Demethoxycurcumin保留肾血管的功能表达下调cox - 2表达的高血压

文摘

Hypertension-associated内皮功能障碍在很大程度上是由于夸大了血管收缩剂一代cyclooxygenase-2 (cox - 2)。cox - 2诱导炎症条件下。Demethoxycurcumin (DMC)是一个重要组成部分姜黄L,具有抗炎作用。本研究旨在研究是否DMC保护高血压内皮功能的调制cox - 2。等长张力的变化表明,体内和体外治疗DMC救了减毒endothelium-dependent风头(edr)和高架endothelium-dependent收缩(edc)肾动脉的萎缩,也被卷入纠正急性使用cox - 2抑制剂塞来昔布。恢复肾血管性活动正常化DMC伴随着cox - 2的表达。增强的cox - 2表达观察肾动脉的高血压患者被孵化的抑制动脉切除与DMC 12小时。Wistar-Kyoto肾动脉的大鼠(WKY), DMC阻止内皮功能障碍引起的血管紧张素ⅱ。减少生成的一氧化氮(NO)和表达以挪士磷酸化(Ser1177)在人类脐静脉内皮细胞引起的血管紧张素ⅱ(Ang II)恢复DMC或塞来昔布。我们的研究结果表明,DMC可能减少高血压的cox - 2表达和改善血管内皮功能。

1。介绍

健康的内皮是至关重要的维持正常血管张力通过释放血管舒张药和血管收缩剂1,2]。内皮功能障碍,由于扩张、限制因素之间的不平衡,是经常遇到的常见的心血管危险因素如高血压(3]。

打扰cox - 2的新陈代谢的发展很大程度上有助于hypertension-associated内皮功能障碍通过overgeneration血管收缩剂(4]。在生理情况下,少量的cox - 2表达的血管壁。观察到显著的upregulation cox - 2在维管组织发炎,也记录在高血压(5]。实验和临床研究结果与惊人的一代COX-dependent endothelium-derived收缩因素的起始和发展在高血压内皮功能障碍。血管收缩剂和活性氧(ROS) cox - 2导致干扰产生的内皮功能障碍(6]。

动物研究提供了确凿的证据,cox - 2抑制剂可以防止心血管疾病(3]。的关键作用的逐渐认识,cox - 2在内皮功能的发病机制,以及cox - 2抑制剂的严重的副作用报道使一种新的抗炎药物的发展迫切。

植物是天然抗炎剂的主要来源。丰富的来源和潜在的安全使植物的优势在炎症因子合成化合物。许多植物提取物具有抗炎活动直接或间接。Demethoxycurcumin (DMC)是一种天然姜黄素的导数,一个主要的组成部分姜黄L(7]。姜黄素的抗炎和抗癌效果已被广泛证实,但其医疗效用是有限的,因为快速等离子体间隙。日益强大的证据有效性和高稳定性的DMC与姜黄素表明DMC有吸引力的和有前途的替代姜黄素治疗癌症和炎症反应疾病(8]。几项研究也建议DMC的抗炎作用[9]。此外,最近的一项研究显示,肺动脉高压DMC的有益作用通过抑制PDE5 [10]。然而,它仍不确定是否DMC对高血压内皮功能障碍可以提供好处,根据其抗炎作用。本研究的目的是为了测试是否DMC保护肾血管的功能,如果是这样,是否cox - 2作为下游效应器。

2。方法

2.1。动物和治疗方案

动物实验协议在本研究动物保健和使用委员会批准的东南大学,根据美国国家卫生研究院进行指导的实验室动物保健和使用。Thirty-week-old男性Wistar-Kyoto大鼠(WKY)和自发性高血压大鼠(月)实验动物提供的服务中心,东南大学。所有的动物都被安置在一个温控室(22 - 24°C) 12 h光/暗周期和提供标准饮食和水。老鼠分成以下三组:(1)WKY控制,(2)月处理车辆二甲亚砜(DMSO溶液;月+车),(3)月对待DMC在10毫克/公斤/天(月+ DMC)腹腔内注射了3周。

2.2。血压测量

血压测量使用tail-cuff electrosphygmomanometer系统(广告工具,悉尼,澳大利亚)。血压测量老鼠保持稳定和静止后执行。3读数的平均值被认为是每个动物的收缩压。

2.3。制备人类动脉

使用本研究人类肾动脉是临床研究伦理委员会批准的东南大学。从正常血压和高血压患者动脉得到与他们的同意接受根除性肾脏切除手术。肾癌患者接受根除性肾脏切除手术。高血压被定义为收缩压高于140毫米汞柱,舒张压高于90毫米汞柱。六个高血压患者的平均年龄是52年(包括51至69年)和六个血压正常的患者是55年(介于48和70年)。肾动脉高血压患者培养12小时的DMC(10的存在与否μ杜尔贝科mol / L)的修改鹰介质(美国DMEM GIBCO,马里兰州)的10%胎牛血清(青霉素、链霉素的边后卫,GIBCO)和1% (GIBCO) 37°C。

