牛至精油诱发SOD1和谷胱甘肽表达通过Nrf2激活和减轻氢Peroxide-Induced IPEC-J2细胞氧化损伤

文摘

牛至精油(OEO)长期以来一直用于提高动物的健康,尤其是他们的肠道健康。OEO的健康福利通常归因于抗氧化行为,但机制尚不清楚。在这里,我们调查OEO的抗氧化作用和其内在的分子机制在猪小肠上皮细胞(IPEC-J2)。我们发现OEO治疗前过氧化氢(H₂O₂)暴露增加细胞生存能力和防止乳酸脱氢酶(LDH)释放到媒介。H₂O₂全身的活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)被OEO显著抑制。OEO剂量依赖性增加mRNA和蛋白水平的核factor-erythroid两个相关因子2 (Nrf2)目标基因铜/ Zn-superoxide歧化酶(SOD1)和g-glutamylcysteine连接酶(应用灰度共生矩阵建立GCLC,),以及细胞内的浓度SOD1,谷胱甘肽。Nrf2 OEO也增加了在细胞核内的表达式和抗氧化反应的活性元素记者质粒在IPEC-J2细胞。OEO-induced Nrf2-regulated基因的表达和增加SOD1 IPEC-J2细胞谷胱甘肽浓度减少Nrf2小干扰rna (si),抵消OEO对抗氧化应激的保护作用IPEC-J2细胞。我们的研究结果表明,OEO防止H₂O₂全身IPEC-J2细胞损伤诱导Nrf2和相关的抗氧化酶。

1。介绍

氧化应激是公认的状态失衡prooxidants和抗氧化剂。过度生产活性氧(ROS)和/或缺乏导致内源性抗氧化剂氧化应激(1]。各种胃肠疾病的发病机制,如消化性溃疡、胃肠道癌症、炎症性肠病,包括氧化应激(2]。牛至(牛至属植物vulgarel .)是一种芳香植物广泛分布在整个地中海地区和亚洲(3]。牛至精油(OEO)、挥发性油,是一种浓缩的天然植物产品包含挥发性芳香化合物。这种混合挥发性芳香化合物有几个生物的行为,包括抗菌、抗炎和抗氧化活动(4]。在最近的研究中,OEO已经证明具有抗氧化活性,防止氧化诱导肠道损伤动物(5- - - - - -7]。这些研究还表明,OEO抑制氧化应激诱导抗氧化酶,除了清除自由基。这些研究还暗示OEO抑制氧化应激诱导抗氧化酶,除了自由基清除效果。然而,OEO的诱导抗氧化酶和肠道的潜在机制还没有被报道。

核factor-erythroid两个相关因子2 (Nrf2)是一个转录因子在细胞抵抗氧化中起着重要的作用并通过及时的亲电侮辱诱导抗氧化酶和相关蛋白(8]。在正常情况下,Nrf2必将Kelch-like ECH-associated蛋白1 (Keap1)和ubiquitinated和针对退化(9]。剪切应力、膳食抗氧化剂和其他生理刺激,破坏Keap1-Nrf2交互允许核Nrf2积累,导致转录等抗氧化酶g-glutamyl半胱氨酸连接酶(GCL)和铜/ Zn-superoxide歧化酶(SOD1) [10- - - - - -12]。GCL是一个异质二聚体组成的催化(GCLC)和修饰符(GCLM)子单元,这两个是Nrf2目标基因的产物。GCL已经广泛地调查其调节能力的合成谷胱甘肽(谷胱甘肽),最丰富的天然植物细胞抗氧化剂,它在维持细胞氧化还原状态中扮演着重要的角色(13]。SOD的防御机制中起着重要作用的生物细胞暴露于氧(14),催化过氧化阴离子自由基的歧化作用()到一个氧分子和过氧化氢(H₂O₂)[15]。这个反应被认为是一种抗氧化剂系统,保护细胞免受超氧化物的毒性。铜/ Zn-SOD (SOD1)存在于细胞质中,溶酶体和核隔间的哺乳动物细胞(16]。

OEO已被证明在体内抗氧化性能的研究,但其抗氧化作用还不是很清楚。本研究的目的是探讨氧化损伤的影响₂O₂猪小肠上皮细胞的增长(IPEC-J2)细胞在体外,确定OEO具有抗氧化作用(氧化应激期间恢复细胞氧化还原状态)在IPEC-J2细胞,,如果OEO有抗氧化作用,阐明潜在的分子机制。

