文摘

背景。血栓栓塞事件构成一个主要卫生问题,尽管稳步扩张的抗血小板药物。因此,仍有需要优化抗血小板治疗。目标。我们研究的目的是验证一个假设没有血小板的差异蛋白质组两组之间健康的人代表不同乙酰水杨酸(阿司匹林)反应评估由液相色谱/质谱(LC / MS)技术。患者和方法。共有61名健康志愿者参加了这次研究。体格检查和血液采集是紧随其后的是富含血小板血浆聚集化验和血小板分离蛋白质组LC / MS分析。花生四烯酸(AA)诱导聚合(阿司匹林)的存在允许把参与者分成两组aspirin-resistant (AR)和aspirin-sensitive ()。随后,血小板蛋白质组相比在团体使用LC / MS分析。结果。血小板的LC / MS分析蛋白质组团体之间显示的识别蛋白质,唯一的歧视性的蛋白,影响阿司匹林反应,是血小板二碳酸酐酶(CA II)。结论。CA II是一种血小板功能调制器和应该考虑作为心血管事件危险因素或治疗的目标。

1。介绍

尽管抗血小板药物的稳步扩张阿森纳,血栓栓塞事件仍在临床实践中常见的(1]。乙酰水杨酸(ASA,阿司匹林),广泛应用于high-cardiovascular-risk人口,在很多情况下是无效的。这种现象被称为阿司匹林抵抗(AR),仍然是一个重要的临床问题。其发病机理和发病率持续大量研究和争论的话题2- - - - - -5]。ASA施加其anti-aggregatory效果主要通过抑制血小板COX-1,随后从花生四烯酸凝血恶烷形成级联。阿司匹林抵抗,在分子水平上,可能是原因,也就是说,COX-1功效的变化由ASA(乙酰化6]。研究集中在以这种方式定义的基于“增大化现实”技术的现象不精确去年阿司匹林剂量之间的时间框架和血液采样6,7]。

另一方面,ASA治疗失败可能导致从COX-1独立的因素,包括不服从(7),血小板增加营业额(2),和血小板COX-1再合成(8,增加血小板反应性的因素。最新的,有几个文件描述因素,ASA治疗过程中表达增加,相关的基于“增大化现实”技术的现象。Voora等人的研究表明,ASA治疗后4周(325毫克/天),血小板对ADP,肾上腺素和胶原蛋白显著增加,尽管充分考克斯抑制(9]。作者引入了术语“阿司匹林反应签名,”这是一组coexpressed基因评估外周血ASA治疗期间与COX1-independent强烈相关的血小板功能和代表心肌梗死和死亡的风险增加10]。

此外,Massimi等人在这两方面都证明了亚撒在体外细胞系(11,12),在活的有机体内血小板(超过两个月的治疗)多药耐药性的增强表达蛋白4 (MRP4),高浓度的与大TxB2合成有关,随后更强烈胶原诱导聚合(13]。血小板MRP4还可能引起其他非甾体类抗炎药(14]。因素的存在增强“阿司匹林”花生四烯酸诱导聚合(专门限于COX-1通路)验证了弗洛伊德等人谁发现真正抗对象具有更高的血小板糖蛋白的表达iii a (GPIIIa) ASA治疗后28天(300毫克/天)15]。

值得注意,在一些研究中观察到血小板中个人间的异质性在体外应对低ASA剂量(15]。诱导因素限制ASA旁边的问题出现了,如果长期治疗,有既定的存在因素限制血小板反应ASA在基线。

一个新颖的方法,使用的技术分析功能proteome-should允许定义因素确定血小板活动的个体差异性。通过分析患者的血小板蛋白质组ASA阻力,我们旨在定义小说机制限制血小板反应乙酰水杨酸。

因此,这项研究的目的是验证假说有关组织之间缺乏血小板的差异蛋白质组具有不同敏感性的阿司匹林,液相色谱/评估的质量apectrometry (LC / MS)技术。

2。材料和方法

2.1。生物伦理学的声明

所有实验和批准按照当地生物伦理学委员会的指导方针,遵守赫尔辛基宣言的原则和标题45岁的美国联邦法规,46岁的一部分保护人类受试者(修改:2001年11月13日;有效:2001年12月13日)。所有参与者提供他们的书面同意参与这项研究。书面同意书之前得到伦理委员会的批准。