2.4。制备动物肾动脉

血压正常的WKY大鼠和月被吸入二氧化碳而牺牲。经过仔细解剖,intralobal肾动脉被安置在克雷布斯解决以下成分:(119年更易/ L)氯化钠,氯化钾的4.7,2.5 CaCl₂1 MgCl₂25 NaHCO₃1.2 KH₂阿宝₄,11 d -葡萄糖。切除后周围的结缔组织,动脉被切成4 - 6 ~ 1.6毫米长度的环段功能评估内皮功能的多肌动描记器系统(610,丹麦Myo技术/ S,奥尔胡斯N,丹麦)。短暂,动脉是固定的颚肌动描记器由两个不锈钢线,通过动脉腔。肌动描记器室挤满了5毫升克雷布斯解决方案,不断提供95% O₂和5%的公司₂并保持在pH值7.4 ~ 37°C。在受到一个最佳的静息张力2.5 mN, 60分钟以下的动脉是平衡实验。

2.5。等长张力评估

收缩后诱发1μmol / L稳定,去氧肾上腺素浓度的松弛诱导增加乙酰胆碱的浓度(每0.003 -10μmol / L)记录。Endothelium-dependent放松(EDR)描述成比例减少phenylephrine-induced收缩。endothelium-dependent收缩(EDC)测试时,动脉preincubated了-nitro-L-arginine甲酯(L-NAME, 100μmol / L)阻止血管舒张一氧化氮(NO)的影响。累积浓度的乙酰胆碱(0.03 -100μ米)被添加到触发收缩。ACh-induced肾动脉张力变化被表示为张力记录除以60更易诱发的压力/ L氯化钾。cox - 2抑制剂塞来昔布(3μmol / L),使用时,添加了前30分钟的课时。

2.6。免疫印迹分析

治疗后,肾动脉或人类脐静脉内皮细胞均质在里帕(通过传代形成细胞裂解缓冲(1μg / mL亮抑酶肽,5μ100年g / mL抑肽酶μ1 g / mL PMSF,更易与L原钒酸钠,1更易与L EGTA 1更易/ L EDTA, 1 L更易与氟化钠,2毫克/毫升β甘油磷酸盐)。匀浆被离心机20分钟后在4°C孵化在冰上。上层清液是收获和储存在−80°C。免疫印迹试验之前,蛋白质浓度测定用洛瑞法(Bio-Rad实验室、大力神、钙、美国)。等量的蛋白质样本在10% SDS-polyacrylamide凝胶电泳,然后转移到一个immobilon-P聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF)(美国微孔,Billerica的)。非特异性结合位点被5%脱脂牛奶或1%牛血清白蛋白(BSA)在0.05% Tween-20磷酸盐(PBST) 1 h,然后一夜之间探索在4°C主要抗体cox - 2, P-eNOS (Ser1177)或以挪士(Abcam、剑桥、马、美国)的稀释1:500。膜清洗三次在PBST孵化与适当的二次抗体1:3000稀释1小时在室温下。最后,膜清洗和发展与增强化学发光检测系统(ECL试剂、微孔、Billerica妈,美国)和暴露在x射线的电影。平等的蛋白质加载被确认使用管家anti-GAPDH抗体(美国Ambion、奥斯汀、TX)。

2.7。免疫荧光显微镜

cox - 2的表达变化在高血压患者肾动脉可视化DMC政府12小时后用免疫荧光显微镜。动脉是嵌入在10月化合物(樱花Finetek、荷兰),快速冻结,切成10 -μ米低温恒温器部分,然后固定在4%多聚甲醛为30分钟,在PBS和处理0.05% Triton X 1分钟。被封锁的部分有5%正常室温下驴血清1 h和孵化主要抗体cox - 2 (Abcam、剑桥、马、美国)一夜之间在4°C。在PBS几个洗后,部分被孵化与适当的Alexa萤石546免疫球蛋白(表达载体分子探针,加州,美国)在室温下1 h。盖玻片后,部分被观察到在一个奥林巴斯Fluoview FV1000共焦显微镜。图像与奥林巴斯Fluoview首次获得软件(版本1.5;FV10-ASW1.5),然后合并使用现货先进软件(版本4.6、诊断仪器、英镑高度,MI,美国)。

