文摘

为了研究自噬的影响引起的雷帕霉素在动脉粥样硬化斑块的发展我们在ApoE诱导建立小鼠动脉粥样硬化模型^−−/大鼠的高脂肪和胆固醇的饮食(HFD) 16周。雷帕霉素和3-Methyladenine (MA)分别被用作自噬诱导物和抑制剂。主动脉冠状动脉斑块的地区发现了他和油红O染色。免疫组织化学染色法分别应用于斑块的调查内容。控制和3-MA组相比,雷帕霉素可以抑制动脉粥样硬化进展。雷帕霉素可以增加胶原蛋白含量和a-SMA相对分布,以及减少坏死核心区域。然后我们使用MOVAS文化与ox-LDL 72 h体外诱导光滑肌源性泡沫细胞模型。雷帕霉素和3-MA分别培养在一起。流式细胞术测定和SA -β加染色实验检测VSMCs生存和衰老。免疫印迹分析用来分析蛋白表达的水平。我们发现雷帕霉素可以促进ox-LDL-induced VSMCs自噬生存和减轻细胞衰老,相比,控制和3-MA组。免疫印迹分析表明,雷帕霉素可以上调ULK1, ATG13和表达下调mTORC1和p53蛋白表达。

1。介绍

脆弱的斑块的破裂之后,动脉粥样硬化血栓形成是一种致命的并发症。脆弱斑块的特征是大量坏死脂质核心包含渗透炎症细胞和薄纤维帽较低的血管平滑肌细胞(VSMCs)和细胞外基质。生物学行为(如衰老、凋亡、自噬和扩散)VSMCs是导致动脉粥样硬化斑块进展的主要因素和脆弱性1]。我们认识到,衰老VSMCs展览受损增殖和自我修复能力,这降低了纤维帽形成(2]。在不稳定先进的动脉粥样硬化病变来自病人,衰老VSMCs纤维帽和展览中发现重大损失的增殖能力,伴随着几个衰老标记包括增强senescence-associated的增加β牛乳糖(SA -β加)活动3]。

细胞自噬或self-digestion,基本降解机理,包括降低不必要的或不正常的细胞组件通过溶酶体的行为,据报道已经涉及广泛的哺乳动物疾病。哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR) serine-threonine激酶的一部分mTORC1复杂,调节细胞的生长、增殖,自噬,从营养和新陈代谢通过集成信号,能量状态和生长因子。据报道,mTOR失调导致癌症、糖尿病和心血管疾病(4]。此外,mTOR也参与了动脉粥样硬化斑块进展和destability [5]。一系列的临床试验表明,mTOR抑制剂雷帕霉素被用作药物洗脱支架对动脉粥样硬化的干预和预防支架内再狭窄通过抑制VSMC增殖和迁移6]。然而,对VSMC mTOR自噬的影响,衰老和扩散是复杂的。自噬体的形成需要一系列autophagy-related蛋白质(Atg)。ULK复杂组成的ULK1、Atg13和工厂检验计划200年在哺乳动物中自噬小体的最上游的因素之一。因此,我们假设一个中等剂量的雷帕霉素在VSMCs能够诱导自噬,从而抑制动脉粥样硬化斑块的进展,相关的监管mTORC1 / ULK1 / ATG13信号通路。

2。方法

2.1。动物模型

女性ApoE^−−/老鼠(8周)(Jax西方实验室、西萨克拉门托、钙、美国)第一次用一个标准实验室chow饮食一周。此后,所有的动物被随机分成三组,分配每个:(1)控制group-mice保存在一个标准实验室chow饮食(TD.88137,哈伦实验室Inc .,麦迪逊,WI) 16周;(2)高脂肪和胆固醇的饮食(HFD) group-mice与西式饮食喂养(含有15%的脂肪和0.25%胆固醇)16周;(3)低剂量的雷帕霉素group-mice与西式饮食喂养和接收低剂量的雷帕霉素(50毫克/公斤/天)16周;(4)高剂量雷帕霉素group-mice与西式饮食喂养和接收高剂量雷帕霉素(100毫克/公斤/天)16周;和(5)3-MA group-mice与西式饮食喂养和接收自噬抑制剂3-MA(100毫克/公斤/天)16周。所有动物程序进行符合中国人民解放军总医院健康指南的使用实验动物,和所有实验进行符合《赫尔辛基宣言》。