2.2。招聘和考试

共有61名临床健康志愿者(60岁)的研究。排除标准是糖尿病、高血压、慢性和急性炎症性疾病,精神疾病,恶性肿瘤,过敏的非甾体类抗炎药(非甾体抗炎药),或使用非甾体抗炎药一个星期前检查。

所有参与者接受了标准的体检,血液收集nontraumatically从肘前的静脉使用Sarstedt S-Monovette®系统(Numbrecht Sarstedt AG) & Co .,德国)。研究参与者被分为两组根据阿司匹林反应(血小板聚集的存在对花生四烯酸(AA)之后在体外孵化的固定剂量ASA)(图1)。

起初,组的基线特征比较:然后,血液测试结果存在差异(包括心血管危险因素和标记的内皮细胞和血小板功能)验证,随后,产生了一种血小板蛋白质组差异分析aspirin-resistant (AR)和aspirin-sensitive()科目。

2.3。Aggregometry

聚合是在富含血小板血浆使用2声道光学凝集计(Chrono-log 490 - 2 d, Chrono-log,宾夕法尼亚州,美国),和不使用阿司匹林和血小板花生四烯酸反应同时进行了测试。聚合歧视团体进行使用花生四烯酸(1毫米的最终浓度)添加到富含血小板血浆(PRP) 5分钟后与乙酰水杨酸(最终浓度30的孵化μ米,5分钟)。受体激动剂应用以来,反应进度记录6分钟使用专用软件(闹事/链接,Chrono-Log,宾夕法尼亚州,美国)。聚合结果计算根据Chronolog软件制造商的指令,并表示为聚合曲线下的面积(AUC)等于零没有聚合过程中计算聚合协议(从受体激动剂添加到终止聚合的最后六分钟)。

完全抑制聚合被亚撒的标准诊断阿司匹林抵抗。实验进行的恒温37°C。

同时,控制聚合进行了使用其他受体激动剂和拮抗剂的最终浓度:AA Lys-ASA 0.03毫米和0.5毫米AA 1毫米和Lys-ASA 0.05毫米。此外,0.05毫米的情况下当Lys-ASA最终浓度是不足以防止AA-induced聚合、测试与Lys-ASA 0.1毫米的最终浓度和AA在恒定浓度的1毫米。

2.4。血小板为蛋白质组学分析做准备

整个血内皮补充(PGI₂0.06)的最终浓度μg / ml,离心20分钟在230×g为了获得PRP 21°C。随后,PRP与PGI补充₂(最终浓度0.3μg / ml), 1000×g离心10分钟21°C。等离子体被丢弃,血小板颗粒轻轻洗了三次1毫升Tyrodes-HEPES缓冲pH值7.4毫升。冲洗血小板悬在4毫升Tyrodes-HEPES缓冲pH值7.4与CaCl补充₂(最终浓度1毫米)。导致暂停立即分析红细胞与白细胞血小板计数和污染我(Sysmex设备,临床实验室部门,大学医院,Wrocław,波兰)。

纯PLT悬挂与Tyrodes-HEPES调整缓冲区包含CaCl pH值7.4₂最终浓度为2.5×10⁸/毫升。样本包含血小板数量的2.5×10⁸和7.5×10⁸为进一步的蛋白质组学分析细胞保存。获得的样本已知浓度的悬浮液的离心5分钟,在4°C 10000×g,储存在−80°C到蛋白质组学分析。

聚合反应血小板分离的胶原蛋白也被执行。一个500μl的血小板悬液(2.5×10⁸/毫升)与胶原蛋白(最终浓度5代替μg / ml),聚合进行了6分钟,然后立即停止,把试管放在冰。颗粒和上层清液被连续离心分离,5分钟在10000×g和4°C。获得材料存储在−80°C到蛋白质组学分析。

2.5。液相色谱/质谱(LC / MS)

