文摘
在蛛网膜下腔出血性脑损伤,早期重要事件是水肿的形成由于炎症反应和血脑屏障破坏。黄芩苷、黄酮糖苷antineuroinflammatory和抗氧化性能。我们检查了黄芩苷在蛛网膜下腔出血性脑损伤的影响。蛛网膜下腔出血是通过丝穿孔诱导和黄芩苷或车辆管理手术前30分钟。大脑组织收集手术后24小时后评价神经分数。脑组织含水量处理,实时聚合酶链反应和免疫印迹分析。改善神经系统评分、脑含水量。紧密连接蛋白水平降低(occludin, claudin-5、ZO-1和胶原IV)所需的血脑屏障功能被黄芩苷恢复到正常水平。实时PCR数据表明黄芩苷衰减增加促炎细胞因子(il - 1β蛛网膜下腔出血、il - 6和CXCL-3)生产老鼠。除此之外,黄芩苷减小胶质细胞分泌il - 1β和脂多糖引起的il - 6 (100 ng / ml)剂量依赖性。最后,减毒诱导NOS-2、NOX-2在SAH老鼠mRNA和蛋白水平。因此,我们表明黄芩苷抑制小胶质细胞激活和炎症,减少氧化损伤和脑水肿。
1。介绍
住院的结果由于动脉瘤性蛛网膜下腔出血(SAH)是非常贫穷的1]。死亡率的主要原因是贫穷入院时临床分级、年龄、动脉瘤再出血,vasospasm-associated脑梗死(2]。大多数研究在SAH解决在血管痉挛由于它可以极大地阻碍血液流动,这与缺血性脑梗死(3]。预防这样的死亡率和新疗法的发展取决于SAH后了解分子事件。SAH-associated脑损伤是一个复杂的过程,涉及炎症,脑水肿,小胶质细胞的激活,氧化损伤,血脑屏障破坏(4]。每个分子事件是至关重要的,因此可以调节大脑损伤的结果。
SAH的动物模型建立,大量研究报告在老鼠5]。最近,一些植物的天然活性成分在脑损伤介导的保护SAH后报道(6- - - - - -8]。中药用于治疗各种类型的疾病了数千年。中药的有效成分之一,黄芩苷,广泛用于炎症性疾病,包括脑部炎症(9- - - - - -11]。药物动力学研究表明,黄芩苷快速吸收,再稳定的等离子体(超过12小时12,13),从而成为multitherapeutic代理(14]。
在这项研究中,我们演示了黄芩苷的脑损伤在SAH后多步机制包括小胶质细胞的激活,炎症,血脑屏障功能的调制和氧化损伤。
2。方法
2.1。动物伦理批准
本研究获得的动物保健和研究委员会贵州省人民医院。成年雄性C57BL / 6小鼠(25 - 30 g)是由贵州医科大学动物中心提供(批准文号SCXK(贵州)2002 - 0001年,贵阳,中国)。
2.2。动物手术模型
我们执行SAH模型小鼠如前所述[15]。我们观察到31%的死亡率符合公布的方法(15]。黄芩苷是手术后15分钟服用的剂量100毫克/公斤腹腔内(i.p)。Sham-operated老鼠与车辆管理(称为控制整个研究)或黄芩苷剂量100毫克/公斤腹腔内(i.p)做过相同的过程,但是没有受到穿孔。
2.3。SAH等级评估
SAH出血规模等级的灯丝蛛网膜下腔出血穿孔根据执行先前描述18-point-score方法(16]。总之,基底池分为6段和蛛网膜下腔血栓评估在这些片段分配得分从0到3。
2.4。神经功能评分
神经功能评分确定如前所述[17]。这是18加西亚规模和四点平衡梁试验和轻微的修改。六个测试,即自发活动,自发运动四肢,前爪伸展、攀爬、本体感觉,须刺激(分数3-18),并添加平衡木测试(得分0 - 4)。所有的实验都是由两个盲法研究人员。
2.5。组织收集和脑含水量(脑水肿)
深麻醉下的动物牺牲(5%异氟烷)、脑干和大脑切片,左右半球、小脑。组织后被重其次是reweighing湿条件下干燥24小时的105°C。含水量的百分比计算 如前所述(18]。
2.6。定量实时聚合酶链反应
从整个大脑组织总RNA提取(左和右大脑半球)根据制造商的协议(试剂盒RNeasy迷你包、试剂盒、希尔登,德国)。总RNA被试剂盒反向转录成cDNA逆转录工具包(试剂盒、希尔登,德国)。实时PCR进行了使用7500实时PCR系统(应用生物系统公司)与200点PCR引物。每个样本进行了分析使用SYBR绿色(应用生物系统公司)作为荧光检测器和肌动蛋白内源控制。引物都是来自RT qPCR底漆化验用品(SAB生物科学)。数据分析和使用比较Ct方法表示为褶皱。
