与偶尔的嗜碱性肝细胞的细胞核和细胞质空泡的变化。病灶部位的出血退行性肝实质的焦点也见过几个部分。总体特征表明中等程度的病变导致脂肪肝与退行性条件和随后的渐进性坏死的变化(数据1(一)和1 (b))。

肝脏部分动物的尿500毫克/公斤组显示最小轻微程度的histolopathological肝实质的变化。肝细胞肝细胞显示最小pathomorphological特征与多病灶的领域的细胞肿胀,空泡的变化,局部浸润的单核细胞在肝实质。局灶性增生的胆管在门户三也指出在一个动物的组织有轻度肝实质病变。

相比尿500毫克/公斤,肝脏的组织学评估尿1000毫克/公斤集团的部分显示只有最小的变化与正常肝细胞和肝实质血管和胆管。焦点的变化最小的学位被认为只有少数肝细胞以更少的严重性没有坏死特征。

肝脏部分SIL 25毫克/公斤组显示正常肝实质与正常肝细胞和血管和胆管。焦点的变化最小的学位被认为只有少数肝细胞以更少的严重性没有坏死特征。SIL 25的观察,500年小便,尿1000毫克/公斤组相互比较轻微的差异。

4.7。急性毒性研究

小便没有任何明显的体重变化和行为模式。没有毒性的迹象和症状或死亡的剂量水平2000毫克/公斤(数据没有显示)。LD的₅₀被发现超过2000毫克/公斤截止5000毫克/公斤。

5。讨论

乙醇是一种熟悉的肝毒素的化学用于诱导肝损伤动物。毒性由乙醇的氧化代谢有关酶乙醇脱氢酶和CYP2E1 [30.]。乙醇的代谢导致生产超氧化物升高(31日和过氧化氢自由基32,33]。此外,也能减少肝脏谷胱甘肽水平的乙醛含量增加,会损害身体的防御系统中和自由基和激活吞噬细胞。这种生产过剩的自由基最终导致脂质过氧化水平增加随后形成加合物与细胞蛋白质和核酸。这些加合物最终极限肝细胞的功能(33]。

在目前的研究中,尿的王亚南评估使用饮酒导致的肝毒性模型,因为它是临床相关。乙醇生产的一组特征影响肝脏中导致“肾上腺脑白质退化症”(34]。在类似的方式,我们还发现,生化和建筑扰动乙醇中毒大鼠的肝脏。慢性乙醇管理导致血清ALT水平的一个重要高度,AST,高山。ALT水平的增长通常伴随着海拔的AST水平,中扮演重要角色的转换氨基酸酮酸。减少水平的总蛋白(TP)在酒精治疗大鼠显示破坏肝细胞的数量,这可能导致减少肝脏合成蛋白质的能力。

酒精intoxication-mediated氧化应激导致细胞膜脂质过氧化反应和改变膜磷脂成分和流动性,从而增加细胞膜通透性。这些受伤的细胞膜渗漏原因各种酶包括ALT、AST、ALT到血液循环如图所示异常高水平的血清肝疾病对照组的标记。目前观测符合先前的研究表明,ALT, AST,高山通常位于细胞质中,肝细胞损伤后释放到体循环(35]。血清ALP水平升高可能是由于有缺陷的肝脏排泄或增加产量的高山肝实质或导管细胞。Ethanol-mediated肝细胞损伤也体现在我们的研究中,慢性乙醇导致管理类脂物质积累在肝细胞,肝索的错乱,肝细胞坏死和空泡的胞质变化。

然而,口服尿显著降低血清AST、高山和ALT在剂量。1000毫克/公斤剂量的尿相比,其剂量500毫克/公斤被发现更有效。王亚南的效果观察与尿的剂量1000毫克/公斤相比没有明显突出,观察尿500毫克/公斤。获得hepatoprotection与尿可能是由于尿恢复肝细胞细胞膜的完整性,导致恢复肝酶。此外,抑制升高高山活动并发增加总蛋白质含量显示胆道功能障碍的稳定性与毒物在鼠肝肝损伤。治疗明显尿总蛋白水平升高与标准药物水飞蓟素相当。王亚南小便被发现的活动更加突出的剂量500毫克/公斤比对照组相比1000毫克/公斤。