2。材料和方法

2.1。化学品和评议

杜尔贝科的修改鹰介质(DMEM)和胎牛血清(的边后卫)从GIBCO BRL购买(美国纽约大岛)。OEO获得Meritech生物工程有限公司(广州),和它的组成如表所示1。牛至精油的典型色谱显示在网上补充材料http://dx.doi.org/10.1155/2016/5987183。H₂O₂解决方案,3 - (4 5-dimethyl-2-thiazolyl) 2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium溴化(MTT), 2 - (4-amidinophenyl) 6-indolecarbamidine盐酸盐(DAPI),和2′,7′-dichlorofluorescein-diacetate (DCFH₂- da)获得Sigma-Aldrich(圣路易斯,密苏里州,美国)。抗体Nrf2 Keap1,β肌动蛋白从细胞信号技术(美国贝弗利,MA)。GCLM抗体,γ-GCLC, SOD1获得亲和力生物科学(美国哥伦布,哦)。抗体对细胞增殖核抗原(PCNA)是获得BD转导实验室(美国圣地亚哥,CA)。HRP-conjugated二级抗体,anti-rabbit免疫球蛋白和anti-mouse免疫球蛋白,是购自杰克逊ImmunoResearch(西树林,宾夕法尼亚州,美国)。IPEC-J2细胞从细胞获得银行文化的集合类型的中国科学院研究所(中国科学院)和培养37°C的5%的股份有限公司₂气氛DMEM包含10%的边后卫。OEO是溶解在血清中实现最终所需的浓度。

2.2。MTT试验

细胞生存能力监控使用MTT比色测定。IPEC-J2细胞(2×10⁴每口井的96孔板)是有或没有OEO孵化和H₂O₂。细胞被洗与磷酸盐(PBS)然后孵化10μL(5毫克/毫升MTT在PBS 4 h。上层清液被除去,与150年resuspended文化μL(异丙醇溶解MTT甲瓒。使用分光光度计吸光度测量在490 nm (Biomate 5,热电子公司,罗切斯特,纽约,美国)。OEO的影响和H₂O₂对细胞生存能力评估是可行的细胞的百分比与vehicle-treated控制细胞相比,任意分配100%的可行性。

2.3。乳酸脱氢酶(LDH)释放试验

LDH释放到培养基的活动通过破坏细胞膜spectrophotometrically使用LDH测定细胞毒性试验设备(南京建成生物工程研究所、南京、中国)根据制造商的协议。该方法是基于LDH-catalyzed丙酮酸还原成乳酸NADH的克分子数相等的金额。NADH形成是被释放的发色体排放在490海里。IPEC-J2细胞(2×10⁴每口井的96孔板)是用不同浓度的预处理OEO然后暴露于H₂O₂。吸光度测量的ELISA酶标读者,和任何减少吸光度是监控。

2.4。测量ROS生成

细胞内活性氧的积累是检测到使用DCFH荧光显微镜₂- da。IPEC-J2细胞(1×10⁵细胞/在6-well板)与10%的边后卫在DMEM培养补充;培养基是新的融合当细胞达到80%。融合OEO预处理后(90%)和H₂O₂孵化、细胞培养基被移除和细胞用PBS和孵化10μM DCFH₂- da在新鲜培养基为30分钟37°C。DCFH乙酸组₂- da细胞内酯酶被移除,捕获IPEC-J2细胞内部调查。细胞内ROS,根据DCF荧光显示,用荧光显微镜测量(ECLIOSE Ti、尼康、日本)。每个条件下的荧光强度是量化FACSCalibur流式细胞分析仪(美国BD生物科学,圣地亚哥,CA)使用488和530海里的激发和发射过滤器,分别。ROS水平测量IPEC-J2上层清液的细胞通过使用鲁米诺化学发光测定(5-amino-2、3-dihydro-1 4-phthalazinedione,σ,圣路易斯,密苏里州,美国)如我们之前所述研究[17]。结果表示为相对光单位(RLU)。