2.8。共焦显微镜实时在内皮细胞没有生产

HUVECs培养的内皮细胞生长培养基(Lonza、巴塞尔、瑞士),这是补充20%胎牛血清和1%青霉素和链霉素(GIBCO)。内皮细胞被镀在盖玻片。在治疗血管紧张素ⅱ(Angⅱ;1μmol / L)有或没有DMC 12小时,细胞治疗1更易与L DAF-FM二乙酸(分子探针,表达载体,卡尔斯巴德,CA),荧光探针用于检测细胞内的变化不,在室温下10分钟。然后,细胞兴奋在495 nm的发射波长515 nm,奥林巴斯共焦系统的使用(日本东京)。A23187 (1μmol / L)诱导的实时变化没有一代记录(每隔20分钟。作为钙离子载体A23187刺激以挪士的磷酸化。结果表示为一个比例的荧光强度相对于初始使用A23187前(时间0)。

2.9。化学物质

哦,去甲肾上腺素、塞来昔布和DMSO是从Sigma-Aldrich购买的。Angⅱ、洛沙坦和A23187买来Tocris生物科学(英国Avonmouth)和DMC购买成都Mansite制药公司、中国(纯度> 98%)。乙酰胆碱、去甲肾上腺素和Angⅱ是溶解在蒸馏水,和其他人在DMSO溶液的准备。

2.10。统计分析

数据表示为均值±SEM的四到六个实验。数据分析使用单向方差分析后跟Bonferroni事后测试只要适当(GraphPad软件,圣地亚哥,加利福尼亚州)。值小于0.05被接受来表示统计上显著的差异。

3所示。结果

3.1。体内治疗月DMC降低血压和改善肾血管的内皮功能恶化

月的高血压是减少与DMC 3周治疗后(10毫克/公斤/天)通过腹腔内注射(毫米汞柱治疗之前和毫米汞柱治疗后,;图1(一))。钝化ACh-induced ACh-induced收缩放松和明显观察肾动脉的vehicle-treated萎缩与血压正常的WKY控制(数字1 (b)和1 (c))。慢性DMC增强了治疗的松弛和抑制收缩。相比之下,钠nitroprusside-induced放松是高血压(图没有改变1 (d))。

3.2。体内治疗的差别与DMC纠正对这些P-eNOS (Ser1177) cox - 2的表达和Upregulation Vehicle-Treated萎缩肾动脉孤立

免疫印迹分析显示减少P-eNOS (Ser1177)表达和cox - 2的表达升高vehicle-treated高血压肾动脉的动物。观察到的变化,这些蛋白质被慢性治疗DMC(数据规范化2(一个)和2 (b))。

3.3。体外用DMC治疗提高了减毒Endothelium-Dependent放松和抑制肾动脉的收缩增强Endothelium-Dependent萎缩,通过减少cox - 2表达升高

肾动脉从萎缩引起的减毒EDR ACh(图展出3(一个))。此外,ACh诱导宫缩的一氧化氮合酶(NOS)抑制剂L-NAME,而这种收缩是小WKY大鼠的肾动脉(图3 (b))。体外接触10μmol / L DMC 12小时纠正减毒松弛和收缩升高,与类似的效果提供的急性使用cox - 2抑制剂塞来昔布(数字3(一个)和3 (b))。此外,急性治疗L-NAME废除EDR。内皮功能的改善与DMC治疗12小时之后,cox - 2表达的减少(图3 (c))。

3.4。体外治疗DMC降低cox - 2的表达升高与高血压患者肾动脉

免疫印迹测量(图4(一)(图)和免疫荧光评估4 (b))检测到的高表达cox - 2相比,高血压患者的肾动脉的血压正常的患者。增强的cox - 2表达被治疗抑郁为12小时(DMC数字4(一)和4 (b))。

3.5。体外DMC Preadministration WKY肾动脉防止Ang II-Induced肾血管的功能障碍,正常化的cox - 2表达增加

孵化与Angⅱ(100 nmol / L) 12小时导致受损ACh-induced放松和EDC增加(数据5(一个)和5 (c))。预处理与DMC和塞来昔布防止损伤在功能和废除了收缩(数字5 (b)和5 (d))。Angⅱ也促进了cox - 2的过度和cox - 2的表达升高废除了预孵化与DMC或Angⅱ1型受体阻滞剂洛沙坦(3μmol / L)(图5 (e))。

3.6。在HUVECs DMC增强一氧化氮生成

治疗和II (1μmol / L) 12小时导致减少A23187-stimulated没有生产(图6(一))。DMC,洛沙坦(3μmol / L)或塞来昔布(3μmol / L)恢复没有一代(数字6 (b)和6 (c))。同样,添加DMC、洛沙坦或塞来昔布的差别扭转了对这些P-eNOS (Ser1177)表达在细胞治疗和II(图12小时6 (d))。