2.7。免疫印迹
蛋白质从穿孔组织样本被孤立的赖氨酸与蛋白酶抑制剂鸡尾酒里帕缓冲区(罗氏)。蛋白质与bicinchoninic酸蛋白量化分析工具(Beyotime生物技术,中国)。等量的蛋白质被加载到页面梯度,转移到硝化纤维膜。在PBS-Tween20阻塞10%脱脂乳后,膜与抗体IBA1孵化,GAPDH, p65,组蛋白H3, NOS2, NOX2 Abcam中国,上海,中国。反复洗涤后,膜与相应的二次孵化抗体(Beyotime、上海、中国)其次是化学发光检测。
2.8。小神经胶质细胞隔离和细胞培养
小胶质细胞从灌木丛生的成年老鼠像之前描述的那样被孤立的(19]。细胞被镀到细胞培养瓶在杜尔贝科的修改鹰的中/火腿的F-12 (DMEM / F12,生活技术)有10%胎牛血清(的边后卫,生活技术)。脂多糖在100 ng / ml了24小时,和文化的上层清液量化摘要意思β和细胞因子白细胞介素6使用Quantikine酶联免疫试剂盒(美国研发系统)。细胞颗粒与阻燃剂处理核提取免疫印迹实验装备。
2.9。统计数据
所有的值表示为平均标准推导。单向方差分析之后,图基的多个对比测试是用于比较两组,和c2测试被用于行为得分分析。一个最低值< 0.05被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。改善神经系统评分、脑水肿在SAH老鼠
神经系统评分确定SAH后24小时内手术。之间没有显著差异在SAH年级SAH车辆或黄芩苷治疗组(图1(一))。然而,神经分数显著降低在SAH组相比,控制或baicalin-treated sham-operated老鼠。Baicalin-treated小鼠相比,神经评分改善vehicle-treated SAH老鼠,这是统计学意义( )(图1 (b))。脑水肿是由大脑含水量。此前报道,SAH显著增加含水量在左右半球。黄芩苷治疗降低脑含水量显著的方式在两个半球( 左边和 右)(图1 (c))。
(一)
(b)
(c)
3.2。减毒血脑屏障(BBB)通透性增加、紧密连接蛋白降解SAH老鼠
血脑屏障(BBB)函数作为其渗透率(SAH增加至关重要20.]。我们使用伊文思蓝溢出化验确定BBB通透性。SAH引起渗透率。黄芩苷治疗BBB功能恢复正常水平(图2(一个))。右半球效果显著( ),而左半球中可观察到类似的趋势。紧密连接跨膜蛋白如occludin和claudin ZO-1蛋白质有至关重要的作用在维持血脑屏障功能21]。这些蛋白质在SAH退化,从而导致渗透性增加。我们观察到蛋白质occludin的水平,减少claudin-5 ZO-1,胶原IV,长官。黄芩苷治疗恢复蛋白质含量接近正常(图2 (b))。
(一)
(b)
3.3。黄芩苷的生产在SAH小鼠炎性细胞因子和炎症
释放细胞因子il - 1β有一个关键作用在SAH的早期脑损伤的老鼠20.]。我们决定三个细胞因子,il - 1β、il - 10和CXCL-3,通过实时PCR在大脑总样本。这三种细胞因子增加SAH后24小时。黄芩苷治疗显著减毒il - 1β细胞因子il - 10, CXCL-3 mRNA水平(图3)。进一步解决,我们还研究了使用小胶质细胞的炎症标记IBA-1实时PCR(图4(一))和免疫印迹(图4 (b))。数据都符合早期发现神经胶质细胞的增加人口(炎症反应)SAH后发生脑损伤。黄芩苷衰减明显炎症反应。
(一)
(b)
3.4。黄芩苷的神经胶质细胞在体外激活
我们主要研究小胶质细胞激活的有限合伙人由黄芩苷和保护。主要与LPS刺激小胶质细胞(100 ng / ml)。预处理与黄芩苷剂量依赖性抑制促炎细胞因子的分泌il - 1β和il - 6(图5(一个))。LPS诱导核p65 NF的本地化κB在初级小胶质细胞和减毒了黄芩苷剂量依赖性的方式(图5 (b))。
(一)
(b)
3.5。黄芩苷减毒诱导NOS-2和NOX-2 SAH老鼠
神经胶质细胞的激活与NOS-2(间接宾语)和NOX-2感应(22- - - - - -24在脑损伤。这两种酶在大脑中的神经胶质细胞导致氧化损伤(25]。在SAH老鼠,NOS-2和NOX-2诱导和黄芩苷减毒诱导的酶在统计上的显著水平实时PCR(图就是明证6(一))。信使rna数据进一步证实了免疫印迹分析(图6 (b))。
