文摘
在红细胞中,氧化还原敏感的酪氨酸磷酸化调节带3和其功能仍部分定义。乐队3氧化的作用调节自身磷酸化之前一直建议。目前的研究提供了证据支持这一假设:(i)在完整的红细胞,在2毫米的谷胱甘肽浓度,乐队3氧化和磷酸化,麦克米兰膜易位,麦克米兰磷酸化反应相同的微摩尔的氧化剂浓度显示相同的时态变化;(2)乐队3中的半胱氨酸残基位于胞质域是20倍比谷胱甘肽活性;(3)二硫化与乐队3胞质域码头麦克米兰激酶;(iv)蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制在氧化剂浓度不足导致大量乐队3氧化和磷酸化。我们还观察到hemichromes绑定乐队3确定其不可逆的氧化和磷酸化,进步的溶血,丝氨酸hyperphosphorylation不同的细胞骨架蛋白。麦克米兰的磷酸化抑制剂抑制带3也防止丝氨酸磷酸化变化和溶血。我们的数据表明,带3作为氧化还原传感器调节自己的磷酸化和hemichromes导致乐队3的旷日持久的磷酸化可能引发一连串的事件最终导致溶血。
1。介绍
由于其功能携带氧气和铁含量高,红细胞(红血球)不断暴露于氧化应激1]。此外,红细胞表面可能是暂时性的经历氧化应激时暴露在ROS穿越炎性组织或与氧化剂药物或食物中包含的交互2- - - - - -4]。此外,一些溶血性疾病也损害红细胞膜增加自由基的生产来自变性血红蛋白种类(hemichromes),总是出现在地中海贫血,镰状细胞病(5- - - - - -7]或与降低红细胞表面的能力来处理细胞外氧化剂如G6PD缺乏症(8]。
值得注意的是大约7%的世界人口受到那些选择了疟疾的突变。
众所周知,红血球对氧化应激的代谢反应完成最大化生产NADPH和重新生成商店的谷胱甘肽和硫氧还蛋白。红细胞表面平行,也通过激活酪氨酸激酶反应确定乐队的酪氨酸磷酸化(酪氨酸)3,最丰富的红细胞膜蛋白和细胞骨架之间的主要联系和脂质双分子层(9- - - - - -12]。在红细胞表面,hyperphosphorylation乐队3不断报道在所有prooxidant溶血性疾病(13- - - - - -15和疟疾16,17),但导致其磷酸化及其病理生理意义的机制已经部分定义。我们最近称,乐队3磷酸化似乎增加了中间地中海贫血(18),这一现象是hemichromes的形成密切相关。乐队3磷酸化和hemichromes形成还描述了在疟疾感染红细胞(19]。在病理情况下,乐队3磷酸化发挥宽容的作用出现在膜微粒子的释放。似乎仍不足以解释当前知识分子的基本机制的细节,尽管最近的一些发现标明的角色带3磷酸化调节新陈代谢由绑定的缺氧血红蛋白(Hb) [20.- - - - - -22)之间的亲和力和修改带3和锚蛋白后氧化应激(23]。
带3的氧化还原调控酪氨酸磷酸化显然涉及不同的组件。在以前的报告中,它已经表明,氧化带3是有选择地磷酸化(9]。林恩负责359年酪氨酸磷酸化和麦克米兰负责8和酪氨酸磷酸化的酪氨酸(21日24- - - - - -26]。有趣的是,所有这些残留物位于胞质域的乐队3。
磷酸酶(中)也被卷入带3的磷酸化,氧化应激(27- - - - - -29日)和抑制中,是由于抑制半胱氨酸残基出现在一些中,但反应的催化部位H2O2抑制半胱氨酸的0.005倍低于谷胱甘肽,表明,在其正常浓度,谷胱甘肽应该非常有效地保护中,从氧化抑制30.,31日]。额外的监管组件也可以参与乐队3磷酸化:林恩激酶被描述作为氧化还原传感器(32];林恩激活麦克米兰的角色在不同的细胞类型和麦克米兰自身磷酸化仍有待阐明(25,26]。此外,所有这些规定主要研究免疫细胞和红细胞表面很少的信息是可用的。