2.2。主动脉组织集合

每周小鼠的体重测量。从下腔静脉血液采集标本,和动物被安乐死了。血液离心获得血清。整个心脏和主动脉立即提取。主动脉是嵌入在最佳切削温度(10月)包埋介质(Tissue-Tek,樱花Finetek美国托兰斯,CA)组织学和免疫荧光测定。剩下的主动脉是纵向开了,和4%多聚甲醛固定脂质在血管壁的表面测量。嵌入式腹腔内保持在−20°C。

2.3。细胞培养和实验设计

鼠标主动脉平滑肌细胞系(MOVAS)从美国购买类型文化集合(写明ATCC)中心(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)。细胞培养在杜尔贝科修改鹰的介质(美国纽约DMEM, Gibco),含有5毫米葡萄糖和补充10%胎牛血清(Gibco)和1%(的边后卫)青霉素、链霉素和孵化有限公司5%₂在37°C。细胞是通过每2 - 3天,然后放入6-well板块与幻灯片4×10的密度⁵细胞/厘米²和处理通过孵化ox-LDL鲁汶(上海生物科技有限公司)(80μ72 h g / ml)。的最佳浓度和时间点ox-LDL使用自噬蛋白标记的免疫印迹分析。MOVAS细胞随机分为以下组:(1)对照组,细胞与DMEM孵化;(2)ox-LDL组,细胞使用ox-LDL (80μ72 h g / ml);(3)ox-LDL +低浓度雷帕霉素组,ox-LDL-pretreated细胞孵化与mTOR抑制剂雷帕霉素(10 ng / ml)另一个24小时;(4)ox-LDL +大剂量雷帕霉素组,ox-LDL-pretreated细胞孵化与mTOR抑制剂雷帕霉素(30 ng / ml)另一个24小时;和(5)ox-LDL + 3-MA集团ox-LDL-pretreated细胞与3-MA孵化24小时,分别。所有的数据都显示,个人实验重复三次。

2.4。蛋白质的提取和免疫印迹分析

冲洗治疗获得的总蛋白质是细胞与冰冷的磷酸盐(PBS)和溶解在裂解缓冲(10毫米三羟甲基氨基甲烷、液pH值7.4,20毫米氯化钠,5毫米MgCl2, 0.5% NP-40 PMSF和0.1毫米)。提取被12000转速离心10分钟在4°C,包含收集血清总蛋白和清晰的浮层。Bio-Rad蛋白质的蛋白质浓度测定试验(在上海蓝天生物科技公司)。20μl总蛋白(血管和细胞,分别地。)是解决在sds - page和转移到硝化纤维膜。在Tris-buffered-saline阻塞后5%脱脂奶(渐变(TBST)) 2小时,膜是孵化主要抗体:鼠标anti-rabbit mTOR单克隆抗体(细胞信号,美国),ULK1单克隆抗体(细胞信号,美国),LC3-II单克隆抗体(细胞信号,美国),Atg5单克隆抗体(德国默克密理博软木。)β肌动蛋白单克隆抗体(钟山软木,中国),一夜之间在4°C。膜与TBST洗3次孵化与相应的二次抗体紧随其后。乐队被检测到增强化学发光检测工具的使用(美国罗克福德电子热Corp .)。表达个人的蛋白质是标准化的β肌动蛋白。免疫印迹至少重复三次。