2.5。脂质过氧化反应的评估

IPEC-J2细胞(1×10⁵每口井6-well板)是有或没有OEO孵化和H₂O₂。IPEC-J2细胞中丙二醛(MDA)的含量是化验使用比色方法与分光光度计(Biomate 5)。进行了化验,试剂盒购自南京建成生物工程研究所根据制造商的指示。IPEC-J2细胞被洗两次冷PBS和收获5%使用细胞刮刀偏磷酸。冰收获细胞被声波降解法细胞溶解,离心液的上层清液在4°C g(1300×15分钟)收集。样本涡与十二烷基硫酸钠8.1%,20%乙酸,和0.8% 2-thiobarbituric酸和孵化1 h在95°C butanol-pyridine 15: 1 (v / v)补充道。混合物动摇了10分钟,然后离心机(1300×g在4°C)。butanol-pyridine层测量fluorometrically 552海里。

2.6。定量聚合酶链反应

IPEC-J2细胞(5×10⁴每在24-well板)是有或没有OEO孵化。细胞总RNA提取的样本IPEC-J2使用试剂盒试剂(美国表达载体,卡尔斯巴德,CA)根据制造商的指示。总RNA决心使用NanoDrop®nd - 1000分光光度计(NanoDrop技术,威明顿、德、美国)。互补脱氧核糖核酸的合成,2.5μg的RNA reverse-transcribed RT试剂配套使用的脚本(豆类,大津,日本)根据制造商的协议。在这项研究中,使用的引物合成根据我们之前的协议或根据猪的基因序列设计引物5.0,如下:Nrf2 5′-GAAAGCCCAGTCTTCATTGC-3′(感觉),5′-TTGGAACCGTGCTAGTCTCA-3′(反义);SOD1 5′-ACCTGG-GCAATGTG-ACTG-3′(感觉),5′-TCCAGCATTTCCCGTCT-3′(反义);猫5′-AACTGTCCCTTCCGTGCTA-3′(感觉),5′-CCTGGGTGACATTATC-TTCG-3′(反义);GCLC 5′-CATTGCGACACACTGGAGAC-3′(感觉),5′-CAAACCA-TCCTACCCTTTGG-3′(反义);GCLM 5′-ATTGTGCAGAGAGCCTGGTT-3′(意义)和5′-ACAATACAACGGTTCAGGTGAGT-3′(反义)。如我们之前所述执行实时PCR研究[6]。基因的相对表达治疗组是对照组的值归一化。

2.7。免疫印迹分析

IPEC-2细胞(1×10⁶细胞每收集6-well板)和全细胞溶解产物里帕也准备了缓冲含有蛋白酶抑制剂或磷酸酶抑制剂(美国热科学,罗克福德,IL)。核溶解产物是准备使用核/胞质分离设备(BestBio、上海、中国),根据制造商的协议。然后他们被离心机在4°C 12000×g 10分钟,和收集上层清液的化验。蛋白质浓度测定用标准BCA蛋白质分析,和30μg蛋白是加载/样本/车道和sds - page分离。蛋白质样本然后electrophoretically转移到硝化纤维膜,被封锁在TBST(5%脱脂牛奶,10毫米三,150毫米氯化钠,和0.05% Tween-20) 2 h。这些墨迹被孵化的以下主要抗体在一夜之间在4°C: anti-Nrf2 (1: 1000), anti-Keap1 (1: 1000), anti-GCLM (1: 1000), anti-GCLC (1: 1000), anti-SOD1 (1: 1000), anti-PCNA(1: 5000),和anti-actin (1: 1000)。三洗后Tris-buffered盐水含0.1%渐变20,屁股被孵化HRP-conjugated二级抗体,anti-rabbit免疫球蛋白g(1: 15000),或anti-mouse免疫球蛋白g (1: 15000), 2 h,然后又洗了。化学发光检测执行使用ECL试剂(热科学)根据制造商的指示。特定波段检测、分析和量化的图像J软件(贝塞斯达国立卫生研究院,医学博士,美国)。

2.8。细胞内谷胱甘肽和SOD1测量

对于这些化验,IPEC-J2细胞数量在1×10进行优化⁶每在6-well板。细胞被洗两次冷PBS和收获5%使用细胞刮刀偏磷酸。冰收获细胞被声波降解法细胞溶解,离心液的上层清液在4°C g(1300×15分钟)收集。使用谷胱甘肽测定谷胱甘肽水平测量colorimetrically工具包(南京建成生物工程研究所)根据制造商的协议和规范化溶菌产物的蛋白质浓度。这个分析是基于光度法测量5、5′-dithiobis (2-nitrobenzoic酸)(DTNB)与谷胱甘肽反应的产物。黄导5′-thio-2-nitrobenzoic酸(TNB)被检测吸光度测量使用标在412海里。SOD1活动是由测量抑制减少水溶性四唑盐,WST-8 (2 - (2-methoxy-4-nitrophenyl) 3 - 5 (4-nitrophenyl) - (2, 4-disulfophenyl) 2 h-tetrazolium,味精盐),产生一种水溶性甲瓒染料在减少。决定进行一个超氧化物歧化酶试验设备(Beyotime生物科技、上海、中国)特定于SOD1。