在本报告中,我们进行了一系列的实验来获得更多信息的机制参与乐队3的酪氨酸磷酸化后可逆的氧化膜蛋白由肼和H2O2和hemichromes造成不可逆的氧化。
2。材料和方法
2.1。治疗红细胞
静脉血是来自健康的志愿者知情同意和颗粒状后在室温下1000克10分钟。后的淡黄色的外套,红细胞表面被颗粒状和洗3次磷酸缓冲盐(127毫米氯化钠,氯化钾2.7毫米,8.1毫米Na2HPO4,1.5毫米KH2阿宝4MgCl,消息灵通的20毫米,1毫米2在5毫米,pH值7.4)葡萄糖(PBS的葡萄糖)获得了细胞。红血球暂停在PBS血球容积计20%葡萄糖和孵化37°C 0.5毫米二酰胺在不同培养时间(0,30、60、120、240和360分钟),然后在不同的肼浓度。独立的实验也在5毫米H2O2或1毫米苯肼(PHZ)。pH值测量180分钟后,与氢氧化钠调整到7.4。必要时为了避免酪氨酸磷酸化,红细胞表面使用10μM麦克米兰抑制剂二世(美国Calbiochem), 1小时在37°C在黑暗中,氧化剂治疗前。所有协议,未经处理的控制处理相同,除了从孵化抑制剂被省略。防止进一步的磷酸化乐队3,孵化后我们洗冷缓冲和膜的细胞都被立即准备。
2.2。红细胞膜的准备
膜蛋白是准备在4°C冰如前所述[9]。简单地说,150年μL包装红血球被稀释到1.5毫升的冷溶血缓冲区(HB)(5毫米磷酸钠,1毫米EDTA, pH值8)含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒,然后洗4次在同一个缓冲区(直到膜成为白色)冷藏埃普多夫microfuge 25000 g。准备存储冻结在−80°C到使用。使用CD蛋白膜蛋白质含量是量化分析(Bio-Rad)。
2.3。sds - page
进行一维电泳,膜蛋白可溶性Laemmli缓冲区(33在体积比为1:1。10µ为分析凝胶,1克蛋白质µanti-band 3克蛋白质,30岁µg蛋白质anti-phosphotyrosine、anti-phosphoserine anti-Syk抗体是免疫印迹分析和加载下8%的聚丙烯酰胺凝胶上分离减少和nonreducing条件。sds - page分析是由加热样品5分钟在95°C和运行在Bio-Rad mini-protean 3设置。
2.4。免疫印迹分析
蛋白质sds - page分离的转移到硝化纤维素膜(如前所述)(16然后用5种不同的抗体探测:单克隆抗体anti-band 3 (B9277 Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)生产的鼠标(针对cdbd3)稀释1:50000;anti-phosphotyrosine (sc7020,圣克鲁斯,CA);anti-phosphoserine (ab9332 Abcam,剑桥,英国);多克隆anti-band 3 (sc20657);和anti-Syk (sc28337)。生产的最后两只兔子从圣克鲁斯,CA,所有被稀释1:2000。二次抗体结合红外荧光染料易激动的在680 nm和800 nm (IRDye: 800年anti-mouse CW 926 - 32210, 680年anti-mouse CW 926 - 32220年和800年anti-rabbit CW 926 - 32211, Li-COR,美国)被用于可视化所需的抗原与激光扫描仪(美国Licor奥德赛)。定量测密度术研究酪氨酸磷酸化,麦克米兰易位和乐队3氧化水平测量免疫印迹分析图像的奥德赛V3.0软件,和值被表示为任意单位。