2.5。免疫荧光显微镜细胞染色

细胞被播种到幻灯片和孵化与相应的干预,然后,分别与4%多聚甲醛固定15分钟在4°C。与PBS洗涤后,细胞穿孔有1% Triton,然后用鼠标孵化anti-rabbit LC3-II抗体在一夜之间在4°C。幻灯片是用PBS洗净,然后用鼠标anti-rabbit孵化IgG-FITC-conjugated抗体在室温下2小时。细胞核被暴露于DAPI复染色(1毫克/毫升)。最后洗后,幻灯片被安装在激光扫描共焦显微镜和分析。

2.6。通过TEM分析检测自噬体

培养MOVAS细胞被固定在0.1 mol / l cacodylate-buffered钠(pH值7.4)2.5%的戊二醛溶液2 h,然后冲洗与冰冷的PBS和离心机在1000 g×5分钟在室温下,之后明确的上层清液被移除。细胞颗粒与2.5%戊二醛固定在0.1米甲次砷酸盐缓冲(pH值7.4)在4°C至少30分钟。固定后的标本被彻底洗0.1甲次砷酸盐缓冲,然后用1%的四氧化锇后缀相同的缓冲区1 h在室温下。标本在一系列分级脱水乙醇和嵌入在环氧树脂;然后,0.1μ米薄片是沾染了醋酸双氧铀及柠檬酸铅和从TEM (JEOL jem - 1230,东京,日本)。

2.7。免疫组织化学

ApoE^−−/老鼠牺牲的静脉注射过量戊巴比妥。的发生的观察腹主动脉斑块破裂和血栓形成。组织样本(2厘米)切腹主动脉和固定的4%甲醛。组织样本嵌入在石蜡与鼠标反应anti-rabbit CD68单克隆抗体(美国Dako),鼠标anti-rabbitα光滑的肌肉细胞(SMC)肌动蛋白单克隆抗体(美国σ),小天狼星红染色,油红O染色。

2.8。SA -β加染色

SA -β如前所述(执行加染色7]。短暂,细胞与PBS洗两次后用3.7%甲醛溶液固定10分钟。洗后,细胞然后用SA -孵化β半乳糖苷加染色溶液(1毫克/毫升、40 l更易与柠檬酸、5更易/ l亚铁氰化钾,5 l更易与铁氰化钾,更易与150 l氯化钠,和2更易与l氯化镁溶解在磷酸盐缓冲剂)(pH值6.0)一夜之间在37°C有限公司₂自由的气氛。衰老细胞染色是检测到传统的显微镜。衰老细胞的比值测定SA -β-gal-positive细胞总细胞计数。

2.9。统计分析

所有的值表示为±SEM手段。结果被1示例分析t以及与100 -样本未配对的学生t测试或由方差分析和多重比较Student-Newman-Keuls期末测验。显著差异时接受了。

3所示。结果

3.1。自噬激活抑制动脉粥样硬化斑块进展

他染色主动脉部分显示斑块大小的差异不显著ApoE的所有组^−−/老鼠HFD 4周(图1(一))。然而,自噬兴奋剂雷帕霉素可以显著降低斑块面积的载脂蛋白e^−−/老鼠HFD 16周,相比HFD组。自噬抑制剂3-MA能够逆转这一趋势(数据1(一)和1 (b))。此外,油红O染色整个动脉斑块面积的证明,雷帕霉素显著降低动脉粥样硬化病变的动脉,相比HFD集团()。这些影响被3-MA废除(77.3%±0.02% 3-MA组和59.3%±0.01%低拉伯集团)(数据1 (c)和1 (d))。