2.9。Nrf2免疫荧光

IPEC-J2细胞(1×10⁵每口井)被播种在直径的玻璃盖玻片涂poly-L-lysine 6-well板。细胞培养有或没有10μ克/毫升OEO 24 h。洗后用冷PBS为三次,细胞与4%多聚甲醛固定15分钟,permeabilized Triton x - 100(0.1%) 15分钟,阻塞和牛血清白蛋白(1%)为30分钟。一夜之间,与PBS洗后,细胞被孵化与Nrf2抗体稀释1:100年在4°C,其次是孵化Alexa萤石568 -共轭二次抗体1 h。核区域DAPI染色进行定义。荧光图像被激光扫描共焦显微镜(Eclipse TI,尼康、东京、日本)。

2.10。荧光素酶报告实验

抗氧化反应元素(是)荧光素酶报告质粒(pGL6 (pARE-luc))是获得Beyotime生物技术。IPEC-J2细胞被镀成6-well板块(1×10⁵/)和细胞培养24小时。细胞被cotransfected 0.5μ克的荧光素酶表达质粒和1μ克PRL-TK质粒(美国麦迪逊Promega)作为转染效率的标准化参考使用SuperFect转染试剂(美国试剂盒,瓦伦西亚,CA) 24小时,然后用OEO刺激12 h。细胞被收获,萤火虫和Renilla测定荧光素酶活动使用Dual-Luciferase记者分析系统(Progema)。比率(记者/控制荧光素酶活性)从控制细胞溶解产物被设定为一个。

2.11。核在IPEC-J2细胞转染

小干扰rna 5′双链猪Nrf2 -GCCCAUUGAUCUCUCUGAUTT-3′(意义)和5′-AUCAGAGAGAUCAAUGGGCTT-3′(反义)合成了GenePharma有限公司(上海,中国)。IPEC-J2细胞被镀成6-well板块(1×10⁵/)和细胞培养24小时。细胞转染100 nM siRNA Nrf2或炒双使用LipofectAMINE 2000(表达载体)。24小时孵化后,新鲜的细胞培养中添加和另一个OEO治疗前24小时。

2.12。统计分析

使用棱镜进行统计分析软件(Prism 5.0;美国GraphPad软件,拉霍亚,CA)。学生的数据进行了分析以及,Student-Newman-Keuls多重比较测试,或双向方差分析使用SAS 8.2 v (SAS本月。Inc .,卡里,数控,美国)。学生的以及用于比较两组,Student-Newman-Keuls多重比较测试是用于比较组间,和小干扰rna被用作OEO浓度和Nrf2因素在双向方差分析。值作为意味着±标准平均误差(SEM),和那些被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。预防OEO对氧化应激的影响在IPEC-J2细胞毒性

OEO的细胞毒性效应对IPEC-J2细胞MTT试验进行评估。可行的细胞的百分比与控制的细胞。细胞治疗OEO的浓度从1.25到80μg / mL为3、6、12或24 h,澄清曝光时间的作用。低剂量的OEO (1.25 -10μg / mL)没有造成细胞毒性效应在任何暴露的持续时间。OEO剂量的20 - 80μg / mL 24 h显著降低细胞生存能力而未经处理的控制细胞(图1(一))。基于这些细胞生存能力数据,后续实验研究使用OEO浓度≤10μ克/毫升。细胞治疗浓度的H₂O₂从0.2到1.2毫米为3、6、12、24小时澄清曝光时间的作用。结果细胞暴露在H₂O₂如图1 (b)。细胞治疗的可行性与0.8毫米H₂O₂24 h是大约70%的控制细胞。因此,用0.8毫米治疗H₂O₂24小时被选为后续实验。