2.5。测量带3 SH-Groups反应增加谷胱甘肽浓度的存在
红细胞细胞膜被稀释在HB获得5µM带3浓度。乐队3浓度估计测量总膜蛋白在膜包装(大约4毫克/毫升)考虑到乐队3代表大约25%的总膜蛋白和一个乐队3分子量95.000哒。Resuspended膜孵化10分钟在冰,与0.1毫米肼的谷胱甘肽的浓度增加。的反应是停止清洗解决方案与HB 3倍。氧化带3的比例是由免疫印迹后评估nonreducing 8% sds - page和百分数表示的最大氧化以缺乏谷胱甘肽。缺乏谷胱甘肽的平均95.2±4.5%的乐队3被发现存在于可约聚合物分子量> 200.000 KDa。
2.6。PTP活动的测量
红细胞PTP活动测量使用磷酸化乐队3作为衬底。磷酸化乐队3与1毫米肼红细胞表面获得治疗。膜是准备和孵化10分钟37°C细胞质分数的红细胞表面处理不同浓度的二酰胺。10μM麦克米兰抑制剂二世(美国Calbiochem)是防止进一步的磷酸化乐队3。带3的速度表示为PTP活动脱磷酸化的比例在红细胞表面未经处理的最大活动。
2.7。血红蛋白释放量化
我们使用一个简化的方法来测量Hb在加拿大皇家银行文化上层清液的相对变化;丢弃后红细胞细胞膜通过离心、裂解是量化通过测量红细胞血红蛋白吸光度在405海里浮在表面的,并表示在nmol /毫升(34]。
2.8。Hemichrome测量
红血球在HB可溶性含1% Triton x - 100离心机在15.000 g在4°C。高分子量hemichrome骨料分离与上层清液琼脂糖CL-6B微柱凝集。hemichrome分数被稀释和量化测量血红素吸光度在560、577和630海里(35),表示为nmol /毫升的可溶性膜。
2.9。免疫沉淀反应的研究
红细胞膜蛋白的存在或缺乏治疗2毫米肼,随着10分钟与1%的3卷在冰上Triton x - 100 HB。离心后冷藏埃普多夫microfuge重15000克,上层的收集和孵化anti-mouse anti-band 3交联蛋白A-Sepharose(1: 10)通过双功能耦合剂二甲基pimelimidate 2小时在4°C下温和的混合。珠子被洗了三次Triton x - 100 HB (1%9]。Laemmli缓冲区,含有2%德勤(最终浓度),加入了珠子(2卷)和免疫沉淀反应蛋白质被免疫印迹分析使用anti-band 3和anti-Syk抗体。
2.10。胞质域乐队3片段重组系统的磷酸化
获得的氧化和nonoxidized cdbd3片段,红血球被孵化有或没有肼(2毫米)。准备如上所述膜和细胞骨架蛋白被淘汰孵化的膜0.1 M氢氧化钠在4°C(剥膜)。Cdbd3当时纯化从红细胞膜如前所述36]。cdbd3的纯度高于90%。二酰胺治疗后60%以上的cdbd3在场二硫交联二聚体。测量带3在可溶性氧化和磷酸化nonoxidized cdbd3,红细胞细胞膜被孵化与红细胞胞浆37°C 10分钟(稀释1:10)如前所述9]。反应停止了与HB洗膜。当时乐队3酪氨酸磷酸化来衡量西方墨点法如上所述。麦克米兰和cdbd3之间的关系进行了测试孵化氧化和nonoxidized cdbd3红细胞胞浆在37°C 10分钟和anti-band 3免疫沉淀反应后通过免疫印迹使用anti-Syk抗体稀释1:100。
2.11。肽为女士分析做准备