3.2。自噬激活促进动脉粥样硬化斑块的稳定性

动脉粥样硬化斑块形态也发生显著的变化在颈动脉组织的免疫组织化学染色法观察到从ApoE孤立^−−/老鼠(图2(一个))。进一步量化分析表明,低剂量的雷帕霉素治疗明显下降的百分比CD68表达式在整个斑块,与HFD组相比,而3-MA废除雷帕霉素的影响()(图2(c))。同样,低剂量的雷帕霉素也显著减少坏死核心区域。然而,的比例αsma和胶原蛋白分布在低剂量的雷帕霉素治疗组斑块增加明显比其他组()(数据2 (b),2 (d),2 (e))。进一步斑块稳定性分析计算胶原蛋白含量的比例和坏死核心区域显示低剂量的雷帕霉素显著增加斑块稳定,相比HFD和3-MA组()(图2 (f))。

3.3。自噬激活调节VSMC衰老和细胞周期

透射电子显微镜(TEM)和免疫组织化学结果显示,VSMCs接受低剂量的雷帕霉素等表现出的典型特征增强的自噬增加LC3 II的自噬小体的形成和表达。然而,3-MA逆转VSMCs诱导的自噬雷帕霉素(数字3(一个),3 (b),3 (c))。

在72小时post-ox-LDL曝光,VSMCs成为扩大和扁平的形态与强阳性染色senescence-associated牛乳糖(SA -β加)。低剂量的雷帕霉素治疗可以显著减少VSMCs牛乳糖的表达。然而,3-MA逆转雷帕霉素的影响()(数据4(一)和4 (b))。免疫印迹分析表明,低剂量的雷帕霉素可以显著减少衰老标记p16和p21的表达与ox-LDL集团(数字5(一个)和5 (b))。流式细胞仪数据表明,低剂量的雷帕霉素促进VSMC可行性通过促进细胞周期进程,相比ox-LDL和3-MA组()(数据4 (c),4 (d),4 (e))。

3.4。雷帕霉素调节VSMC自噬和衰老通过mTORC1 / ULK1 / ATG13信号通路

进一步调查VSMC自吞噬的可能机制和衰老,我们评估的水平autophagy-related蛋白质mTORC1 ULK1, ATG13。免疫印迹结果表明低剂量的雷帕霉素显著降低mTORC1但是增加了蛋白质的表达水平的ULK1 ATG13 VSMCs,与ox-LDL-induced集团()。与此同时,雷帕霉素减毒ULK1的磷酸化水平。此外,低剂量的雷帕霉素能抑制由灭活mTORC1 p53蛋白表达。然而,3-MA也废除了雷帕霉素对这些蛋白质表达的影响(数据5(一个)和5 (b))。

4所示。讨论

VSMCs动脉粥样化形成的基本构成。先前的研究显示VSMC增殖主要在动脉粥样硬化进展,而细胞凋亡和衰老VSMCs减少纤维帽和导致斑块不稳定。自噬,细胞代谢的主要调制器,扮演着重要的角色在细胞的增殖和凋亡的平衡。然而,不同水平的自噬对死亡的影响,生存,和相关机制仍不完全清楚。本研究调查是否适度的自噬可以抑制VSMC衰老和稳定动脉粥样硬化斑块。

我们演示了温和的自噬诱导低剂量的雷帕霉素可以抑制动脉粥样硬化进展,与自噬抑制剂3-MA。此外,组织学结果表明,低剂量的雷帕霉素降低脂质核心大小,虽然相对增加胶原蛋白和VSMC分布在先进的斑块。影响纤维帽和坏死核心被自噬抑制剂3-MA逆转。实际上,低水平的内生中可以观察到自噬菌斑HFD集团的组织;然而,它可能不足以阻止动脉粥样硬化的发展。外生自噬诱导缓解VSMC凋亡和斑块的不稳定是必要的。最近,Grootaert等人报道,自噬缺陷VSMCs的重要基因的基因删除Atg7加速postinjury neointima形成和食源性动脉粥样硬化(8]。这个结果与我们的数据在一定程度上是一致的。一些不同的缺陷和诱导自噬菌斑进展和弱点都在我们的研究调查。此外,我们还发现,高剂量的雷帕霉素没有表现出额外的保护作用在动脉粥样硬化的发展与稳定。这些推断温和自噬可能发挥更多的保护作用。