预处理与OEO IPEC-J2细胞显著提高细胞生存能力的H₂O₂剂量依赖性的方式(图1 (c))。为了进一步探索OEO的保护作用,LDH的释放,细胞损伤的指标,还研究了在H₂O₂暴露IPEC-J2细胞。结果表明,预处理与OEO减毒的H₂O₂增加全身的LDH,肯定其保护作用(图1 (d))。

3.2。OEO抑制氧化应激在IPEC-J2细胞ROS、MDA生产

H₂O₂全身的细胞内ROS生产IPEC-J2使用DCFH细胞是由荧光显微镜分析监控₂- da荧光探针。IPEC-J2细胞暴露于H₂O₂(0.8毫米)的24小时显示,荧光显著增加,这是比例的ROS生成(图2(一个))。这种活性氧诱导显著抑制了OEO预处理(2.5 -10μg / mL)(图2 (b))。ROS水平也以IPEC-J2细胞的上清液通过使用鲁米诺化学发光测定探针。预处理IPEC-J2 OEO抑制ROS水平细胞上清液的H₂O₂剂量依赖性的方式(图2 (c))。因此,在IPEC-J2 OEO细胞的保护作用抑制过多的活性氧产量进一步证明了这一点。

MDA是lipoperoxidation的最终产品,被认为是一个很好的指标,氧化应激(18]。调查OEO的影响在培养细胞脂质过氧化IPEC-J2细胞,MDA水平测量使用TBARS测定IPEC-J2细胞。如图2 (d)IPEC-J2细胞明显增加,MDA含量在H₂O₂与对照组相比,而预处理OEO显著剂量依赖性地抑制脂质过氧化作用。

3.3。OEO Nrf2-Regulated增加抗氧化酶的表达

我们预测OEO对抗氧化应激的保护作用发生在抗氧化基因的诱导的结果。抗氧化剂SOD1基因的表达,过氧化氢酶(CAT)、GCLM, GCLC在不同条件下进行了分析。IPEC-J2细胞治疗10μg / mL OEO的3、6、12、24小时。SOD1 OEO引起了极大增加,猫,GCLM, GCLC mRNA表达水平在12 h(数字3(一个),3 (b),3 (c),3 (d))。治疗OEO 2.5 -10μg / mL 12 h GCLM剂量依赖性增加,GCLC和SOD1 mRNA表达水平(数字3 (e),3 (f),3 (g),3 (h)),预处理和10μg / mL猫OEO调节基因表达的1.24倍,相比:组。GCLM OEO也剂量依赖性增加细胞内蛋白质浓度,GCLC, SOD1(图3(我))和增加细胞内谷胱甘肽(图3 (j))和SOD1(图3 (k)蛋白质浓度剂量依赖性的方式。

3.4。激活Nrf2 OEO

Nrf2是一个主要的转录因子参与细胞抵抗氧化应激通过受诱导抗氧化酶(19]。如图4(一)、治疗与OEO 2.5 -10μg / mL 12 h剂量依赖性增加Nrf2 mRNA表达水平。西方墨迹证明OEO孵化(2.5 -10μg / mL) 24 h增加Nrf2比Keap1 semi-dose-dependent方式(图4 (b))。调查OEO-mediated Nrf2核易位,胞质及核Nrf2蛋白质的数量确定各自的分数IPEC-J2细胞。结果表明增加核Nrf2和减少胞质Nrf2 10μ克/毫升OEO(图4 (c))。为进一步确认,核进口Nrf2控制和治疗细胞被免疫荧光检测。如图4 (d),Nrf2位于控制细胞的细胞质,但核Nrf2 OEO治疗后增加的数量(10μg / mL)。评估的参与在OEO-induced Nrf2活动,IPEC-J2细胞转染Nrf2表达质粒和OEO增强的激活是剂量依赖性的方式(图4 (e))。

3.5。抗氧化剂OEO依赖Nrf2基因诱导

Nrf2被Nrf2 siRNA治疗表达下调,如图5(一个)和5 (b)。治疗Nrf2 siRNA大约Nrf2 mRNA表达和蛋白表达减少了53%和47%,分别。Nrf2表达式的增加、SOD1 GCLM, GCLC OEO造成的信使rna (2.5 -10μ小干扰rna (g / mL)被Nrf2抑制数字5 (c),5 (d),5 (e),5 (f))。如图5 (g),Nrf2 siRNA减少基线Nrf2蛋白质以及OEO-induced Nrf2蛋白质。这一发现伴随着更大的减少OEO-induced (10μSOD1, g / mL) Nrf2 GCLM, GCLC蛋白质表达水平(图5 (h))。同样,Nrf2 siRNA也降低了细胞内的谷胱甘肽和SOD1引起OEO(数字5(我)和5 (j))。然而,值得注意的是,治疗OEO GCLM仍然增加,GCLC, Nrf2 mRNA表达水平和细胞内谷胱甘肽的条件下Nrf2抑制(数字5 (c),5 (d),5 (e),5(我))。