除了ethanol-mediated氧化应激,酒精是一个著名的基因毒性物质导致基因组不稳定性。这可能是另一个导致饮酒导致的肝损伤的机制。郭和王最近做的一项研究表明,体育可以激活主轴装配检查点和防止人体细胞有丝分裂畸变和基因组不稳定。因此,PE的王亚南潜力也可能归因于内生机制的强化与饮酒导致基因组不稳定性(36]。

植物化学的初步筛选尿的尿以及量化了单宁的存在,类黄酮和酚类。此外,定量表征的尿效果方法显示它是一个富含鞣花酸和没食子酸。所有这些测量植物成份早些时候在本研究报告他们的抗氧化潜力的许多研究人员(37- - - - - -39]。在这种背景下,一种抗氧化剂和王亚南尿在这项研究中观察到的活动可以归因于没食子酸的含量高和鞣花酸。大量的证据显示的王亚南潜力没食子酸和鞣花酸40- - - - - -44]。

在目前的研究中,体外抗氧化试验结果如过氧化氢试验(IC₅₀值:188.80μg / mL)和abt试验(IC₅₀值:329.20μg / mL)明显显示剂量依赖的自由基清除潜在的撒尿。我们的研究结果与以前的研究结果(45,46]。作为体外方法被广泛使用,因为它们与生物系统,体外自由基清除效果的尿相关体内抗氧化活性。研究表明,PE变弱氧化应激和损伤增加内源性抗氧化酶有关。最近,Tahir等人报道,PE叶萃取精华改善肺纤维化的提高过氧化氢酶的活动,超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶,谷胱甘肽降低大鼠的肺样本(47]。此外,报告表明,PE增加抗氧化酶和防止ethanol-induced毒性作用[48]。考虑到先前的研究发现,尿中观察到的王亚南目前的研究可能是由于修复和/或增加内源性抗氧化环境。

虽然水飞蓟素,一个孤立的王亚南类黄酮,是一种最在动物以及人类学习植物成份,PE水飞蓟素相比,具有很多优点。体育是一个丰富的抗坏血酸和其他植物成份来源包括亚油酸,emblicanin emblicanin B,没食子酸,chebulic酸、鞣花酸、槲皮素和芦丁。这些植物成份之间的协同交互或多因子的影响使体育更好的王亚南草药形态。简单地说,植物成份以整体的方式出现在体育工作。虽然剂量反应关系可以很容易地建立在使用水飞蓟素(单个孤立的组成),尿的完整描述可以解决体育的整体提取的限制。在这项研究中,水飞蓟素的王亚南效果略优于体育就是明证生化和组织病理学参数。水飞蓟素和体育有许多机制,负责他们的疗效包括自由基清除活性,抗氧化活性,增加内源性抗氧化酶、脂质过氧化反应和炎症的衰减,刺激蛋白质合成。

总之,在体外和体内研究证实的抗氧化剂以及王亚南潜力hydroalcoholic提取的p .兰索树皮和发现它与水飞蓟素类似,一个标准的王亚南phytoconstituent。

6。结论

本研究的数据表明,尿具有强力的抗氧化活性自由基和保护提供了重要的反对饮酒导致的肝损伤。生化分析表明,尿有效恢复的ALT水平,AST,高山,TP,进一步支持的组织病理学观察。由此产生的抗氧化和王亚南活动的小便可以归因于没食子酸的存在,鞣花酸、多酚、类黄酮。虽然研究结果证实PE树皮的治疗潜力,还需要进一步的研究来确定和隔离的多酚化合物的抗氧化活性负责撒尿。进一步的调查然后小便可以决定其使用酒精性肝病患者。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者衷心感谢这个熊猫博士,副教授,药理学系主要k . m . Kundnani药学院,孟买,印度,为她输入编辑的手稿。他们也感谢达瓦帕特尔和杰岛上,研究学者,他们的建设性的建议和帮助在这个研究。