乐队从电泳凝胶被切除,通过做一些洗5毫米NH使退色4HCO3/ ACN(乙腈)(50/50 v / v)和纯ACN先后干。凝胶片在4°C患者45分钟20μ5毫米NH的L4HCO3包含10 ng /消化缓冲区μ胰蛋白酶的L。蛋白酶解被过剩和体积与5毫米NH调整4HCO3这种凝胶片。消化在一夜之间被允许继续在37°C。
2.12。女士MALDI-TOF肽质量指纹图谱
样品被加载到MALDI目标使用1μL的胰蛋白酶的消化混合1:1的解决方案CHCA (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic酸)(10毫克/毫升在ACN /组织0.1%,40/60)。MS分析肽从1-DE凝胶乐队进行MALDI-TOF微MX (Micromass,曼彻斯特,英国)根据制造商建议的优化过程。峰值与Proteinlynx列表生成数据准备使用以下参数:外部校准的锁质量使用质量2465.1989 Da ACTH片段18-39背景是减去使用自适应模式,执行deisotoping阈值的3%。光谱女士被转换成使用质量猞猁pkl文件4.0。峰列表包含光谱的20个最强烈的山峰被送到吉祥物及搜索(http://www.matrixscience.com/)使用Swiss-Prot数据库(50.0版,2006年5月30日)。搜索设置允许一个错过了乳沟的胰蛋白酶酶被选中,羧甲基化半胱氨酸作为固定蛋氨酸作为潜在变量的修改和氧化改性和肽宽容50 ppm。只有蛋白质识别重要的吉祥物的评分()被考虑。
3所示。结果
3.1。酪氨酸、丝氨酸Phosphorylative应对不同氧化剂的物种
与时间有关的phosphorylative变化测量红细胞膜蛋白的比较(i)二酰胺的影响,单个电子氧化剂,二硫化诱导形成9,26),(2)过氧化氢(H2O2期间),生理上产生超氧化物阴离子高铁血红蛋白形成和变性血红蛋白产品(37),(3)苯肼(PHZ)与血红蛋白决定的形成反应特别hemichromes能够触发ROS生产(38,39]。
二酰胺引起了强烈而又短暂的酪氨酸磷酸化蛋白质带3和4.1和4.2但程度和Ser磷酸化附加膜蛋白(数据的变化1(一),1 (b),2和表1)。H2O2诱导磷酸化反应相同的二酰胺,但高10倍浓度(数据未显示)。这是合理的因为强有力的红细胞表面清除过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶活性在H2O2。
(一)
(b)
(c)
(d)
(一)
(b)
相反PHZ导致磷酸化反应迟缓,可衡量的孵化后60分钟(数字1 (c)和1 (d))。酪氨酸的磷酸化乐队3是最早的事件,但额外的蛋白质也在酪氨酸磷酸化和Ser 120 - 360分钟的孵化后残留物。这些数据也支持的缺乏反应性蛋白质治疗时λ磷酸酶,用于去除玷污磷酸基蛋白质(数据未显示)。控制实验排除直接氧化剂PHZ效果(2毫米)隔离膜并没有发现影响乐队3巯基组(数据未显示)。缺乏短期PHZ对膜蛋白磷酸化的影响是一致的与血红蛋白的具体行动缓慢的形成hemichromes [38,39]。磷酸化蛋白质的列表,通过质谱识别,如图2和表1。至少一个磷酸化网站已被确定在每个磷蛋白质除蛋白质4.2。应该注意到类似的蛋白质磷酸化模式曾被观察到在病理情况下表现为高含量等hemicromes疟疾感染的红细胞表面,G6PD缺乏症,和地中海贫血16,18]。
3.2。乐队三氧化功能之间的关系及其酪氨酸磷酸化