3.6。Cytoprotection OEO依赖Nrf2对抗氧化应激

Nrf2的作用对H OEO的抗氧化效果₂O₂全身的细胞毒性研究Nrf2击倒IPEC-J2细胞。OEO (10μg / mL)抑制H₂O₂全身的细胞毒性细胞治疗控制核,但Nrf2击倒的保护作用是减少细胞(图6(一))。此外,减少细胞内ROS引起OEO Nrf2的被击倒的抑制(图6 (b)),这表明这由Nrf2 OEO的抗氧化作用。

4所示。讨论

胃肠道容易活性氧的攻击,因为它是由实体访问从外部环境、居民免疫细胞和肠道菌群以及饮食因素的潜在来源ROS (2]。氧化应激被广泛涉及体内肠道损伤两种(20.,21)和体外条件(22,23]。最近的研究表明,OEO减少氧化应激和增加抗氧化酶在动物的肠子5,7]。此外,在我们实验室之前的研究,我们发现OEO增加抗氧化酶表达和降低ROS水平氧化应激大鼠的肠道模型(6]。然而,OEO提高抗氧化状态的详细分子机制是未知的。阐明这些抗氧化效应产生机制,我们评估OEO的影响抗氧化酶和分子在猪IPEC-J2肠道上皮细胞。本研究中使用的OEO含有挥发性,自然的,复杂的化合物的特点是强烈的气味,由牛至属植物vulgareL为次生代谢物。OEO的主要组件是百里香酚和香芹酚,而他们的生物起源的前体,ρ甲基异丙基苯和γ萜品烯,是最丰富的单萜(表1)。重要的是,OEO浓度(2.5 -10μg / mL)本研究中使用的是noncytotoxic和非常低的。良好的药理性质OEO在几项研究已经证明同样低浓度。例如,治疗氧化低密度lipoprotein-activated THP-1巨噬细胞与OEO (10 - 30μg / mL)结果在整体减少促炎细胞因子释放24]。同样,抗氧化的影响OEO组件百里香酚和香芹酚(8 - 30μg / mL)证实了Caco-2细胞(25]。据我们所知,本研究首次证明OEO增加抗氧化酶表达水平,防止氧化应激通过激活Nrf2细胞死亡。

H₂O₂通常用于redox-regulated过程的研究,因为它是与其他活性氧(相比相对稳定26]。众所周知,暴露在H₂O₂触发器的快速生成活性氧在不同细胞类型(27- - - - - -29日),包括IPEC-J2细胞(23]。活性氧积累和损伤的抗氧化防御系统的H₂O₂导致细胞氧化损伤(30.]。在目前的研究中,IPEC-J2细胞治疗H₂O₂经历了一次剂量和时间损失的细胞生存能力。然而,预处理细胞OEO在适当的浓度(2.5、5或10μg / mL)显著降低这个损失的细胞生存能力,维持在LDH释放衰减。此外,细胞预处理OEO抑制H₂O₂全身的ROS、MDA生产,按照氧化应激的抑制作用。这抑制H₂O₂全身的ROS生成和细胞脂质过氧化作用通过预处理OEO可能发生通过直接通过自由自由基清除活性抗氧化机制。多酚类化合物如OEO起到广泛的抗氧化作用,充当ROS拾荒者和自由基反应终止剂31日,32]。预处理的细胞培养IPEC-J2 OEO也显著增加,恢复细胞内谷胱甘肽和SOD1水平,可能由于对H OEO的抗氧化作用₂O₂全身的氧化损伤。