(一)
(b)
4所示。讨论
我们评价黄芩苷对小鼠SAH的影响表明黄芩苷减少促炎细胞因子的生产和氧化damage-causing来源。SAH的亚型中风的死亡率是非常高的和长期的幸存者也有困难。第一个72小时是一个关键时刻所有的SAH患者。大多数临床病例是由于颅内破裂动脉瘤位于大脑动脉(26]。技术上很难产生动脉瘤动物模型研究,但先前发表的灯丝射孔方法SAH模型小鼠的标准化和可复制的方式演示(15]。我们证明了SAH分级,在所有样本数据是可再生的。然而,黄芩苷的后处理并严重影响神经系统的分数。最近报道,黄芩苷政府减少侵害体积在老鼠脑缺血模型27]。因此,黄芩苷在脑损伤的影响是有益的。
BBB通透性增加SAH后报道的患者和动物模型28]。BBB破坏的差异SAH后intraparenchymal船只有可能的病理生理的影响与脑水肿和microcirculatory骚乱发生在与SAH患者的早期临床过程(29日]。我们的数据表明黄芩苷恢复SAH-mediated BBB在右半球功能显著,和一个类似的趋势在左半球。这种效应可能是由于这一事实也调制神经胶质细胞活化、人口差异在两个半球。
炎症SAH后在脑损伤中起着至关重要的作用[30.]。提前释放炎性细胞因子也与脑水肿(31日]。在我们的研究中,我们还发现,黄芩苷减少促炎细胞因子的生产和相关的脑水肿(图7)。在小胶质细胞胶质细胞调节microcirculatory血液流动和突触可塑性32]。在小胶质细胞释放促炎细胞因子后,神经胶质细胞的激活。激活后,这些细胞迅速改变吞噬任何不必要的粒子和分泌更多的促炎细胞因子促进免疫反应(33]。我们已经表明黄芩苷可以调节小胶质细胞的激活在体外(图7)。这是一个关键的步骤包含脑损伤和氧化损伤严重的免疫反应导致水肿和更多的氧化有关神经细胞死亡。黄芩苷是有效的在许多其他炎症性疾病(34- - - - - -36]。
NF -κB是至关重要的神经胶质细胞的功能和调节许多基因,编码重要蛋白质球员参与免疫功能和炎症(37]。NF -κB在SAH的早期阶段起着至关重要的作用[38]。我们也观察到类似的模式在我们的模型中,和黄芩苷衰减过程。实验数据表明,一连串的生理事件发生后早期最初的侮辱与长官,导致长期认知赤字(39]。我们的数据表明黄芩苷的有益作用在早期损伤可以长期治疗中获益,并需要进一步的实验来评估。
NOS-2和NOX-2与蛛网膜下腔出血性脑损伤的氧化损伤40- - - - - -42]。我们观察黄芩苷的酶的诱导。NOS-2一氧化氮是一个主要的发电机,从而导致致命的过氧亚硝基激进分子(43,44]。氧化损伤负责SAH患者的不良预后。NOX-2产生超氧化物自由基,已经出现在perihematomal SAH动物的神经元和星形胶质细胞(45]。因此,我们的研究表明,baicalin-mediated减少酶在SAH减毒氧化损伤和细胞死亡(图7)。
传统草药被认为是板凳上马克多目标治疗与发展前景46]。黄芩苷,这也是许多中药的一部分,已经证明有潜在作用在许多组织损伤动物模型包括肝脏,肾脏,心脏,胰腺炎,和大脑34,47]。黄芩苷是健壮的药物动力学研究和药物开发是一个潜在的候选人14]。
5。结论
我们首先提供临床证据表明黄芩苷对蛛网膜下腔出血性脑损伤的保护。衰减的过程是通过调制介导的炎症,脑含水量,改善紧密连接蛋白,小胶质细胞的激活和氧化损伤。此外,我们表明,黄芩苷抑制lipopolysaccharide-induced主要激活的小胶质细胞。然而,未来研究的详细机制包括M1 / M2极化小胶质细胞黄芩苷可能导致潜在的新治疗的发展。
信息披露
投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。
的利益冲突
作者没有在本研究报告。
作者的贡献
陈进和郝叮负责这项研究的评价和解释。张Yongjian Fu和松松给技术支持。
确认
作者感谢实验室全体员工。本研究由科技部资助的贵州省(批准号2016 [1095])。