获得定量数据之间的关系intercurring乐队3氧化及其酪氨酸磷酸化,我们进行了平行测量的检测限制乐队3磷酸化(图3(一个))及其氧化交联(图3 (b))从二酰胺的浓度很低。这个实验表明,这两个事件成为衡量肼浓度(汽车销售μ米),由于细胞谷胱甘肽的缓冲效果,预计不会施加影响蛋白质硫醇。我们观察到剂量依赖性增加磷酸化信号(图3 (c))和绑定的麦克米兰膜(图3 (d))。有趣的是两种现象成为检测在同一个肼的浓度范围。综合这些数据表明,正如前面建议(9),麦克米兰徒优先氧化带3。为了进一步调查这一假设,我们测试了如果纯化氧化cdbd3片段可能产生竞争性抑制作用的磷酸化乐队3。图4(一)表明氧化cdbd3乐队3磷酸化产生剂量依赖性抑制作用,而nonoxidized cdbd3片段没有施加任何可衡量的效果。红细胞细胞膜含有氧化带3被用作中衬底;相反,乐队演奏与纯化实验3提供unreproducible结果可能表明一个特定的要求四级结构的氧化带3允许麦克米兰的对接是至关重要的。免疫沉淀反应的研究证实,麦克米兰普遍地绑定到的氧化形式cdbd3(高5.8倍,),而没有观察到显著差异之间的cdbd3免疫沉淀物氧化和nonoxidized样品(图4 (b))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(一)
(b)
3.3。测量的可访问性带3个半胱氨酸残基
易访问性特征的201年和317年两个cysteins位于胞质域乐队3已经证明(36]。获得定量数据的相对可访问性的半胱氨酸残基,我们测量的影响二酰胺(100μ组建乐队3(5米)μ米)分子间二硫键在谷胱甘肽浓度增加。这个实验表明,在0.1毫米谷胱甘肽浓度(20倍高于乐队3)大约40%的乐队3还是氧化肼;在1毫米谷胱甘肽浓度(200倍高于乐队3)大约20%的乐队3还是氧化(图6(一)),表明更高的可访问性的半胱氨酸残基位于cdbd3谷胱甘肽。因此这些结果与观察到的氧化带3肼浓度较低的血药浓度的谷胱甘肽是大约1毫米。此外,我们注意到,在低浓度的二酰胺(50 - 100μ米)没有检测谷胱甘肽氧化(数据没有显示)。
3.4。麦克米兰激酶和蛋白质酪氨酸磷酸酶活动的比较分析之后巯基氧化
红细胞中已经涉及促进酪氨酸磷酸化的乐队3由于一个抑制半胱氨酸残基位于他们的催化域10,40]。
排除二酰胺治疗的可能性,在浓度诱导乐队3磷酸化,也可能决定大幅抑制中,我们乐队的水平相比3磷酸化和PTP抑制在不同肼浓度。图6 (b)红细胞表面显示,治疗后与1毫米肼导致近最大乐队3磷酸化,中仍然显示大约70%的最大的活动。这一发现与低反应性的监管协议的半胱氨酸残基中,之前已经报道过了30.]。
3.5。麦克米兰抑制剂对细胞膜的影响不稳定引起苯肼
不同于二酰胺的影响导致可逆变化,苯肼治疗后,乐队3氧化和磷酸化,麦克米兰易位膜及其磷酸化逐步增加,并联代hemichromes(图5)。也在这种情况下,麦克米兰抑制剂显著抑制带3对乐队3氧化磷酸化作用没有明显影响,麦克米兰易位(数字3和5)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
(一)
(b)
有趣的是,图5 (f)表明苯肼治疗导致进步泄漏血红蛋白的膜。溶血大大抑制了麦克米兰抑制剂表明不可逆转的乐队3磷酸化可能诱发累进膜的不稳定可信的弱化带3和细胞骨架之间的联系(23]。
4所示。讨论