防止ROS的有害影响,猫和SOD等抗氧化酶解毒ROS安全分子(33]。SOD能防止氧化应激通过催化超氧化物阴离子H₂O₂猫和进一步降低氧化还原催化降低H的影响₂O₂(34]。因此,增加SOD和CAT的表达式可能防止氧化应激。三肽谷胱甘肽(γ-L-Glu-L-Cys-Gly)是最丰富的细胞内非蛋白巯基化合物在哺乳动物细胞(35]。重要的是,谷胱甘肽作为一种抗氧化剂清除有害自由基的重要作用[36]。因此,内源性谷胱甘肽是消耗在氧化应激,导致损耗的细胞谷胱甘肽(37]。谷胱甘肽包含一个不同寻常的之间的肽键γ羧基谷氨酸和α半胱氨酸的氨基酸组(38]。的形成γ-glutamylcysteine谷胱甘肽合成的第一步。催化了GCL, heterodimeric蛋白质组成的催化(GCLC)和修饰符(GCLM)子单元,由独立的编码基因在哺乳动物39]。GCLC展品的催化活性,但其与GCLM改变其动力学特性来增强GCL活动(40]。甘氨酸随后添加到c-glutamylcysteine在第二个反应是催化谷胱甘肽合成酶形成谷胱甘肽(38]。

近年来,一些研究报道,植物的化合物激活Nrf2-dependent活动,提升细胞的水平猫,SOD1,谷胱甘肽,展览cytoprotective效应对氧化应激在各种细胞(30.,41]。Nrf2的作用中扮演着重要角色在氧化应激的适应性反应和调节驱动抗氧化基因表达(包括编码SOD1,猫,GCLC GCLM) (42]。体内平衡的条件下,Nrf2保留细胞溶质,绑定到一个集群的蛋白质,包括其胞质抑制剂,Keap1 [43,44]。刺激的时候,Keap1分离和移动到原子核结合抗氧化基因的转录调节(45]。这里,当我们与OEO IPEC-J2预处理细胞,Nrf2 Keap1抑制蛋白质的分离和转移到细胞核核Nrf2所表示的一个戏剧性的增加。积累核Nrf2已被证实能绑定到,导致抗氧化基因的转录激活(46]。我们的研究结果进一步证实了这些分子级联报告增加活动IPEC-J2 OEO处理细胞。激活Nrf2调节重要细胞抗氧化基因已被证明,包括SOD1,猫,GCLC, GCLM,保护细胞免受氧化损伤。这些数据与先前的观察是一致的,植物提取物(包括那些来自柳树皮、银杏、莲属椰子树叶,胡椒科树叶,和葡萄果渣)增加细胞抗氧化剂通过增加水平的核Nrf2基因表达(30.,42,47- - - - - -49]。击倒的Nrf2核抑制不仅OEO-induced这些抗氧化酶的表达,而且还对氧化应激的保护作用在IPEC-J2细胞细胞损伤。在这项研究中,虽然GCLM的增加,GCLC, Nrf2 mRNA表达水平和细胞内谷胱甘肽Nrf2 siRNA OEO明显抑制,造成治疗OEO GCLM仍然增加,GCLC, Nrf2 mRNA表达水平和细胞内谷胱甘肽的条件下Nrf2抑制。然而,siRNAs抑制Nrf2的效率相对较低,Nrf2基因表达的差别只有53%对这些基因的差别,47%的人对这些蛋白质丰度。或者,它已经表明,forkhead框O (FOXO)家族的转录因子,肿瘤抑制基因p53,激活蛋白1 (AP-1)也有重大作用在防止氧化应激诱导抗氧化基因表达(50- - - - - -52]。因此,Nrf2调节氧化应激可能并不是唯一因素,和OEO调节氧化应激可能通过一个或多个不同的通路。

5。结论

总之,这项研究提供的证据OEO的参与防止IPEC-J2细胞氧化应激和阐发一些潜在机制。治疗IPEC-J2细胞OEO增强SOD1和谷胱甘肽表达通过激活Nrf2 /通路。这种机制可能是其抗氧化的关键行动H₂O₂全身的细胞损伤。ROS是至关重要的因素在许多胃肠道疾病的发病机制。我们的数据支持需要进一步研究OEO Nrf2激活和内源性抗氧化反应作为这些疾病的潜在治疗方法。OEO可能确实有广泛的适用性为氧化应激相关治疗肠道疾病。

相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

确认

本研究支持资金由中国国际科技合作项目(批准号2013 dfg32510)和湖北省的关键技术研究与开发项目(2014 abb014和2014 abc012号)。作者感谢同事们有益的讨论。

补充材料

引用

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