所有使用的试剂是σ,除非另有说明。孵化的血小板血小板蛋白提取1%钠脱氧胆酸盐,10毫米TrisHCl pH值8日的十二烷基硫酸钠0.1%,紧随其后的是声波降解法,由离心澄清(股份Minispin 10分钟,12100年)。蛋白质浓度测定,与50 mM磷化氢和蛋白质减少,与200毫米thiosulfonate烷基化,使用修改后的胰蛋白酶消化一夜之间在37°C (V5111 Promega)。消化反应是淬火的2μl 10%三氟乙酸。消化肽的浓度是由微孔的直接检测方法。样品体积对应5μg蛋白质的消化血小板蛋白受到了处理,在此期间肽分离的nano-HPLC C-18列(nano-ACQUITY对称®本·C18,水域186003545)使用乙腈梯度在180分钟(5 - 35%)的0.1%甲酸250 nl /分钟的流量。色谱柱出口直接耦合ESI-LTQ-Orbitrap Velos质谱仪(热电子公司,圣何塞、钙、美国)和操作的女士(肽)的质量的测量和MS / MS(肽碎片)视收购。处理原始数据使用与吉祥物吉祥物蒸馏器随后分析软件(矩阵科学),使用数据库Swiss-Prot,分类限制智人(16]。肽与吉祥物得分超过相应的阈值< 1%罗斯福被认为是最终确认。如前所述(执行Label-free量子化17]。确定蛋白质的列表进行了分析使用Diffprot软件(18]。

2.6。内皮细胞和血小板活化标记

等离子体浓度sP-selectin / CD62P和PAI-1三明治酶免疫分析法测定技术,使用商业ELISA试剂盒(猫:BBE6 DSE100,研发系统欧洲有限公司,英国)的灵敏度0.5 ng / ml,根据制造商的指示。光学密度与BioTek 450/620 nm测量吸光度与软件Gen5标。变异系数(CV) intra-assay %的简历被计算为汇集所有样本的标准差的比值(每分析一式三份)和整体的意思,然后乘以100。Interassay %简历指assay-to-assay一致性池计算使用标准差除以所有复制样品的整体意思然后乘以100,(如前所述)(19]。intra-assay简历少6%,interassay少10%。

2.7。前列腺素类含量测量

等离子体浓度TxB₂和6-ketoPGF-1alpha被恩佐生命科学确定使用商业分析,严格执行了制造商的指令,如前所述19]。

2.8。统计分析

数据表示为均值±SEM。两个连续参数之间的差异使用Mann-Whitney进行评估U测试或学生t以及,Shapiro-Wilk测试和列文测试后。蛋白质组学数据分析了如前一节所述。

3所示。结果

3.1。人口调查子组的基线特征

不同的聚合研究人口分为两组。聚合进行了使用花生四烯酸(1毫米工作浓度)添加到富含血小板血浆中5分钟后孵化与ASA (30μ米,5分钟)。受体激动剂的应用程序后,反应进展记录6分钟。完全抑制聚合的ASA区分的标准是基于“增大化现实”技术的学科。第一个是36科目的血小板抵抗ASA(阿司匹林抵抗(AR))。第二个(年龄和性别匹配)成立由25个人,保存了ASA响应(阿司匹林敏感())。组的特征如表所示1。在一个完整的血细胞计数,群体之间的差异只涉及定量参数的红细胞,血红蛋白,红细胞比容和红细胞计数显著更高。没有观察到的差异的定性测量红细胞(MCV、妇幼保健、MCHC)。

关于生化危险因素,显著差异(AR与)知只有空腹血糖(83.39±1.07和88.52±2.06毫克%,分别地。 )和血清肌酐(0.96±0.02和1.11±0.03毫克%,分别地。 )。然而,这些值都保持在正常的范围内。

3.2。血小板功能

没有明显差异的血小板计数(PLT),大小(血栓)和子组之间的激活水平(sP-selectin浓度)。然而,基于“增大化现实”技术的受试者的特点是低纤溶酶原激活物inhibitor-1 (PAI-1)浓度(3.1±0.3和3.66±0.3 ng / ml,分别地。 ;表2)。