我们进一步研究了自噬对VSMCs生存的影响。在此,80年μ72 h g / ml ox-LDL-treated VSMCs是用作体外细胞模型。越来越多的证据表明,适度剂量的ox-LDL (10-40μg / ml)促进VSMC增殖,而ox-LDL更高层次(超过60μg / ml) 72小时更有可能诱导细胞凋亡(9]。我们想知道是否自噬逆转ox-LDL角色,和mTOR利用诱导自噬抑制剂雷帕霉素。流式细胞术结果显示适度的自噬显示一个保护作用的生存ox-LDL-induced VSMCs。然而,这种趋势被3-MA废除。也表明的VSMCs留在细胞周期G1期的更低剂量的雷帕霉素治疗组比其它组。它表明,适度的自噬可以被视为一个VSMC生长的有利因素。值得注意的是高剂量的雷帕霉素导致VSMC周期阻滞在G1期。这些结果与之前的研究一致,其他类型的细胞(如巨噬细胞、胰腺β细胞和神经元)也更容易injury-mediated细胞死亡有缺陷或过度自噬的条件下(10,11]。此外,先前的研究表明动脉粥样硬化进展与增加DNA损伤和衰老有关VSMCs [12]。因此,自噬的关系、生存和老化的进一步调查在我们的研究中。SA -β加染色和免疫印迹分析p21和p16也证明ox-LDL治疗显著地促进VSMC衰老。自噬抑制剂进一步加剧了ox-LDL-stimulated衰老。然而,温和低剂量的雷帕霉素诱导自噬能够减弱VSMC衰老。这是可以理解的,自噬是一个自我平衡的细胞降解回收机制受伤或不正常的细胞细胞器和蛋白质在细胞,抑制细胞衰老13,14]。

细胞衰老之间的关系、自噬和mTOR被建议在其他研究15]。mTOR是一个关键的普通细胞的细胞生长和代谢体内平衡。以前的研究报道,在哺乳动物细胞中,雷帕霉素通过别构行为机制,敏锐地禁用nutrient-sensitive mTORC1,但第二个复杂mTORC2是影响急性雷帕霉素治疗(16]。我们的机理分析表明,mTORC1可以促进使磷酸化Ser757 ULK1。当mTORC1被雷帕霉素灭活,镇压ULK1 ATG13松了一口气,它允许积极ATG1-ATG13-ATG17复杂的形成和促进自噬17]。至于VSMCs,自噬激活能够缓解衰老。此外,据报道,p53在细胞衰老和静止中扮演着重要的角色。我们证明mTORC1失活可能抑制p53和抑制VSMC衰老。这些发现表明,mTORC1 / ULK1 ATG13途径主要是参与细胞衰老和自噬。

这项研究有一些局限性。首先,一个自噬诱导物或抑制剂注入载脂蛋白e^−−/小鼠腹腔内调节自噬在动物模型。这些管理方法不能区分的雷帕霉素的作用在各种类型的病变细胞如巨噬细胞、VSMCs或内皮细胞。在未来的研究中,转基因小鼠接受Cre-LoxP选择性地摧毁autophagy-related基因的技术(例如,ATG5和ATG13)在VSMCs应该应用于研究复杂的体内自噬VSMC行为的作用。其次,和衰老之间的串扰监管autophagy-related基因需要深入调查。

总之,这项研究表明,适度的低剂量的雷帕霉素引起的自噬可以缓解动脉粥样硬化进展,促进斑块ApoE的稳定^−−/小鼠模型,它与VSMC调节自噬和衰老相关的mTORC1 / ULK1 ATG13信号通路。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Zhenli罗、Wenhuan徐和Sai马贡献同样这项工作。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(81500360号,81270168,81530058,81570272,81671731),中国国家杰出青年科学家基金(没有。81325009),中国博士后科学基金会(没有。2016 t90990),北京自然科学基金会(没有。7152131)。