4所示。讨论

尽管DMC的抗炎、抗癌活动已报告,其对血管活动的影响是未知的。我们目前的研究提供了证据显示DMC的有益作用在高血压肾血管的功能。作为一个激活站点,磷酸化网站1177年以挪士被用作标记内皮功能障碍(11,12]。我们的主要发现包括(1)腹腔内注射3周的DMC体内降低血压的萎缩。减毒功能和EDC升高肾动脉高血压动物被治疗逆转DMC 3周;(2)与血管的变化活动,减少P-eNOS (Ser1177)表达在萎缩肾动脉增加了DMC体内治疗3周;(3)免疫印迹试验和免疫荧光测量展出的upregulation cox - 2在高血压肾动脉的动物和病人,由DMC体内抑制政府12小时;(4)在肾动脉血压正常的患者,在体外用DMC治疗防止Ang II-induced upregulation cox - 2和随后的延迟肾血管的功能;(5)体外治疗DMC逆转减少生产P-eNOS (Ser1177)表达在HUVECs Angⅱ12小时。

在高血压内皮功能障碍的发生已经被很好地记录下来了。cox - 2积极负责的内皮功能障碍在高血压的情况下(6,13]。这是与血管收缩剂的过度生产和ROS源自overactivation cox - 2 (14]。这些代理打扰功能和促进收缩。的关键作用,cox - 2 upregulation在高血压内皮功能障碍的发展是越来越认可。也在这里,我们表明,很可能促炎cox - 2酶是一个主要因素在高血压内皮功能障碍,就是明证cox - 2抑制剂的保护作用和调节cox - 2的表达在萎缩。后续的观测显示DMC的有益作用的差别对内皮功能障碍,通过对这些基因的cox - 2表达。

cox - 2被描述为“诱导”由于其在炎症条件下upregulation。塞来昔布抑制cox - 2活性的逆转血管功能的衰减15,16]。除了功能研究、免疫印迹试验和免疫荧光测量证实了积极参与无序的cox - 2在高血压、肾血管的功能不仅在动物还在人类标本。相比之下,没有检测到变化COX-1表达式(数据未显示)。cox - 2的积极贡献内皮功能障碍让人们相信概念,抑制cox - 2活性,或减少其异常表达,可能是一个目标,缓解血管功能受损。这些代理的严重的副作用,由于彻底枯竭COX-derived前列腺素由于抑制cox - 2活性(17),导致退出的一个广泛使用的cox - 2抑制剂,万络,从市场,建议补救措施针对cox - 2表达的增强将会是一个更有吸引力的和有前途的选择18]。

在这项研究中,观察到,在体外用DMC 12小时规范化治疗钝化功能和增强EDC高血压,减少调节cox - 2的表达。此外,以往的研究利用癌细胞和N9小胶质细胞验证DMC 10点的安全μmol / L (19,20.]。与DMC体内治疗减少了il - 1的影响β在大脑缺血。此外,最近的证据表明,DMC作为phosphodiesterase-5抑制剂和延迟肺动脉高压的发展10]。我们的研究显示,降低血液DMC的压力效应。Kruangtip等人发现,他们表现出的直接具体的DMC在肺动脉扩张效应抑制PDE5,而灭活鸟苷一磷酸循环通过水解(cGMP)。PDE积累发展的提出了肺动脉高血压(PAH),表明潜在anti-PAH DMC的效果。

作为一个关键在高血压的发病机理,Angⅱ很大程度上有助于肾血管的功能障碍和肾脏功能障碍(21]。模仿高血压Angⅱ的循环水平增强,肾动脉受到Angⅱ挑战显示cox - 2的表达增强。受损的功能,明显EDC,和过度的cox - 2表达也cotreatment规范化的DMC。加上upregulation cox - 2,降低肾血管的功能检测,恢复暴露在DMC。这个结果强化了DMC的有益作用在高血压的血管功能。进一步的实验使用HUVECs还显示,DMC规范化的减少没有和P-eNOS表达Ang II-treated细胞。

内皮功能障碍被认为是血管疾病的早期特征。内皮功能的评估是至关重要的在血管疾病治疗效果的评价2,22]。值得注意的是,内皮功能障碍是重要的用于预测心血管事件由于其更严重的心血管事件的优先级(23]。因此,目前的研究提供了确凿的证据有关的好处DMC对肾血管的功能障碍。关于抑制cox - 2表达的影响在萎缩肾动脉,DMC的影响可能源自抑制NF -κB,其次表达下调cox - 2的表达。本研究的一个限制是DMC调节cox - 2表达和DMC的影响是否存在剂量依赖的相关性。

5。结论

总之,本研究首次证明cox - 2至少是保护下游效应器的DMC在高血压肾血管的功能。此外,这些发现提供建设性的证据DMC治疗应用的发展。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作得到了江苏省自然科学基金[BK20141345]。

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