红细胞表面迅速通过氧化应激反应非常强烈的酪氨酸磷酸化的乐队3,膜蛋白主要积分。我们之前发现乐队3的磷酸化影响与细胞骨架的相互作用诱导膜不稳定(23]。这种现象出现在发布版本中发挥核心作用的膜微粒子包含hemichromes thalassemic红细胞和似乎是参与一些prooxidant抗疟化合物的作用机理(18,41]。变性血红蛋白产品(hemichromes)在衰老红细胞生成大量溶血性疾病(42和疟疾16]。它们绑定到cdbd3并释放铁膜生成自由基物种。因此,hemichromes似乎是一个明智的的氧化还原压力在生理条件下和来源prooxidant病理条件。cdbd3的晶体结构表明严格二聚体形成的联锁二聚作用的两个单体。半胱氨酸201残留在317年一个亚基,半胱氨酸残双亚基的近距离,很容易形成分子间二硫键后温和氧化应激(36,43和hemichromes绑定后18,35]。没有数据结构变化引起的这一修改,但先前的发现证明了可访问性的增加细胞外乐队3抗原表位后,暴露在非常低浓度的氧化剂和衰老红细胞(44- - - - - -46),这表明二硫交联后可能发生构象改变乐队3。
总之,麦克米兰激酶的参与乐队3氧化和所有主要步骤的氧化还原传感机制等途径,其转导,麦克米兰激活的规定,和对接带3需要澄清设想的生理作用强烈的红细胞氧化还原响应特性。为了解决这些问题,目前的工作已经获得一系列量化的数据来研究(i)的时间和剂量效应不同的生理和nonphysiological氧化剂在诱发最小乐队3和麦克米兰修改,(ii)二硫交联的作用带3对接麦克米兰(iii)的缓冲效果的谷胱甘肽氧化带3个半胱氨酸残基排除如果乐队3可以显示活动作为完整红细胞氧化还原传感器,及(iv)的相对角色麦克米兰激活和对接与中抑制磷酸化的乐队3。
显示结果表明,带3具有高活性的半胱氨酸残基容易氧化的谷胱甘肽的生理浓度和二硫交联的乐队3码头麦克米兰和作为乐队的竞争性抑制剂3磷酸化。这些结果支持在整个红细胞表面观察到的变化与特定的巯基试剂的浓度非常低(肼)或后微量hemichromes的形成。在两种模型带3磷酸化其氧化完全相似。另一方面红细胞似乎相当保护,H2O2。乐队3磷酸化和的比较测量中,抑制在不同浓度的二酰胺显示强烈的磷酸化可以发生在浓度最低限度抑制红细胞中,作用于phospho-band 3。这一发现是按照相对较低反应性的半胱氨酸残基的催化部位位于中(30.)和更高的反应性的半胱氨酸残基位于cdbd3。
在本报告中,我们观察到,麦克米兰抑制剂是强有力的抑制剂的溶血遵循hemichromes的生成。考虑到治疗与肼或H2O2导致一个短暂的磷酸化乐队3不会引起溶血,持久乐队3引起的不可逆的磷酸化hemichromes显然会导致严重的膜不稳定。无论如何它应该注意到hemichromes形成也伴随着丝氨酸phosphorylative变化涉及一些膜蛋白;那些磷酸化变化通常被认为是导致减少一些组件之间的亲和力的红细胞膜交界复合物(47- - - - - -50),可能会因此导致膜结构的改变。
考虑到乐队3磷酸化可能有一个功能重塑红细胞膜删除有害hemichromes [18),目前的发现支持了假设红细胞可能拥有一个非常直接和有效的机制来氧化应激产生的少量hemichromes通过乐队3氧化,麦克米兰的选择性对接,和两个乐队3酪氨酸残基磷酸化保证膜的局部稳定性的关键。
缩写
| ROS: | 活性氧 |
| 谷胱甘肽: | 谷胱甘肽 |
| G6PD: | 葡萄糖6磷酸脱氢酶 |
| ptk: | 蛋白质酪氨酸激酶 |
| 中: | 蛋白质酪氨酸磷酸酶 |
| cdbd3: | 胞质域的乐队3。 |
利益冲突
作者声明没有竞争的经济利益。
承认
本研究从基金会赠款支持银行di萨丁岛港。753/2012 - 0300。