随着人口呈现没有血小板聚集在花生四烯酸反应PRP preincubated固定剂量的阿司匹林。否则,在基于“增大化现实”技术,聚合只有部分屏蔽(256.2±5.2和148.8±9.3天文单位, )。此外,观察学习小组之间的差异不仅ASA孵化后(148.8±9.5和0.08±0.08天文单位, ),而且在基线(AA-induced聚合没有ASA, 256.2±5.2和201.4±12.0天文单位, )(图2)。

3.3。蛋白质组学分析

初步分析方法后,重点统计上显著的蛋白质,我们确定了每个病人平均842蛋白质,基于平均7733肽。结果证明了可再生的样品制备,使全面定量分析。在下一步中,识别蛋白划分根据分子功能和他们的参与生物过程如图3和4。随后的定量分析显示区分蛋白质。的微分分析组血小板之间的蛋白质组研究表明,唯一的歧视性的蛋白,影响反应的阿司匹林,是碳酸酐酶II。同样的结果在不同的设置,在胶原诱导血小板聚集和非聚合(表3)。

4所示。讨论

这是第一次研究证明二碳酸酐酶(CA II)可能与人类阿司匹林抵抗(AR)。CA II蛋白质(酶(EC) 4.2.1.1目录)在血小板首次被描述在30年前(20.和60年前第一次提到的21]。它催化H⁺和HCO₃⁻从有限公司代₂和H₂O为pH值的变化(22]。然而,CA的确切作用二世在血小板仍然没有充分理解病理生理学。CA II基因的突变会导致血小板形态和功能的改变鼠标(23]。

组织在我们的研究中是同质允许假设唯一鉴别器是阿司匹林反应。我们使用了LC / MS技术,这是比其他的更可靠和独立调查员,包括二维电泳(24,25]。

CA II的解释之一,ASA互动,在这项研究中观察到可能的假设,通过调整胞质pH值(22),CA II影响血小板的乙酰化环氧酶通过阿司匹林可能反过来确定应对亚撒。

我们已经表明,血小板与更大的CA II浓度不仅需要降低花生四烯酸浓度来克服ASA堵塞也产生更多有效的基线聚合。我们假定血小板CA II增加血小板对像肾上腺素受体激动剂,凝血酶和花生四烯酸。出于这个原因,人类血小板CA II浓度较高和/或活动可能是血栓栓塞事件的风险。因此,我们假设CA在心血管医学的重要性似乎还是低估了。有趣的是,许多药物常用于心血管医学(主要是利尿剂)抑制CA。CA II活动可以刺激肾上腺素(26]。此外,肾上腺素的潜在启动聚合成正比血小板CA II活动和可能由CA减毒抑制剂如氯噻酮(27]。选择性CA II抑制剂乙酰唑胺,基底和能减少血小板胞质氯浓度和降低凝血酶敏感性[28)类似于另一个CA抑制剂(ethoxzolamide) [29日]。这样的效果也可能获得通过消除有限公司₂从血小板环境(30.]。更重要的是,最近的一次系统性回顾的作者确认thiazide-like利尿剂有优势在thiazide-type减少心血管事件的独立于血压降低(31日),这可能是由于他们的活动对CA II和随后的血小板聚集(27]。

我们的结果对于性别分布在AR人口确认其他团体发布的数据(32),它应该验证如果血小板CA二世提出了不同的sex-dependent活动。降低红细胞(RBC),血细胞容量计,血红蛋白水平的基于“增大化现实”技术的人口是伴随着更高的血小板CA II的内容。贫血缺铁造成的已被证明是缺血性中风的一个危险因素由于反应性血小板增多,这可能是一种代偿机制提供足够的CA活动,通常显著由红血球(33]。红细胞表面血小板CA II可能配合CA在维持血液酸碱度平衡。在我们的研究中,血小板增多并不明显,但CA II表达增加可能诱发血小板功能的差异。

5。结论

第二第二碳酸酐酶(CA)是一个调制器的血小板功能。增加活动和/或CA II在血小板浓度应评为阿司匹林抵抗的新的独立危险因素,因此对血栓栓塞事件。可能会有需要使用药物抑制CA在临床设置更多的现在,特别是在患者血小板活动增加/ CA II。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突,关于这篇文章的出版。

确认

这项研究是由波兰科学和高等教育(批准Iuventus +没有。IP Adrian Doroszko获得的2011 - 010471年)。